柔肝固腸方改善慢性酒精性肝損傷大鼠腸道通透性的機(jī)制研究

姚東升 胡義揚(yáng) 傅琪琳 顧宏圖 徐 琳 王文靜 彭景華 趙 瑜 馮 琴

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所，上海高校中醫(yī)內(nèi)科學(xué)E-研究院，肝腎疾病病證實(shí)驗(yàn)室，上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海，201203)

柔肝固腸方改善慢性酒精性肝損傷大鼠腸道通透性的機(jī)制研究

姚東升 胡義揚(yáng) 傅琪琳 顧宏圖 徐 琳 王文靜 彭景華 趙 瑜 馮 琴

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所，上海高校中醫(yī)內(nèi)科學(xué)E-研究院，肝腎疾病病證實(shí)驗(yàn)室，上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海，201203)

目的：從腸道緊密連接及黏附連接角度探討柔肝固腸方改善慢性酒精性肝損傷大鼠腸道通透性的作用機(jī)制。方法：Lieber-DeCarli酒精液體飼料飼養(yǎng)6周誘導(dǎo)大鼠慢性酒精性肝損傷模型。30只SD雄性大鼠，隨機(jī)分無酒精液體飼料對照組(對照組，n=10)和酒精液體飼料造模組(n=20)，造模第4周將造模組大鼠隨機(jī)分模型組(n=10)，柔肝固腸方組(n=10)，并開始灌胃給柔肝固腸方或蒸餾水直至6周末，取材前3.5 h各組以10 mg/ kg的內(nèi)毒素(LPS)灌胃。取材后檢測：1)血清AST、ALT活性變化；2)通過門脈血漿內(nèi)毒素含量測定判斷小腸通透性變化；3)小腸組織電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察；4)小腸緊密連接蛋白ZO-1、Occludin蛋白與mRNA表達(dá)變化；5)小腸黏附連接蛋白β-Catenin和E-Cadherin蛋白表達(dá)。結(jié)果：1)柔肝固腸方可顯著降低模型大鼠顯著升高的AST水平(P<0.05)；2)柔肝固腸方可降低模型大鼠顯著升高的小腸通透性，柔肝固腸方組血漿內(nèi)毒素含量顯著低于模型組；3)電鏡結(jié)果顯示柔肝固腸方可顯著改善Lieber-DeCarli酒精飼料喂養(yǎng)大鼠小腸黏膜表面微絨毛局灶性減少、變短、稀疏，排列不規(guī)則，同微絨毛相連的細(xì)胞終末網(wǎng)變性模糊等病理改變；4)柔肝固腸方可顯著升高酒精飼料喂養(yǎng)肝損傷大鼠小腸組織緊密連接蛋白ZO-1、Occludin蛋白與mRNA表達(dá)及黏附連接蛋白β-Catenin和E-Cadherin蛋白表達(dá)。結(jié)論：柔肝固腸方通過改善腸上皮緊密連接及黏附連接改善慢性酒精性肝損傷大鼠腸道通透性改變。

酒精性肝損傷；柔肝固腸方；腸道通透性；緊密連接；黏附連接

酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease，ALD)是由于長期大量飲酒所導(dǎo)致的肝臟疾病。近些年來，研究證實(shí)腸道屏障功能障礙與酒精性肝損傷關(guān)系密切，酒精所致腸道通透性改變血中內(nèi)毒素升高是形成酒精性肝病“二次攻擊”理論的核心要素之一[1-2]。改善酒精所致的腸道屏障損傷，減少腸源性內(nèi)毒素入血，為治療ALD的重要和有效途徑。

“飲食所傷”是酒精性肝病中醫(yī)學(xué)重要的病因?qū)W說之一，調(diào)理脾胃運(yùn)化功能是中醫(yī)藥治療酒精性肝病的主要治法治則[3]。筆者所在研究所根據(jù)健脾活血立法創(chuàng)立的由白術(shù)、茯苓、白芍、澤瀉等組成的“健脾活血方”臨床治療酒精性肝損傷療效顯著，近10多年來系列研究證實(shí)其通過改善腸道通透性、抗內(nèi)毒素二次攻擊以及抗脂質(zhì)過氧化等多途徑發(fā)揮抗酒精誘導(dǎo)的大鼠肝損傷的作用[4-6]。前期研究提示白芍、五味子及澤瀉三味藥(命名為“柔肝固腸方”)是健脾活血方8味中藥中改善小腸通透性改變的主效應(yīng)中藥組合[7]。本研究采用Lieber-Decarli酒精飲料誘導(dǎo)的大鼠酒精性損傷模型，從腸道緊密連接及黏附連接角度探討柔肝固腸方改善慢性酒精性肝損傷大鼠腸道通透性的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 SD雄性大鼠，SPF級(jí)，體重130～160 g，30只，合格證號(hào)SCKC-滬-2008-0016，購自上海必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。特制籠具單籠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。特制Richter飼料瓶(負(fù)壓飼料瓶)予大鼠自動(dòng)飲用液體飼料。

1.2 藥物 柔肝固腸方由白芍、五味子、澤瀉組成。五味子加70%乙醇提取2次，過濾，回收乙醇；澤瀉、白芍分別水提，濾液冷藏備用，臨用前將三種藥混合配成懸濁液。給藥時(shí)配制成10 mL/kg鼠重的灌胃液。中藥購自上海華宇藥業(yè)有限公司，上海中醫(yī)藥大學(xué)科技中心制備。

1.3 試劑 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine Aminotransferase，ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate Aminotransferase，AST)測定試劑盒購自南京建成生物制品研究所；內(nèi)毒素檢測試劑盒(貨號(hào)21080309C/BU0209)購自美國ACC公司；ZO-1多克隆抗體(貨號(hào)SC-10804)、E-cadherin(貨號(hào)sc-7870)，購自santacruz公司；Occludin多克隆抗體(貨號(hào)ab31721)，購自abcam公司；a-tublin多克隆抗體(貨號(hào)2251-1)，購自EPITOMICS公司。β-Catenin抗體(貨號(hào)9582S)，購自CST公司；柱式小量總RNA抽提試劑盒，購自上海華舜生物工程有限公司；cDNA合成試劑盒，購自Fermentas公司；引物由TAKARA公司設(shè)計(jì)、上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。熒光定量PCR試劑盒，購自TAKARA公司產(chǎn)品；引物序列及片段長度如下(表1)。

表1 引物序列及片段長度

2 方法

2.1 模型制備 Lieber-DeCarli酒精性大鼠肝損傷模型制備及取材方法，參照本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[4]。

2.2 分組與給藥 大鼠30只，隨機(jī)分無酒精液體飼料對照組(對照組，n=10)和酒精液體飼料造模組(造模組，n=20)，造模第4周將造模大鼠隨機(jī)分模型組(n=10)，柔肝固腸方組(n=10)，柔肝固腸方組在給予酒精飼料的同時(shí)，灌胃給予1 mL/100 g體重藥物，1次/d，模型組、對照組按相同標(biāo)準(zhǔn)灌胃給予飲用水。

2.3 觀察指標(biāo)及方法 1)血清AST、ALT活性，賴氏法。2)小腸通透性通過門靜脈血漿內(nèi)毒素含量檢測判定(鱟試劑法)。3)小腸組織電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察。4)小腸緊密連接蛋白ZO-1及Occludin蛋白及mRNA表達(dá)變化，Western Blotting(WB)和Real-time PCR(RT-PCR)方法。5)小腸黏附連接蛋白β-Catenin和E-Cadherin蛋白表達(dá)，WB方法。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠死亡情況、進(jìn)食量、體重變化 造模開始及結(jié)束時(shí)各組大鼠體重均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)；在造模過程中各組大鼠進(jìn)食量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)，其所攝入的乙醇量和熱卡也大致相等，排除了飲食及乙醇量的差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；造模第6周柔肝固腸方組有1只大鼠因灌胃不當(dāng)意外死亡。

表2 各組大鼠體重及進(jìn)食量±s)

3.2 柔肝固腸方對慢性酒精性肝損傷大鼠血清AST、ALT的影響 與對照組相比，模型組血清ALT、AST活性顯著升高；與模型組相比，柔肝固腸方組能顯著降低血清AST活性。(見表3)。

表3 各組大鼠血清ALT、AST含量

注：**P<0.01，*P<0.05，vs對照組；##P<0.01，vs模型組。

3.3 柔肝固腸方對慢性酒精性肝損傷大鼠腸道通透性(門靜脈血漿內(nèi)毒素含量)的影響 模型組大鼠門靜脈血漿內(nèi)毒素含量較對照組組明顯升高(P<0.05)，柔肝固腸方組門靜脈血漿內(nèi)毒素含量有顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)

表4 各組大鼠門靜脈血漿內(nèi)毒素含量±s)

注：*P<0.05，vs對照組；##P<0.01，#P<0.05，vs模型組。

3.4 柔肝固腸方對慢性酒精性肝損傷大鼠小腸組織超微結(jié)構(gòu)的影響 對照組小腸黏膜超微結(jié)構(gòu)未見明顯改變。模型組大鼠小腸黏膜表面微絨毛局灶性減少、變短、稀疏，排列不規(guī)則。同微絨毛相連的細(xì)胞終末網(wǎng)變性模糊。柔肝固腸方小腸黏膜表面上皮細(xì)胞間各種連接結(jié)構(gòu)較為清晰，微絨毛局灶性稀疏、減少等有所改善，上皮細(xì)胞變性程度輕微。(圖1)

圖1 小腸電鏡超微結(jié)構(gòu)變化(11500倍)

注：N對照組，M模型組，R柔肝固腸方組。

3.5 柔肝固腸方對對慢性酒精性肝損傷大鼠小腸緊密連接蛋白ZO-1、Occludin蛋白及mRNA表達(dá)的影響 與對照組相比，模型組小腸ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)顯著降低；柔肝固腸方組ZO-1蛋白表達(dá)較模型組均顯著升高。(圖2)

與對照組相比，模型組小腸組織ZO-1mRNA表達(dá)無顯著變化，Occludin mRNA表達(dá)顯著降低，柔肝固腸方組ZO-1、OccludinmRNA表達(dá)均顯著升高。(表5)

圖2 各組小腸ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)情況

注：N：對照組，M：模型組，R：柔肝固腸方組。

表5 各組大鼠小腸組織ZO-1、Occludin mRNA表達(dá)

注：**P<0.01，vs對照組；##P<0.01，#P<0.05，vs模型組。

3.6 柔肝固腸方對小腸黏附連接蛋白β-Catenin、E-Catenin影響 與對照組相比，模型組小腸β-Catenin、E-Catenin蛋白表達(dá)均顯著降低；柔肝固腸方組較模型組均顯著升高。(圖3)

圖3 各組小腸β-Catenin、E-Catenin蛋白表達(dá)情況

注：N：對照組，M：模型組，R：柔肝固腸方組

4 討論

ALD發(fā)病原因明確，為過量攝入乙醇所致。乙醇所致血中內(nèi)毒素升高是形成酒精性肝病(ALD)“二次攻擊”理論的要素之一。乙醇導(dǎo)致腸道黏膜屏障的破壞，形成腸滲漏被認(rèn)為是乙醇誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥的主要原因，因此通過改善腸道屏障功能抑制內(nèi)毒素升高是ALD治療學(xué)上的重要策略[2]。

柔肝固腸方是臨床治療ALD有效經(jīng)驗(yàn)方健脾活血方中改善小腸通透性改變的主效應(yīng)中藥組合[7]，研究證實(shí)其可減輕酒精性肝損傷，且其改善小腸通透性有優(yōu)于健脾活血方的趨勢。但其通過何種機(jī)制改善腸道屏障功能尚不明了，有必要進(jìn)一步深入研究。

腸道屏障功能是指能防止腸腔內(nèi)有害物質(zhì)如細(xì)菌及毒素等穿過腸黏膜進(jìn)入體內(nèi)其他組織器官和血液循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能，主要由腸道黏膜的機(jī)械屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障和生物屏障四部分組成[8]。機(jī)械屏障是其中最重要的部分，小腸上皮機(jī)械屏障功能主要由上皮細(xì)胞細(xì)胞間連接復(fù)合物包括緊密連接和黏附連接提供[9]。其中緊密連接是調(diào)節(jié)細(xì)胞間通透性的細(xì)胞間連接復(fù)合物中最重要的組分，是防御異物入血的第一道防線[10]。緊密連接[10-11]是由超過50種蛋白質(zhì)組成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的復(fù)合體，通過連接與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)連接的復(fù)合物蛋白構(gòu)成緊密連接復(fù)合物來吻合封閉細(xì)胞間隙。緊密連接胞內(nèi)蛋白主要是ZO-1蛋白，其起到橋梁的作用。一方面，ZO-1自身的C末端同肌動(dòng)蛋白骨架系統(tǒng)相連接，另一方面，ZO-1通過鳥苷酸激酶樣(GUK)結(jié)構(gòu)域的保守序列，與緊密連接的跨膜蛋白蛋白如Occludins蛋白的C末端連接。最終，將Occludin蛋白和肌動(dòng)蛋白骨架系統(tǒng)連接在一起，構(gòu)成穩(wěn)定的連接系統(tǒng)。Occludin蛋白是主要集中于緊密連接纖維內(nèi)相對分子質(zhì)量約為65 000的Ⅱ型跨膜蛋白，其蛋白的胞外環(huán)型結(jié)構(gòu)及跨膜結(jié)構(gòu)主要參與腸壁通透性的調(diào)節(jié)。緊密連接蛋白的破壞會(huì)導(dǎo)致腸道通透性增高，使大分子物質(zhì)，如內(nèi)毒素、病原體等從腸腔進(jìn)入血液。黏附連接[12]為腸道機(jī)械屏障的另一重要組成部分。一般于上皮細(xì)胞頂側(cè)面的緊密連接下方形成粘合帶(Adhesion Belt)。在粘合帶處相鄰細(xì)胞的間隙約15～20 nm。間隙中的粘合分子為E-鈣粘蛋白(E-cadherin)。粘合帶處的質(zhì)膜下方有與質(zhì)膜平行排列的肌動(dòng)蛋白束，鈣粘蛋白通過附著β-連鎖蛋白(β-catenin)等連鎖蛋白、粘著斑蛋白(Vinculin)、α-輔肌動(dòng)蛋白(α-actinin)和片珠蛋白(Plakoslobin)與肌動(dòng)蛋白束相結(jié)合。于是，相鄰細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白絲束通過鈣粘蛋白和附著蛋白編織成了一個(gè)廣泛的網(wǎng)絡(luò)，把相鄰細(xì)胞聯(lián)合在一起。近來研究發(fā)現(xiàn)乙醇代謝產(chǎn)物乙醛可通過介導(dǎo)E-cadherin與β-catenin的酪氨酸磷酸化而且破壞黏附連接蛋白。

本研究運(yùn)用Lieber-Decarli酒精飼料喂養(yǎng)大鼠6周誘導(dǎo)慢性酒精性肝損傷模型，并參照文獻(xiàn)方法[5]，于動(dòng)物處死前3.5 h給予內(nèi)毒素灌胃，取材后測定門靜脈血漿血內(nèi)毒素含量以評價(jià)腸道通透性。結(jié)果顯示模型大鼠門靜脈血漿內(nèi)毒素含量較無酒精飼料對照大鼠顯著升高，說明該模型中腸滲漏發(fā)生，存在腸道屏障受損。小腸組織電鏡超微結(jié)構(gòu)也顯示酒精飼料喂養(yǎng)大鼠出現(xiàn)小腸黏膜表面微絨毛局灶性減少、變短、稀疏，排列不規(guī)則，同微絨毛相連的細(xì)胞終末網(wǎng)變性模糊等病理改變。同時(shí)，WB研究結(jié)果顯示模型大鼠小腸組織緊密連接蛋白ZO-1、Occludin及黏附連接蛋白β-Catenin、E-cadherin蛋白表達(dá)均顯著低于無酒精飼料對照大鼠，提示小腸上皮緊密連接與黏附連接的破壞是該慢性酒精性肝損傷模型腸道通透性升高的主要原因。經(jīng)中藥柔肝固腸方治療后，模型大鼠血清AST顯著降低同時(shí)伴有腸道通透性關(guān)鍵指標(biāo)——血漿門靜脈內(nèi)毒素含量的顯著降低及小腸黏膜超微結(jié)構(gòu)的好轉(zhuǎn)，提示改善腸通透性抑制內(nèi)毒素血癥是該方有效治療酒精性肝損傷的重要機(jī)制之一。進(jìn)一步檢測該方對小腸上皮緊密連接與黏附連接關(guān)鍵蛋白的影響，結(jié)果顯示無論緊密連接蛋白ZO-1、Occludin還是黏附連接蛋白β-Catenin、E-cadherin經(jīng)過柔肝固腸方治療后蛋白表達(dá)均較模型組顯著升高，提示緩解慢性酒精攝入導(dǎo)致的腸上皮細(xì)胞緊密連接及黏附連接破壞是該方修復(fù)腸道黏膜機(jī)械屏障、改善腸道通透性的主要機(jī)制。

綜上所述，柔肝固腸方可通過修復(fù)腸上皮細(xì)胞緊密連接及黏附連接而改善酒精性腸道通透性改變起到防治ALD的作用。這為該方臨床運(yùn)用與新藥開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)同時(shí)，也為從“肝-腸軸”角度開展中醫(yī)藥防治酒精性肝病的研究提供可借鑒的思路與方法。

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(2014-12-26收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Mechanism research of Rouganguchang Decoction on improving intestinal permeability changes of rats with ethanol-induced liver injury

Yao Dongsheng, Hu Yiyang, Fu Qilin, Gu Hongtu, Xu Lin, Wang Wenjing, Peng Jinghua， Zhao Yu, Feng Qin

(InstituteofLiverDiseases,ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicinet,Shanghai201203,China)

Objective:From the intestinal tight junction and adherens junction pathway to explore mechanism research of Rouganguchang Decoction on improving chronic alcoholic liver injury and intestinal permeability changes. Methods: The rats were given Lieber-Decarli liquid diet daily for 6 weeks to duplicate the alcoholic liver injury model. Thirty male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into control liquid diet, control group (control group, n = 10) and ethanol liquid diet model group (n = 20). Model rats were randomly divided into the model group (n = 10), Rouganguchang Decoction group (n = 10) the fourth weeks. The rats were given decoction or distilled water from the fourth week to the sixth weekend. Each rat was given 10mg/kg endotoxin (LPS) by gavage 3.5h before being sacrificed. The following indexes were detected: 1)The ALT、AST activity of serum were detected by biochemical method; 2)LPS content in the portal blood was detected by biochemical method; 3)Pathological changes in intestinal tissues were observed by electron microscope; 4)The protein and mRNA expresses of ZO-1 and Occludin were detected by Western blotting and real-time PCR respectively; 5)The protein of beta-Catenin and E-Cadherin were detected by Western blotting. Results:1) Compared with that of the model group rats, the activity of AST in drug group decreased significantly (P<0.05); 2) The plasma endotoxin levels of Rouganguchang Decoction decreased significantly compared with that of the model group rats; 3) Rouganguchang Decoction could improve the intestinal mucosa connection structure of the surface epithelial cells of model rats; 4) Compared with those of the model group rats, the protein and mRNA expressions of ZO-1 and occludin, as well as the protein expressions of beta-Catenin and E-Cadherin all increased. Conclusion: Rouganguchang Decoction can significantly improve chronic alcoholic liver injury and intestinal permeability changes, the mechanism of that was related to protection of intestinal epithelial tight junctions and adhesion junctions.

Alcoholic liver injury; Rouganguchang Decoction; Intestinal permeability; Intestinal tight junctions; Intestinal adhesion junctions

國家自然基金青年基金項(xiàng)目(編號(hào)：30801536)；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)肝膽病重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目

R256.43

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.02.006