細(xì)胞永生化機(jī)制及不同細(xì)胞永生化方法研究進(jìn)展

黃今，楊融輝，馬海英

(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001)

·綜 述·

細(xì)胞永生化機(jī)制及不同細(xì)胞永生化方法研究進(jìn)展

黃今，楊融輝，馬海英

(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001)

永生化細(xì)胞是一種在理化刺激、基因突變、病毒感染等外界刺激下，可以在體外無限增殖的不衰老細(xì)胞株。細(xì)胞永生化機(jī)制有放射性因素、端粒-端粒酶激活、病毒基因轉(zhuǎn)染及抑癌基因受抑制等學(xué)說。作者在總結(jié)細(xì)胞永生化原理的基礎(chǔ)上闡述不同組織細(xì)胞永生化的技術(shù)方法及生長狀態(tài)。

細(xì)胞永生化； 體外培養(yǎng)； 端粒酶； 病毒； 癌基因； 文獻(xiàn)綜述

細(xì)胞永生化是指細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過程中，由于自身基因變化或者外界各種刺激因素，避免了正常細(xì)胞的衰老死亡過程，可以長期傳代培養(yǎng)、無限分裂增殖[1]。對細(xì)胞永生化發(fā)生機(jī)制的研究雖然已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但是不同細(xì)胞永生化的機(jī)制不盡相同。作者在總結(jié)細(xì)胞永生化基本機(jī)制的基礎(chǔ)上探討不同細(xì)胞永生化研究的進(jìn)展。

1 細(xì)胞永生化機(jī)制

衰老死亡是一種正常的不可逆的細(xì)胞生理過程，細(xì)胞在不斷增殖分裂的過程中會到達(dá)衰老期M1期和致死期M2期[2]，細(xì)胞會停止分裂并啟動凋亡程序。此時如果細(xì)胞在某些原因誘導(dǎo)下，恢復(fù)基因的穩(wěn)定性，則可以逃離衰老死亡的正常生理過程達(dá)到無限增值分裂的永生化狀態(tài)。

1.1 放射性因素

自1996年有學(xué)者在核彈輻射后的人體表面發(fā)現(xiàn)可以無限增殖的上皮細(xì)胞后，通過電離輻射、核輻射、X射線等照射使細(xì)胞得到永生化的方法相繼被成功研究出來[3]。通過對成功永生的細(xì)胞核型的分析，推測是由于放射性因素使細(xì)胞染色體重組，抑癌基因表達(dá)被抑制，促進(jìn)延長細(xì)胞壽命的基因表達(dá)，使端粒長度得以維持，細(xì)胞衰老程序無法穩(wěn)定進(jìn)行，細(xì)胞可以無限增殖分裂[4]。

1.2 端粒-端粒酶激活

端粒是存在于真核細(xì)胞內(nèi)染色體首尾末端，由簡單重復(fù)的DNA序列和周圍蛋白質(zhì)構(gòu)成的特有帽狀結(jié)構(gòu)，長度在5～15 bp，具有重要的生理功能，包括維持染色體結(jié)構(gòu)和位置的穩(wěn)定，防止染色體被化學(xué)酶降解，調(diào)節(jié)細(xì)胞正常功能和決定細(xì)胞壽命等[5]。端粒隨著細(xì)胞不斷分裂會持續(xù)丟失，到一定長度閾值后會啟動基因損傷檢測點(diǎn)，導(dǎo)致細(xì)胞停止分裂并走向衰老進(jìn)程[6]。因此，端粒的長度是評價細(xì)胞衰老的指標(biāo)之一。端粒酶是一種催化端粒自我復(fù)制，增加端粒長度的逆轉(zhuǎn)錄酶，同時也是調(diào)控細(xì)胞周期的重要生物因子。其功能是通過對自身RNA序列的轉(zhuǎn)錄形成新的端粒DNA序列，以補(bǔ)充縮短缺失的端粒，維持端粒的長度和細(xì)胞的無限分裂[7]。

正常細(xì)胞中活性端粒酶的水平很低并且受到細(xì)胞基因嚴(yán)格調(diào)控，在原代培養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，端粒酶陽性表達(dá)的細(xì)胞中人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的水平也很高。研究證明hTERT作為端粒酶的催化亞基，與相關(guān)蛋白結(jié)合可以激活端粒酶，延長體外細(xì)胞培養(yǎng)的生存周期，是端粒酶的正向調(diào)控因子[8]。因此，hTERT基因的表達(dá)激活是細(xì)胞永生化的重要步驟。

1.3 病毒基因轉(zhuǎn)染

現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)表明，將一些致瘤病毒如猴腎病毒SV40、EB病毒、乳頭狀皰疹病毒等轉(zhuǎn)化到人正常細(xì)胞內(nèi)，可以改變正常基因，使部分細(xì)胞成功渡過兩個致死期，得到無限增殖的能力，達(dá)到永生化的狀態(tài)[9]。

1.3.1SV40病毒 SV40病毒是一種由LT和st兩種抗原及相關(guān)蛋白組成的簡單真核病毒，由于其對細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)化、瘤化的高效性，目前已成為真核細(xì)胞生物工程實(shí)驗(yàn)的探針型實(shí)驗(yàn)工具[10]。SV40誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程涉及很多因素，過程非常復(fù)雜，其中LT片段對轉(zhuǎn)化的啟動起到?jīng)Q定性的作用[11]。將SV40病毒導(dǎo)入目的細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞抑癌基因p53和pRb會與LT抗原片段上相關(guān)結(jié)合區(qū)域結(jié)合，使抑癌基因失效無法表達(dá)，從而防止細(xì)胞分裂停滯，使其無限增殖并表現(xiàn)出多種與腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)化顯型[12]。

1.3.2EB病毒 EB病毒是一類含雙股線性DNA的皰疹病毒，可以與體外培養(yǎng)的B淋巴細(xì)胞融合，通過病毒基因組內(nèi)潛伏基因的顯性表達(dá)，改變細(xì)胞生命周期[13]。有研究發(fā)現(xiàn)被轉(zhuǎn)染的淋巴細(xì)胞內(nèi)抑癌基因如p53的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平有所上升，但是細(xì)胞壽命未見縮短，證明EB病毒可以抑制抑癌基因發(fā)揮活性效應(yīng)，具有使淋巴細(xì)胞永生化的潛力[14]。

1.3.3人乳頭狀瘤病毒(HPV) HPV是一種對上皮細(xì)胞有高度特異性的DNA病毒，因其可以轉(zhuǎn)染上皮細(xì)胞增殖成乳頭狀瘤而引起學(xué)者廣泛關(guān)注。在HPV的編碼基因中，E6和E7基因是誘導(dǎo)細(xì)胞永生化的重要因素，其編碼的轉(zhuǎn)化蛋白不僅可以封閉抑癌基因發(fā)揮作用的活性分子結(jié)構(gòu)，還可以通過對hTERT的調(diào)控而激活端粒酶活性[15]。有實(shí)驗(yàn)表明被HPV轉(zhuǎn)染的上皮細(xì)胞內(nèi)端粒的長度停止縮短并不斷增長，使細(xì)胞增殖失控達(dá)到永生化[16]。

1.4 原癌基因與抑癌基因

真核細(xì)胞內(nèi)存在眾多原癌基因如c-myc、vsrc、c-Jun等可以通過編碼活性蛋白分子來調(diào)控細(xì)胞增殖分裂分化等生理過程，其中c-myc是最早被發(fā)現(xiàn)的原癌基因，有許多與瘤化相關(guān)的功能區(qū)域，其轉(zhuǎn)錄表達(dá)的蛋白可以通過核膜進(jìn)入細(xì)胞核與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的啟動子結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，誘導(dǎo)端粒酶mRNA快速表達(dá)，直接激活端粒酶活性，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入永生化進(jìn)程[17]。

真核細(xì)胞內(nèi)在細(xì)胞永生化的過程中，存在多種抑癌基因如p53、pRb、BRCA1、DPC4等，通過等位基因隱性作用、抑癌基因的顯性負(fù)作用等逐漸失去活性，細(xì)胞老化途徑受到阻止。有實(shí)驗(yàn)證明端粒酶的活性與抑癌基因表達(dá)產(chǎn)物的下調(diào)有相關(guān)關(guān)系，推測抑癌基因的失活協(xié)同端粒酶的激活共同參與細(xì)胞永生化的進(jìn)程[18]。

2 不同細(xì)胞永生化的方法及機(jī)制

雖然永生化的機(jī)制有相似之處，但同樣的永生化方法并非適用于所有細(xì)胞，因此，有針對性地發(fā)展對特定細(xì)胞的永生化技術(shù)可以幫助傳代次數(shù)少、增殖分裂慢的細(xì)胞增加細(xì)胞周期壽命，達(dá)到臨床要求的治療功效。

2.1 肝細(xì)胞永生化方法

由于先天性肝臟疾病和肝衰竭等肝疾病發(fā)病率增高、捐贈供體短缺，使得體外活性肝臟的臨床價值越來越高。雖然肝臟代償功能強(qiáng)大，體內(nèi)處于分裂休眠期的肝細(xì)胞數(shù)量巨大，但由于肝細(xì)胞生長分裂與自身三維立體結(jié)構(gòu)及內(nèi)部微環(huán)境緊密相關(guān)，肝細(xì)胞體外培養(yǎng)難度高、成功率低、傳代困難，因此對外源性永生化肝細(xì)胞的研究是如今臨床研究的重點(diǎn)。

2.1.1抑癌基因敲除 鑒于抑癌基因?qū)?xì)胞周期的控制和誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的機(jī)制，有實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)過抑癌基因如p53等敲除后的體外肝細(xì)胞可以突破正常的細(xì)胞周期生長抑制極限，進(jìn)入到無限增殖的狀態(tài)。永生化肝細(xì)胞進(jìn)行特異性分化、基因表達(dá)和表型與體內(nèi)肝細(xì)胞基本相同。這種實(shí)驗(yàn)思路在小鼠肝細(xì)胞實(shí)踐中已經(jīng)獲得了成功的實(shí)驗(yàn)案例，基因敲除的外源性培養(yǎng)肝臟移植到小鼠體內(nèi)可以定植生長，但是基因缺失的細(xì)胞介于正常細(xì)胞與癌細(xì)胞狀態(tài)之間，其瘤化幾率以及基因穩(wěn)定性問題還未得到圓滿解決[19]。

2.1.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)和病毒轉(zhuǎn)染 鑒于端粒-端粒酶學(xué)說對細(xì)胞永生化的可行性，用多順反子質(zhì)粒載體以及逆轉(zhuǎn)錄病毒將hTERT基因?qū)胝８闻K細(xì)胞核內(nèi)，使端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因整合到肝細(xì)胞基因內(nèi)并穩(wěn)定表達(dá)，經(jīng)過特定的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境可以得到端粒長度增加，細(xì)胞壽命增長的正常人源肝細(xì)胞，可以傳代300代以上并且沒有致瘤性，其表達(dá)產(chǎn)物如肝藥酶、細(xì)胞色素、白蛋白等均與內(nèi)源性肝細(xì)胞產(chǎn)物相同[20]。但是目的基因以外的病毒外源性基因?qū)?xì)胞正常生理功能的潛在影響問題還有待解決。

2.1.3可恢復(fù)性永生化 目前為了解決外源性基因以及病毒內(nèi)靶基因意外無關(guān)序列對細(xì)胞的影響，提出了可恢復(fù)性永生化的思路，即導(dǎo)入永生化基因后在細(xì)胞增殖穩(wěn)定表達(dá)出正常細(xì)胞產(chǎn)物后，在合適的細(xì)胞周期區(qū)間，使用特異性整合技術(shù)敲除導(dǎo)入的目的基因，使細(xì)胞初始化。有實(shí)驗(yàn)表明，在敲除永生化相關(guān)基因后，本該停止繼續(xù)增殖的現(xiàn)象并未發(fā)生，反而細(xì)胞在特異性分化、分泌代謝等方面趨向成熟，并且在端粒長度、基因完整性等方面與內(nèi)源性肝細(xì)胞極其相似[21]。

2.2 上皮細(xì)胞永生化方法

DNA致瘤病毒轉(zhuǎn)染是目前上皮細(xì)胞永生化最常用的方法。HPV重要的轉(zhuǎn)化蛋白是E6，將HPV導(dǎo)入上皮細(xì)胞中，E6表達(dá)的產(chǎn)物可以與p53蛋白相結(jié)合并通過細(xì)胞內(nèi)水解酶將p53降解[22]。E6可以單獨(dú)作用于細(xì)胞基因使端粒酶活性上升，加速端粒的自我復(fù)制。病毒轉(zhuǎn)染對口腔上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞、胰腺上皮細(xì)胞等永生化研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但是角化上皮細(xì)胞等細(xì)胞在病毒轉(zhuǎn)染基礎(chǔ)上還需要其他因子共同作用。

2.3 心肌細(xì)胞永生化方法

隨著心肌梗死等心血管疾病的發(fā)病人數(shù)穩(wěn)步攀升，心臟衰竭終末期的唯一治療方法就是心臟移植，因此自體心肌細(xì)胞體外永生化培養(yǎng)具有很高的臨床價值。

目前有實(shí)驗(yàn)通過P16慢病毒載體和可逆SV40病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑成功建立了永生化心肌祖細(xì)胞。用心肌細(xì)胞譜系標(biāo)志作為評價標(biāo)準(zhǔn)來觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的生長狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞不僅可以成功增殖分裂，抑制衰老周期，還具備心肌干細(xì)胞的分化潛能。也有實(shí)驗(yàn)表明心肌成纖維細(xì)胞經(jīng)過HPV病毒轉(zhuǎn)染后成功增加壽命，并正常表達(dá)與初級成纖維細(xì)胞相同的細(xì)胞特異性標(biāo)志物、細(xì)胞因子等[15]。雖然特定心肌細(xì)胞株永生化具有巨大研發(fā)空間，但是由于心肌分化是一個涉及眾多微環(huán)境因素的復(fù)雜過程，因此重建永生化心臟還存在許多困難。

2.4 胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞永生化方法

胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞對胚胎發(fā)育具有重要作用，建立體外永生化滋養(yǎng)層細(xì)胞株對建立分泌細(xì)胞模型、研究胚胎疾病毒理以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展都有很大的臨床價值。已有研究成功將HPV中E6和E7與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶相結(jié)合建立表達(dá)載體導(dǎo)入山羊滋養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)出的胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞不僅表現(xiàn)出較高的端粒酶活性，并且對hTERT基因表達(dá)非常穩(wěn)定、無致瘤性，最高可以傳代50代以上[23]。細(xì)胞具有初級滋養(yǎng)層細(xì)胞的一切形態(tài)功能，檢測到金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP-2)、絨毛膜促性腺激素、免疫因子等滋養(yǎng)層細(xì)胞特異性分泌因子，符合長壽命體外細(xì)胞模型的觀察標(biāo)準(zhǔn)[24]。

目前還有研究發(fā)現(xiàn)，在母嬰垂直傳播乙型肝炎病毒(HBV)案例的母體中發(fā)現(xiàn)可自發(fā)永生化滋養(yǎng)細(xì)胞系HPT-8。推測這種自發(fā)永生化的細(xì)胞是宮內(nèi)感染過程中HBV整合在滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)與正?；蛳嗷プ饔貌⒎€(wěn)定表達(dá)的結(jié)果。對HPT-8進(jìn)行電鏡觀察、免疫組化和細(xì)胞學(xué)熒光分析顯示，細(xì)胞的形態(tài)以及細(xì)胞內(nèi)容物特征與正常細(xì)胞極其相似，并且發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層細(xì)胞特有的胞間橋粒以及細(xì)胞角蛋白、堿性磷酸酶、各種特異性激素等細(xì)胞標(biāo)志物。同時，HPT-8細(xì)胞表面也發(fā)現(xiàn)了HBV抗原[25]。這種病毒與滋養(yǎng)層細(xì)胞融合后表達(dá)的克隆衍生物提示病毒適當(dāng)表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞的永生化進(jìn)程。

另外，還有其他多種細(xì)胞也已成功培養(yǎng)出永生化細(xì)胞株如：B淋巴細(xì)胞在體外用EB病毒轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)出可以穩(wěn)定表達(dá)IgG的細(xì)胞株；用SV40慢病毒轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞獲得與正常細(xì)胞形態(tài)學(xué)，特征性標(biāo)志物無明顯差別的永生化細(xì)胞株等。

3 展 望

細(xì)胞永生化是細(xì)胞研究的一個重要方向，通過對細(xì)胞永生化的研究，不僅有助于進(jìn)一步了解細(xì)胞生長規(guī)律，探索細(xì)胞衰老原因，而且對明確腫瘤發(fā)生機(jī)制、促進(jìn)解決器官移植問題有著重要意義。但細(xì)胞永生化的研究仍存在一些問題，如將病毒導(dǎo)入目的細(xì)胞后可能產(chǎn)生有害細(xì)胞產(chǎn)物，導(dǎo)致細(xì)胞安全性存在隱患；由于永生化細(xì)胞是體細(xì)胞向癌細(xì)胞過度的一種中間狀態(tài)細(xì)胞，涉及癌基因的表達(dá)，其在體內(nèi)的安全性也受到質(zhì)疑。即使現(xiàn)在對肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞等永生化研究已經(jīng)有很大進(jìn)步，但往往成本較高，成功率低，且對永生化心肌細(xì)胞等特定細(xì)胞的分化仍十分困難。如何開發(fā)出成本較低、安全性好且功能正常的永生化細(xì)胞也是重要的研究方向。

永生化胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞作為現(xiàn)代細(xì)胞工程學(xué)研究的新焦點(diǎn)，對探索胚胎疾病、建立體外細(xì)胞模型、明確腫瘤發(fā)生和細(xì)胞衰老機(jī)制有著極大的臨床價值，但同時胚胎細(xì)胞的永生化也涉及倫理道德方面的問題，需要注意。

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2015-05-02

2015-06-01

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(31200730)

黃今(1993-)，女，遼寧沈陽人，在讀碩士研究生。E-mail：632891329@qq.com

馬海英 E-mail：1090955300@qq.com

黃今，楊融輝，馬海英.細(xì)胞永生化機(jī)制及不同細(xì)胞永生化方法研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2015，34(5)：821-824．

R329.2

A

1671-6264(2015)05-0821-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.031