應(yīng)用16SrRNA熒光定量PCR技術(shù)研究β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物對嬰兒腸道菌群的影響

賀 銳，張 翀，章國平，趙翠生

（甘肅省婦幼保健醫(yī)院檢驗(yàn)科，蘭州 730050）

應(yīng)用16SrRNA熒光定量PCR技術(shù)研究β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物對嬰兒腸道菌群的影響

賀 銳，張 翀，章國平，趙翠生△

（甘肅省婦幼保健醫(yī)院檢驗(yàn)科，蘭州 730050）

目的探討β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物對嬰兒腸道菌群的影響。方法選取0～1歲嬰兒，應(yīng)用16SrRNA熒光定量PCR技術(shù)，分別測定β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物使用前，使用第3d、5天時(shí)，及治愈后第7天糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、大腸桿菌的水平。結(jié)果使用過β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物者糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和腸球菌的數(shù)量與未使用者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。糞便雙歧桿菌、乳酸桿菌含量隨治療時(shí)間的延長而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。未使用抗菌藥物的患兒腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌的恢復(fù)明顯快于使用過抗菌藥物的患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物對嬰兒腸道菌群有普遍的殺滅作用，對嬰兒腸道菌群改變的影響是輕微的。β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物的使用會(huì)延遲患兒腸道微生態(tài)的恢復(fù)，但若合理使用對疾病的治療有積極作用。

腸道菌群； 抗菌藥物； 16SrRNA； 嬰兒

腸道菌群是人體重要的微生態(tài)系統(tǒng)之一，直接參與人體的消化、營養(yǎng)吸收、能量供應(yīng)、脂肪代謝、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能，相當(dāng)于人體的一個(gè)重要“器官”［1］。嬰兒時(shí)期，腸道微生態(tài)環(huán)境初步建立，對代謝、免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟等起著十分重要的作用［2］。β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物的使用對嬰兒腸道菌群的影響一直以來備受關(guān)注。本研究采用病例對照研究，運(yùn)用細(xì)菌涂片、細(xì)菌培養(yǎng)、16SrRNA熒光定量PCR分析等檢測手段，對β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物的使用對嬰兒腸道菌群的影響進(jìn)行了初步探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年7月至2013年3月于本院就診的嬰兒作為研究對象。健康嬰兒組：4周內(nèi)未使用過β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物、微生態(tài)制劑且無胃腸道癥狀，健康體檢合格的0～1歲嬰兒，共50例。對照組：未使用抗菌藥物，以支持治療為主的0～1歲嬰兒。研究組：合并細(xì)菌感染性疾病，以β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物治療為主的0～1歲嬰兒。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集與處理 對照組取入院第3、5天及愈后第7天糞便標(biāo)本各10g，研究組留取使用抗菌藥物前，使用抗菌藥物第3、5天和愈后第7天的糞便標(biāo)本各10g。標(biāo)本置無菌杯內(nèi)立即送檢，進(jìn)行培養(yǎng)、接種、涂片，剩余標(biāo)本用無菌干燥管儲存，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 腸道細(xì)菌DNA的提取 取凍存的糞便標(biāo)本復(fù)融，每l g加1mL的PBS（0.05mol/L，pH7.4）充分顛倒混勻5～10 min，然后低速離心（2 000r/min）5min，取上清，上述過程重復(fù)3次，收集上清高速離心（13 000r/min）3min后取沉渣，沉淀物用PBS液洗4次，水洗1次，后加50μL蒸溜水懸浮，50μL 1%TritonX－100破碎菌體，100℃煮沸5min立即放人冰水中冷卻［3］。

1.2.3 PCR引物 對所選用引物序列分別與4種細(xì)菌的16S rRNA全序列在BLAST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較驗(yàn)證，4種細(xì)菌上、下游引物如下：雙歧桿菌CTC CTG GAA ACG GGT GG［4］，GGT GTT CTT CCC GAT ATC TAC A，擴(kuò)增片段為550bp；乳酸桿菌AGC AGT AGG GAA TCT TCC A，ATT TCA CCG CTA CAC ATG［5］，擴(kuò)增片段為380bp；腸球菌TCC ACG CCG TAA ACG ATG AG，GAC ACG AGC TGA CGA CAA CC，擴(kuò)增片段274bp［6］；大腸埃希菌GGA GCA AAC AGG ATT AGA TAC CC，CCC AAC ATT TCA CAA CAC G［7］，擴(kuò)增片段317bp。

1.2.4 熒光定量PCR反應(yīng)體系 采用25μL反應(yīng)體系，包括10×Buffer 2.5μL，4×dNTP（0.25mmol/L）2μL，MgCl2（25 mmol/L）2.5μL，上下游引物（0.25μmol/L）各0.25μL，Taq酶（1U/μL）0.75μL，DNA模板3μL，熒光染料SYBR green 2.5μL，雙蒸水11.25μL。應(yīng)用Mx3000P型熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增與分析。

1.2.5 PCR反應(yīng)條件 95℃變性5min；95℃15s，60℃1 min，72℃45s，87℃5s共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min后結(jié)束。60～95℃作熔解曲線，各細(xì)菌的熔解曲線見附圖1～4（見《國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”）

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 分別純化上述PCR反應(yīng)過程中得到的4種細(xì)菌PCR產(chǎn)物，具體步驟如下：在DNA溶液中加入1/10體積3mol/L pH 5.2的乙酸鈉，在旋渦混合器上稍加振蕩或用手指輕彈離心管壁幾次使之混勻，加入2～2.5倍體積的無水乙醇，振蕩混勻并置于冰上30min，離心5min棄上清，加入1mL 70%的乙醇，顛倒混勻離心棄上清，干燥沉淀。將干燥沉淀物溶于適當(dāng)體積的無菌水或TE緩沖液即成。在分光光度儀上測定4種細(xì)菌純化產(chǎn)物的吸光度值。參照1個(gè)吸光度值雙鏈DNA片段（1kb）相當(dāng)于4.74×1013copies/mL的標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算出每毫升PCR產(chǎn)物中所含的拷貝數(shù)，然后做10倍系列稀釋，使其形成104～108copies/mL的系列濃度的溶液，按上述條件進(jìn)行熒光定量PCR，形成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 細(xì)菌產(chǎn)物的驗(yàn)證 通過對4種細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株做熒光定量PCR，利用熔解曲線比較產(chǎn)物解鏈溫度（TM）與標(biāo)準(zhǔn)菌株TM值的差異，經(jīng)驗(yàn)證，腸道菌群PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和腸球菌的特異性產(chǎn)物，

1.2.8 檢測靈敏度分析 通過對上述4種細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落做系列稀釋（102～108cfu/mL）后行熒光定量PCR，證明100 cfu/mL細(xì)菌的檢測標(biāo)本仍能呈現(xiàn)特征性熔解曲線，說明用上述引物通過熒光定量PCR檢測上述4種細(xì)菌有較好的檢測靈敏度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，對PCR定量檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)處理后（log copies/g）以表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，三組及以上計(jì)量資料的比較采用方差分析，若P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

研究組糞便雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和腸球菌水平都較對照組患兒略低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。分析嬰兒腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌在使用β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物治療不同時(shí)期糞便中含量的變化，隨治療時(shí)間的延長，雙歧桿菌、乳酸桿菌逐步增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。采用成組t檢驗(yàn)比較研究組與對照組愈后一周腸道微生態(tài)的恢復(fù)情況，見表3，對照組患兒腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌的恢復(fù)明顯快于研究組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。健康嬰兒糞便雙歧桿菌、乳酸桿菌的水平見表4。

3 討 論

β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物在控制嬰幼兒感染性疾病中起著舉足輕重的作用，由于耐藥菌株的不斷產(chǎn)生，臨床β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物應(yīng)用日益廣譜化、高檔化。廣譜抗菌藥物大量應(yīng)用導(dǎo)致醫(yī)源性菌群失調(diào)的問題也日益凸顯［8－9］，尤其是β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物在嬰幼兒疾病中的使用。

腸道微生態(tài)是由腸道菌群在腸道內(nèi)形成的一個(gè)龐大而復(fù)雜的系統(tǒng)，由自身的專性厭氧菌和部分外籍菌及環(huán)境菌群構(gòu)成［10］。在局部環(huán)境改變、機(jī)體免疫力下降、或廣譜抗菌藥物使用等條件下，正常菌群發(fā)生數(shù)量或性質(zhì)的異常變化，以數(shù)量的變化為主，即腸道菌群比例失調(diào)［11］。而本研究顯示，抗菌藥物對腸道菌群有普遍的殺滅作用，但對合并細(xì)菌感染性疾病的嬰兒腸道菌群改變的影響是有限的。感染性腹瀉患兒因感染導(dǎo)致腸道生物屏障的破壞，抵抗細(xì)菌腸道定植的能力減弱，腸道正常的菌群結(jié)構(gòu)被擾亂。合理的使用β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物在治療感染的同時(shí)可以使臨床癥狀得到緩解，讓腸道環(huán)境逐步改善。本研究顯示，合并細(xì)菌感染性疾病的患兒治愈后7天腸道中益生菌的數(shù)量已經(jīng)與健康嬰兒已基本接近。同時(shí)，未使用β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物的患兒，腸道微生態(tài)環(huán)境的恢復(fù)明顯快于使用了β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物的患兒，這也提示臨床治療中，應(yīng)積極考慮調(diào)整患兒腸道微生態(tài)環(huán)境，以利于疾病的恢復(fù)。

嬰兒疾病治療中廣譜抗菌藥物β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物的使用存在諸多爭議，在治療中應(yīng)盡可能以病原學(xué)和藥敏試驗(yàn)為基礎(chǔ)，嚴(yán)格掌握β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物的應(yīng)用指標(biāo)，結(jié)合嬰兒腸道微生態(tài)特點(diǎn)，及時(shí)、合理應(yīng)用微生態(tài)制劑，改善β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物造成的菌群失調(diào)，增強(qiáng)宿主適應(yīng)性，在確保抗感染療效的同時(shí)及時(shí)糾正腸道微生態(tài)失衡對嬰兒的生長發(fā)育帶來的不良影響。

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The impact ofβ－lactam antibiotics on infants′intestinal flora detected by using 16S rRNA quantitative PCR technique

He Rui，Zhang Chong，Zhang Guoping，Zhao Cuisheng△
（Department of Clinical Laboratory，Maternal and Child Health Care Hospital，Lanzhou，Gansu730050，China）

ObjectiveTo investigate the influence ofβ－lactam antimicrobial drugs on infants′intestinal flora.MethodsInfants from 0to 1years old were enrolled in the study，who′s feces samples were tested for Bacillus bifidus，lactobacillus，enterococcus and E.coli by using 16SrRNA quantitative PCR technique before using antibiotics，on the third and fifth day duringβ－lactam antibiotics treatment and the seventh day after treatment.ResultsThe numbers of Bacillus bifidus，lactobacillus，E.coli and enterococci detected in usingβ－lactam antibiotics group were not statistically different from those in not using antibiotics group（P＞0.05）.The numbers of Bacillus bifidus and lactobacillus increased with the treatment process，the differencies was statistically significant（P＜0.05）.The recovery of the numbers of intestinal Bacillus bifidus and lactobacillus in not using antibiotics group was significantly faster than using antibiotics group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusionβ－lactam antibiotics have general killing effect on the intestinal flora in infants，which could recover to normal.The recovery of intestinal flora could be delayed if antibiotics are used，however，reasonable antibiotics treatment would be very helpful in the treatment of primary diseases.

intestinal flora； antibiotics； 16SrRNA； infant

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.030

A

1673－4130（2015）03－0357－03

2014－11－10）

賀銳，女，副主任檢驗(yàn)師，主要從事微生物及分子生物學(xué)的研究?！?/p>

，E－mail：zhaocuisheng123＠126.com。