乙肝表面抗原實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的進(jìn)展

劉 楊 綜述，彭道榮 審校

（西京醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安710032）

由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎（以下簡(jiǎn)稱“乙肝”）現(xiàn)已成為潛在威脅人類生命的全球性疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2014年6月更新的數(shù)據(jù)顯示，全球已有2.4億人患慢性肝炎傳染病，其中每年就有78 萬人死于由HBV 感染所致的肝衰竭、肝硬化及原發(fā)性肝癌等肝臟疾病［1］。1992年，我國(guó)正式將乙肝疫苗納入免疫規(guī)劃管理，有效降低了易感人群的數(shù)量，但由于我國(guó)是一個(gè)乙肝大國(guó)，乙肝病毒攜帶者的基數(shù)過大，防治工作仍然面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。目前，針對(duì)HBV感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法多樣，因而選擇高效率、高質(zhì)量的檢測(cè)方法成為乙肝防治工作的重要前提。

乙肝表面抗原（HBsAg）是臨床上應(yīng)用最多的HBV 感染血清檢測(cè)標(biāo)志物，它是WHO 公認(rèn)的判斷HBV 感染的關(guān)鍵指標(biāo)［2］。自1972年第一批HBsAg 檢測(cè)試劑盒問世至今，HBsAg的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)經(jīng)歷了從定性、半定量到高定量的發(fā)展過程，本文就HBsAg的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和研究進(jìn)展作以下綜述。

1 HBsAg的形成

HBV 屬嗜肝DNA 病毒科，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。當(dāng)HBV 侵入人體后，經(jīng)過黏附、脫殼，HBV－DNA 可從肝細(xì)胞漿內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞核，在此進(jìn)一步發(fā)育完善，使部分雙鏈環(huán)狀DNA形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），并以其為模板轉(zhuǎn)錄成不同長(zhǎng)度的mRNA，mRNA 進(jìn)一步進(jìn)行翻譯。HBsAg是HBV 病毒的糖化外膜蛋白，由包膜蛋白基因S編碼，包括大蛋白（LHBs）、中蛋白（MHBs）以及主蛋白（SHBs）三種類型。HBsAg具有抗原多型性，“a”為共同抗原決定簇，亞型決定簇“d”和“y”，“w”和“r”因互相排斥而組合成不同的亞型。乙肝患者血清中出現(xiàn)的HBsAg除了來自具有感染性的成熟的乙肝病毒顆粒外，還來自非感染性的病毒顆粒：球狀及桿狀。雖然非感染顆粒不含DNA，但其分泌量遠(yuǎn)大于前者。由于HBsAg不僅可來自cccDNA 的轉(zhuǎn)錄翻譯，也可來自整合入宿主細(xì)胞的HBVDNA，因此它能更好地反映HBV 的轉(zhuǎn)錄活性和患者的感染狀態(tài)［3－4］。

2 HBsAg的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

HBsAg在人體感染HBV 1周后，大多數(shù)為6周后即可在體內(nèi)出現(xiàn)［5］。目前，我國(guó)針對(duì)乙型肝炎開展的實(shí)驗(yàn)室檢查項(xiàng)目繁多，包括蛋白質(zhì)水平的免疫學(xué)檢測(cè)和核酸水平的分子生物學(xué)檢測(cè)。臨床上常用于HBsAg的免疫學(xué)檢測(cè)方法有膠體金免疫層析法（GICA）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、微粒子酶免疫分析法（MEIA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）等。

2.1 GICA 免疫層析法是九十年代興起的一種基于免疫膠體金技術(shù)的快速診斷技術(shù)，GICA 亦稱金標(biāo)法，是利用膠體金顯色的特點(diǎn)結(jié)合免疫層析法，診斷特異性的待測(cè)物而發(fā)展起來的［6］。由于該方法簡(jiǎn)便快捷，實(shí)驗(yàn)僅需一步即可完成，而被各大小醫(yī)院廣泛應(yīng)用。但是，由于金標(biāo)法檢測(cè)HBsAg還沒有一個(gè)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，臨床上對(duì)該方法的評(píng)價(jià)參差不齊。

目前，大量報(bào)道顯示金標(biāo)法檢測(cè)HBsAg特異性高，有一定的檢出率，但該方法檢測(cè)的靈敏度低于臨床上常用的其他方法。根據(jù)上海市臨檢中心2009年10月第二次室間評(píng)估匯報(bào)結(jié)果分析，采用金標(biāo)法檢測(cè)HBsAg 的實(shí)驗(yàn)室不合格率非常高，全市6家室間質(zhì)評(píng)未通過的實(shí)驗(yàn)室均是采用了金標(biāo)法。再進(jìn)一步對(duì)該方法進(jìn)行性能評(píng)估發(fā)現(xiàn)，其檢測(cè)靈敏度僅為4IU／mL，而非市面上大多數(shù)試劑說明書中描述的2IU／mL（1IU＝0.5ng）［7］，這與孫宗立等［8］的報(bào)道一致。但也有報(bào)道顯示該方法檢測(cè)靈敏度可達(dá)2IU／mL［9］。此外，金標(biāo)法對(duì)灰區(qū)標(biāo)本的檢測(cè)存在較大缺陷，謝云等［10］在其研究中指出，經(jīng)過金標(biāo)法初篩后的血液樣本，分別用進(jìn)口、國(guó)產(chǎn)兩種HBsAg ELISA 法試劑盒檢測(cè)，對(duì)在灰區(qū)（S／CO 值大于或等于0.5）且確定為陽(yáng)性的152份標(biāo)本，再次用金標(biāo)法檢測(cè)，陽(yáng)性結(jié)果僅為35份，符合率為23%，其檢測(cè)結(jié)果與兩種ELISA 試劑檢測(cè)結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 ELISA ELISA 是在放射免疫分析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的固相酶聯(lián)免疫測(cè)定方法，它先通過化學(xué)反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，再通過免疫反應(yīng)使待測(cè)物可與固相載體上的相應(yīng)抗原（抗體）結(jié)合，加入底物后，酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，根據(jù)其顏色深淺來判讀欲測(cè)的抗原（抗體）水平。常用于定性或半定量檢測(cè)。該方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，無放射性污染，檢測(cè)成本較低，是目前臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)HBsAg最常用的方法，但該方法操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，不確定因素較多，易造成孔間的交叉污染。

ELISA 已是臨床上運(yùn)用較成熟的檢測(cè)方法。我國(guó)市面上主要存在進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)兩類HBsAg ELISA 法試劑盒，國(guó)內(nèi)試劑盒的檢測(cè)品質(zhì)雖越來越高，但與進(jìn)口試劑相比仍有差距，而且國(guó)產(chǎn)廠家試劑間比較也存在差異［11］。在孫文利等［12］的報(bào)道中，將國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口的HBsAg ELISA 法試劑盒質(zhì)量進(jìn)行比較，國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口ELISA 試劑的靈敏度分別為86%和100%，特異度分別為100%和96%，約登指數(shù)分別為0.86和0.96，兩試劑的重復(fù)符合率均為100%，試劑的靈敏度以進(jìn)口試劑盒較好，但特異性比國(guó)產(chǎn)試劑差。此外，實(shí)際工作中，當(dāng)HBsAg濃度低或基因變異時(shí)，可出現(xiàn)檢測(cè)灰區(qū)。據(jù)陳善華等［13］報(bào)道，用電化學(xué)發(fā)光法和熒光定量PCR 法，對(duì)兩種國(guó)產(chǎn)HBsAg ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果為灰區(qū)組的106 例標(biāo)本（0.6≤S／CO＜1）及100份陰性組樣本（S／CO＜0.3）進(jìn)行復(fù)檢發(fā)現(xiàn)，灰區(qū)組中電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)陽(yáng)性12例，HBV－DNA 檢測(cè)陽(yáng)性16例，與HBsAg陰性組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明ELISA 法檢測(cè)HBsAg“灰區(qū)”標(biāo)本時(shí)存在一定數(shù)量的陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)這類樣本有研究認(rèn)為應(yīng)進(jìn)一步做抗體中和確認(rèn)試驗(yàn)以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和真實(shí)性［14］。

2.3 CLIA CLIA 是將化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與免疫反應(yīng)相結(jié)合的一種分析方法，它既有化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)的高靈敏度，又兼具免疫反應(yīng)的高特異性，因此臨床上應(yīng)用廣泛。與上述兩種方法不同的是，由于該方法線性范圍寬，臨床上常用作HBsAg的全定量檢測(cè)，為監(jiān)測(cè)乙肝患者抗病毒治療療效提供幫助。自1990年，發(fā)現(xiàn)HBsAg“a”表位G145R 突變株以來，各種有臨床意義的“a”表位變異的HBsAg變異株屢見不鮮，這樣使得當(dāng)前的HBsAg試劑檢測(cè)能力下降，對(duì)檢測(cè)試劑的靈敏度提出了更高要求［15］。目前，CLIA 由于其較高的檢測(cè)靈敏度和廣譜性，現(xiàn)已成為國(guó)際上主流的HBsAg全定量的檢測(cè)方法。它包括兩代試劑：第一代為美國(guó)雅培公司的化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)（CMIA）試劑盒，第二代為德國(guó)羅氏診斷公司推出的電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)（ECLI）試劑盒。這兩種試劑盒均可溯源至WHO標(biāo)準(zhǔn)品，定量檢測(cè)結(jié)果以國(guó)際單位IU／mL 的形式表示，1IU／mL約等于1～10ng／mL 的HBsAg，兩者之間也有很好相關(guān)性［16］。

2.3.1 化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法 ARCHITECT HBsAg是利用CMIA 技術(shù)的彈性檢測(cè)，通過兩步免疫測(cè)定法，定量檢測(cè)人血清或血漿中的HBsAg。第一步，將標(biāo)本和Anti－HBs包被的順磁微粒子合并。標(biāo)本中存在的HBsAg便結(jié)合到Anti－HBs包被的順磁微粒子。洗滌后，在第二步加入吖啶酯標(biāo)記Anti－HBs的結(jié)合物。再次洗滌之后，加入預(yù)觸發(fā)液和觸發(fā)液，復(fù)合物中的吖啶酯被氧化發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度用相對(duì)發(fā)光值（RLU）表示，標(biāo)本中的HBsAg 含量與光學(xué)系統(tǒng)所檢測(cè)到的RLU 呈正比。

化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法因其具有很好的特異性、較高的靈敏度和重復(fù)性被認(rèn)為是免疫檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)［17］。在馬連學(xué)等［18］的報(bào)道中，CMIA 法所測(cè)得的113例陽(yáng)性標(biāo)本中，經(jīng)確認(rèn)試驗(yàn)陽(yáng)性數(shù)為103例，確認(rèn)陽(yáng)性率91.2%，ELISA 法陽(yáng)性率為83.2%，兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CMIA 法假陽(yáng)性標(biāo)本表面抗原定量值在0.05～0.12IU／mL之間，提示對(duì)于弱陽(yáng)性結(jié)果需要做確認(rèn)試驗(yàn)以保證試驗(yàn)正確性。李美忠等［19］也就CMIA 法測(cè)定HBsAg的臨床應(yīng)用做了評(píng)價(jià)，Architect iR2000免疫發(fā)光系統(tǒng)及配套試劑檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.2μg／L，而ELISA 法僅能達(dá)到0.5μg／L。重復(fù)性試驗(yàn)HBsAg低值和高值質(zhì)控品變異系數(shù)（CV）分別為5.22%及5.46%，線性試驗(yàn)在0～250IU／mL 范圍內(nèi)結(jié)果可靠。ARCHITECT 化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法作為第一代HBsAg化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其原倍的檢測(cè)范圍最高為250IU／mL，不能滿足大部分乙肝患者的需求，若進(jìn)行高值標(biāo)本的檢測(cè)需要進(jìn)一步手工稀釋，因此大大降低了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)效率。

2.3.2 電化學(xué)發(fā)光免疫分析法 Roche Elecsys是采用單克隆和多克隆HBs抗體（小鼠和羊）測(cè)定HBsAg。兩種生物素化的抗HBsAg單克隆抗與釕復(fù)合物標(biāo)記的一種抗HBsAg單克隆抗體和多克隆抗體混合物與待測(cè)抗原反應(yīng)，形成抗原－抗體復(fù)合物，復(fù)合物可進(jìn)一步與加入的鏈霉親和素包被的微粒結(jié)合，微粒通過電磁吸附在電極板上，在電壓的作用下，使復(fù)合物化學(xué)發(fā)光，光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)的發(fā)光值強(qiáng)度與待測(cè)抗原濃度呈正比。

與第一代CLIA 檢測(cè)HBsAg試劑盒比較，較多報(bào)道都顯示兩者檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性較好［21］，但Roche Elecsys具有更多優(yōu)越性，首先表現(xiàn)在對(duì)突變株的檢出率上。俞瑩卿［21］在對(duì)第二代化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)HBsAg進(jìn)行多中心評(píng)估時(shí)，分別用一代、二代化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒及其他酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)13株重組乙肝病毒血清突變株和3株天然變異株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示羅氏ECL試劑的檢出率為98.1%，雅培的CLMI檢出率為87.6%，而科華的ELISA 試劑盒檢出率僅為19.3%，表示羅氏的二代試劑對(duì)突變株敏感性優(yōu)于一代的雅培試劑，且兩代化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒對(duì)突變株的檢出能力大大優(yōu)于ELISA 試劑，提高了實(shí)驗(yàn)室的檢出率，降低假陰性樣本。其次，羅氏ECL 試劑檢測(cè)線性寬，上機(jī)強(qiáng)制400 倍稀釋情況下檢測(cè)范圍可達(dá)52 000IU／mL，可滿足臨床大部分患者的檢測(cè)需求，提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)效率。此外，何宗忠等［22］在電化學(xué)發(fā)光測(cè)定低濃度HBsAg的研究中報(bào)道，與ELISA 相比，兩方法檢測(cè)高濃度HBsAg的總符合率高達(dá)98.88%，一致性很好，但對(duì)低濃度HBsAg樣本的檢測(cè)符合率僅72.49%，說明兩種方法對(duì)低濃度HBsAg檢測(cè)一致性較差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝7.592，P＝0.008）。

3 小結(jié)與展望

當(dāng)HBV 感染人體后，機(jī)體免疫力會(huì)不同程度的對(duì)病毒做出免疫應(yīng)答及清除，使得病毒的感染出現(xiàn)不同的結(jié)果，如急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、乙肝病毒攜帶者等。HBsAg不僅是判斷HBV 感染的指標(biāo)，也是臨床上檢測(cè)抗病毒治療療效的工具。近些年由于乙肝疫苗及抗病毒藥物的廣泛應(yīng)用，加速了HBsAg變異株的出現(xiàn)。如研究已證實(shí)的G145R、131I、C138Y等表位的突變，可能會(huì)導(dǎo)致目前已有的HBsAg試劑檢測(cè)能力下降，從而對(duì)臨床診斷和血液篩查帶來威脅［23－24］，因此，高靈敏度、高特異度的HBsAg 檢測(cè)試劑的應(yīng)用在臨床上至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)各檢測(cè)方法的性能進(jìn)行評(píng)估和比對(duì)，根據(jù)檢測(cè)目的選擇最優(yōu)方法，從而對(duì)臨床HBV 感染者的篩查、診斷及治療提供最有效的幫助。

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