CD44v6和FOXD3在人胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

陳 勇，張 紅，吳夢(mèng)婕，姚元春，楊春香，秦 蓉

CD44v6和FOXD3在人胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

陳 勇1，張 紅1，吳夢(mèng)婕2，姚元春3，楊春香4，秦 蓉1

目的研究CD44v6和FOXD3蛋白在人胃癌組織中的表達(dá)及其與胃癌生物學(xué)行為的關(guān)系。方法采用免疫組化Envision二步法檢測(cè)兩種蛋白在100例人胃癌組織及40例癌旁正常胃黏膜組織和110例人胃癌組織芯片中的表達(dá)。結(jié)果傳統(tǒng)病理切片中CD44v6蛋白在胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織的陽性表達(dá)率分別為88%、22.5%（P＜0.001），與胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)（P＜0.001）。FOXD3蛋白在胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織的陽性表達(dá)率分別為22%、90%（P＜0.001），與胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)（P＜0.001）。CD44v6與FOXD3表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)性（rs＝-0.276，P＜0.01）。CD44v6和FOXD3在110例胃癌組織芯片中的表達(dá)結(jié)果與以上傳統(tǒng)切片中的表達(dá)情況相似。結(jié)論FOXD3作為干細(xì)胞因子，其與胃癌生物學(xué)行為的關(guān)系以及與CD44v6的相關(guān)性提示FOXD3可能作為胃癌干細(xì)胞標(biāo)記物。

CD44v6；FOXD3；胃癌；干細(xì)胞；免疫組織化學(xué)；組織芯片

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）是腫瘤細(xì)胞中數(shù)量極少的特殊細(xì)胞亞群，這種細(xì)胞亞群能夠產(chǎn)生不同表型的腫瘤細(xì)胞，并維持腫瘤細(xì)胞的惡性增殖［1］。CSCs可表達(dá)一些干細(xì)胞特異性標(biāo)記因子，提示干細(xì)胞因子可能參與腫瘤的形成或者是腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記物［2］。CD44是一種細(xì)胞表面黏附因子，目前主要以其作為胃癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行胃癌干細(xì)胞研究。CD44v6是CD44主要變體之一，在腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移中起重要作用。FOXD3是叉頭框（Forkheadbox，F(xiàn)ox）家族成員之一，是一種干細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，具有保持胚胎干細(xì)胞多能性等作用［3］。目前FOXD3與胃癌的關(guān)系及FOXD3與CD44v6的關(guān)系研究甚少。該研究通過分析FOXD3在胃癌組織中的表達(dá)情況及CD44v6與FOXD3蛋白表達(dá)的相關(guān)性，探討FOXD3作為胃癌干細(xì)胞標(biāo)記物的可能性，為胃癌臨床診斷及治療提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

1.1.1 第一部分標(biāo)本來源 收集2013年安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科胃癌手術(shù)切除標(biāo)本100例，所有病例術(shù)前未接受放化療。其中男77例，女23例；年齡36～78（61.34±8.30）歲。收集癌旁正常胃黏膜組織40例作為對(duì)照。病例按WHO胃癌組織學(xué)分期標(biāo)準(zhǔn)歸類。

1.1.2 第二部分標(biāo)本來源 選取1982～2002年美國弗吉尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理系胃癌存檔病例125例，以及安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科胃癌手術(shù)切除標(biāo)本60例，共185例（組織芯片由張紅副教授饋贈(zèng)）。病例術(shù)前均未接受放化療。將上述兩組胃癌標(biāo)本分別制成2張組織芯片。實(shí)際有效病例110例，其中男82例，女28例；年齡25～86（40.26 ±13.25）歲。癌旁正常胃黏膜組織對(duì)照同第一部分。病例按WHO胃癌組織學(xué)分期標(biāo)準(zhǔn)歸類。

1.2 主要試劑鼠抗人CD44v6單克隆抗體（即用型）、PV-6000免疫組化檢測(cè)試劑盒、濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；鼠抗人FOXD3單克隆抗體（濃縮型，工作濃度1∶200）購自美國abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法所有切片采用相同條件按試劑盒說明書方法進(jìn)行操作。用已知陽性組織切片作為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野（×400），采用半定量積分法［4］判斷陽性結(jié)果（陽性面積和強(qiáng)度共同判斷）。陽性面積判斷：視野陽性細(xì)胞數(shù)≤5%計(jì)為0分，6%～25%計(jì)為1分，26%～50%計(jì)為2分，51%～75%計(jì)為3分，＞75%計(jì)為4分；陽性強(qiáng)度判斷：基本不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；將兩項(xiàng)積分相乘：0～2分為陰性（-），3～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。為便于統(tǒng)計(jì)，將≥3分（+～+++）均判斷為陽性表達(dá)。染色結(jié)果均由兩位病理科醫(yī)師閱片診斷核實(shí)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，定量資料采用表示，統(tǒng)計(jì)分析使用t檢驗(yàn)。等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，相關(guān)關(guān)系分析采用Spearman檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 傳統(tǒng)病理切片中CD44v6在胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況及其與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系CD44v6蛋白陽性信號(hào)主要定位于細(xì)胞膜，染色呈棕黃（褐）色，細(xì)胞膜連續(xù)線狀或帶狀分布為陽性細(xì)胞，見圖1。CD44v6在胃癌組織中陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝57.601，P＜0.001），見表1。CD44v6在胃癌組織中的表達(dá)水平與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床TNM分期相關(guān)（P＜0.001），與患者性別、年齡以及腫瘤大小無相關(guān)性，見表2。

2.2 傳統(tǒng)病理切片中FOXD3在胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況及其與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系FOXD3蛋白的陽性信號(hào)主要定位于細(xì)胞核，呈棕黃（褐）色細(xì)顆粒狀，見圖1。正常胃黏膜組織中FOXD3蛋白陽性表達(dá)率明顯高于胃癌組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝54.446，P＜0.001），見表1。FOXD3蛋白的表達(dá)水平與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床TNM分期相關(guān)（P＜0.001），與患者性別、年齡以及腫瘤大小無相關(guān)性，見表2。

表1 傳統(tǒng)病理切片中CD44v6和FOXD3在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況

2.3 傳統(tǒng)病理切片中CD44v6和FOXD3蛋白在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性傳統(tǒng)病理切片中，CD44v6和FOXD3蛋白在胃癌組織的表達(dá)經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析處理后顯示：兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且兩者呈顯著負(fù)相關(guān)性（rs＝-0.276，P＜0.01）。

2.4 組織芯片標(biāo)本中CD44v6在胃癌及正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況及其與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系CD44v6在胃癌組織中陽性表達(dá)主要分布在癌巢外周或呈彌漫分布，脈管內(nèi)轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞也可見CD44v6的陽性表達(dá)。CD44v6在胃癌組織中陽性表達(dá)率明顯高于正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝7.461，P＜0.01），見表3。此結(jié)果與傳統(tǒng)病理切片中CD44v6的陽性表達(dá)結(jié)果基本一致。CD44v6在胃癌組織中的表達(dá)水平與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床TNM分期相關(guān)（P＜0.05），與患者性別、年齡以及腫瘤大小無相關(guān)性，見表4。

表2 傳統(tǒng)切片中CD44v6和FOXD3蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)間關(guān)系（n）

2.5 組織芯片標(biāo)本中FOXD3在胃癌及正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況及其與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系FOXD3蛋白陽性表達(dá)率在正常胃黏膜組織中明顯高于胃癌組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝41.153，P＜0.001），見表3。此結(jié)果與傳統(tǒng)病理切片中FOXD3的陽性表達(dá)結(jié)果基本一致。FOXD3蛋白的表達(dá)水平與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床TNM分期相關(guān)（P＜0.05），而與患者性別、年齡以及腫瘤大小無相關(guān)性，見表4。

表3 組織芯片標(biāo)本中CD44v6和FOXD3蛋白在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況

2.6 組織芯片標(biāo)本胃癌組織中CD44v6和FOXD3蛋白表達(dá)的相關(guān)性組織芯片標(biāo)本中，CD44v6和FOXD3蛋白在胃癌組織中的表達(dá)經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析后顯示：兩者表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且兩者呈顯著負(fù)相關(guān)性（rs＝-0.585，P＜0.001）。此結(jié)果與傳統(tǒng)病理切片結(jié)果基本一致。

3 討論

研究［5-6］表明，CSCs可能是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和放化療治療抵抗的主要原因。腫瘤的治療過程中，CSCs的不完全消滅能夠引起腫瘤的復(fù)發(fā)。由CSCs理論可知，當(dāng)前的腫瘤治療應(yīng)該針對(duì)CSCs，只有完全殺死CSCs，使腫瘤的增殖能力下降，導(dǎo)致腫瘤退化、消失，從而達(dá)到真正治愈腫瘤的目的。

最近的研究［7］顯示，在胃癌細(xì)胞株中存在CD44+和CD44-細(xì)胞亞群，CD44+細(xì)胞成瘤能力遠(yuǎn)高于CD44-細(xì)胞，且具有自我更新和抵抗放化療能力。支持CD44作為胃癌干細(xì)胞的重要標(biāo)記物，可用于識(shí)別胃癌干細(xì)胞。在胃癌細(xì)胞系SCG-7901中，如果敲除CD44v6基因，腫瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲能力明顯受到抑制［8］。CD44v6可能誘導(dǎo)了胃癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。FOXD3最早是在1996年由Sutton et al［3］從小鼠胚胎瘤細(xì)胞文庫中分離，證實(shí)FOXD3可以維持胚胎的發(fā)育并保持胚胎干細(xì)胞的多能性，這一作用很可能是其作為一種轉(zhuǎn)錄抑制子，通過抑制胚胎干細(xì)胞中起分化作用基因的轉(zhuǎn)錄來維持胚胎干細(xì)胞的多能性。隨著對(duì)FOXD3在CSCs中的不斷深入研究，其與胃癌關(guān)系的研究也備受關(guān)注。

表4 組織芯片標(biāo)本中CD44v6和FOXD3蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)間關(guān)系（n）

本研究通過免疫組化法檢測(cè)并分析CD44v6和FOXD3與胃癌生物學(xué)行為的關(guān)系，結(jié)果顯示無論是傳統(tǒng)病理切片還是組織芯片標(biāo)本，CD44v6蛋白表達(dá)均隨著腫瘤浸潤程度的加深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)而增強(qiáng)且Ⅲ～Ⅳ期陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期，F(xiàn)OXD3蛋白表達(dá)則隨著腫瘤浸潤程度的加深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)而減弱且Ⅲ～Ⅳ期陽性率低于Ⅰ～Ⅱ期，兩者均與患者性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)。研究［9］顯示CD44v6是通過AKT信號(hào)通路的介導(dǎo)，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長，與多種惡性腫瘤相關(guān)。在卵巢癌中，CD44v6通過介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的黏附和遷移引起腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，且與腫瘤的復(fù)發(fā)有關(guān)［10］。CD44v6與胃癌生物學(xué)行為關(guān)系密切。研究［11］表明，F(xiàn)OXD3的表達(dá)下調(diào)RhoA-ROCK信號(hào)，抑制黑色素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。FOXD3的表達(dá)受到絲氨酸-蘇氨酸激酶（B-RAF）抑制，作為細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子抑制黑色素細(xì)胞的形成，進(jìn)而影響腫瘤的形成［12］。在胃癌中，F(xiàn)OXD3可能通過負(fù)調(diào)控RhoA-ROCK信號(hào)通路抑制胃癌的浸潤及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。張沖等［13］提出，幽門螺桿菌（HP）感染促進(jìn)胃組織腸上皮化生，誘導(dǎo)CD44v6的表達(dá)；螺桿狀HP及其球形體感染會(huì)導(dǎo)致胃黏膜中CD44v6表達(dá)的增加，進(jìn)一步導(dǎo)致胃癌的發(fā)生［14］。CD44v6和FOXD3的表達(dá)在胃癌形成過程中可能具有負(fù)相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，與推測(cè)結(jié)果一致。

目前，越來越多的證據(jù)［1，5］表明，腫瘤是一種干細(xì)胞疾病，是由CSCs增殖分化而來，CD44v6在CSCs研究中起到十分重要的作用。但就國內(nèi)外研究現(xiàn)狀看來，CD44v6作為CSCs特異性標(biāo)志物能否分離出CSCs尚不明確，其在腫瘤細(xì)胞中所起作用仍有待進(jìn)一步證實(shí)。CSCs與干細(xì)胞十分相似，且許多干細(xì)胞因子在多種CSCs中均有表達(dá)，提示干細(xì)胞因子可能是有價(jià)值的CSCs表面標(biāo)記物。FOXD3是一種干細(xì)胞因子，并且在決定胚胎干細(xì)胞正常還是惡性，增殖還是分化過程中起關(guān)鍵作用。根據(jù)目前的相關(guān)研究推測(cè)FOXD3可能是繼CD44v6另一種特異性胃癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物，并且在胃癌發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移、分化增殖及凋亡中發(fā)揮重要的作用。FOXD3與CD44v6協(xié)同作用有利于純化CSCs，進(jìn)而對(duì)CSCs進(jìn)行靶向治療從而達(dá)到治愈腫瘤的目的。但至今國內(nèi)外對(duì)FOXD3的研究較少，仍需大量的實(shí)驗(yàn)闡明FOXD3的作用機(jī)制及其與腫瘤的關(guān)系。

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The expression and clinical significance of CD44v6 and FOXD3 in human gastric carcinoma

Chen Yong1，Zhang Hong1，Wu Mengjie2，et al
（1Dept of Pathology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Pathology，The Affiliated Fuyang Hospital of Anhui Medical University，F(xiàn)uyang 236000）

ObjectiveTo research the expressions of CD44v6 and FOXD3 protein in human gastric cancer tissue and the relation with the biologic behavior of gastric carcinoma.MethodsThe expressions of CD44v6 and FOXD3 in human gastric cancer and gastric normal tissue（100 cases of human gastric cancer，40 cases of gastric normal tissues and 110 cases of gastric cancer microarray）were detectd by immunohistochemistry Envision two step method.ResultsThe positive expression rate of CD44v6 in gastric cancer and nomal gastric tissue were respectively 88% and 22.5%（P＜0.001）in traditional tissue species，which were related with the depth of infiltration，the transfer of lymph gland and clinical stages（P＜0.001）.In the gastric cancer tissue and normal tissue adjacent to carcinoma，the expression rates of FOXD3 were respectively 22%and 90%（P＜0.001），which were also related with the depth of infiltration，the transfer of lymph gland and clinical stages（P＜0.001）.The relation between the expressions of CD44v6 and FOXD3 was significantly nagtively correlated（rs＝-0.276，P＜0.01）.The expression Results of CD44v6 and FOXD3 in gastric cancer tissue microarray were similar with that in the traditional pathologic section.ConclusionAs a stem cell，it is possible that FOXD3 serves as a marker of gastric stem cells concerning its relation with the biologic behavior of gastric cancer and its correlation with FOXD3.

CD44v6；FOXD3；gastric cancer；stem cell；immunohistochemistry；tissue microarray

R 735.2；R 341.32

A

1000-1492（2015）12-1795-05

時(shí)間：2015-11-18 10：12：35

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.040.html

2015-09-30接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：090413118）

1安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，合肥 230032

2安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽醫(yī)院病理科，阜陽 236000

3吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，吉首 416000

4安徽人口職業(yè)學(xué)院，池州 247100

陳 勇，女，碩士研究生；

張 紅，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：ayzhanghong2013＠126.com