轉(zhuǎn)基因水稻多重PCR和Real—time PCR定性檢測(cè)中的問題與策略

仇娟

摘要：隨著轉(zhuǎn)基因水稻研究在世界范圍內(nèi)的研究和開發(fā)，以及轉(zhuǎn)基因水稻商業(yè)化的爭(zhēng)議性加劇，相關(guān)部門對(duì)糧食安全、食品安全更加關(guān)注，農(nóng)業(yè)科研單位檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻也將具有重要意義。參照農(nóng)業(yè)部的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)書和轉(zhuǎn)基因PCR檢測(cè)中的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，對(duì)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中可能出現(xiàn)的問題進(jìn)行了技術(shù)層面和理論層面分析;同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的啟動(dòng)子、終止子、內(nèi)參基因、靶基因等幾個(gè)元件的檢測(cè)分別進(jìn)行探討，并重點(diǎn)分析了啟動(dòng)子和終止子的檢測(cè)工作，根據(jù)研究者的工作經(jīng)驗(yàn)報(bào)道，從植物病毒學(xué)原理和植物基因工程的理論角度，提出了對(duì)轉(zhuǎn)基因PCR定性檢測(cè)中可能遇到問題的解決方案。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因水稻;定性檢測(cè);啟動(dòng)子;終止子;Bt基因;多重PCR;Real-time PCR

中圖分類號(hào)：Q78;S511 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）02-0262-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.002

Problems and Strategies Qualitatively Detecting Genetically-modified Rice with Multiplex PCR and Real-time PCR

QIU Juan

（Food Crops Research Institute，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

Abstract： As genetically-modified（GM） rice will be commercialized， qualitatively detecting GM rice becomes more and more important. Based authors practice in detecting of ?transgenic Bt ?rice with the quality standard of Chinese Ministry of Agriculture， the potential problems were analyzed from technical level and theoretical perspective. The detection of transgenic components （promoter， terminator， reference gene and target gene etc） of GM rice with PCR was discussed. The possible solutions were proposed from the principles of plant virology and genetic engineering based on previous reports.

Key words：genetically-modified（GM） rice;qualitative detection;promoter;terminator;Bt gene;multiplex PCR;real-time PCR

轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于作物以來，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品如玉米、大豆、棉花等都已有商業(yè)化的品種問世;目前在世界上使用最多的轉(zhuǎn)基因商業(yè)化基因是抗除草劑基因和Bt殺蟲基因。而水稻作為一種主糧，商業(yè)化步伐遠(yuǎn)遠(yuǎn)慢于這幾種作物;目前最有可能商業(yè)化的轉(zhuǎn)Bt殺蟲基因的是中國與國際水稻所合作研制的“華恢1號(hào)”、“Bt汕優(yōu)63”和歐洲研制的富含維生素A的Golden rice[1，2]。

自從國家給轉(zhuǎn)基因水稻發(fā)放了安全證書，轉(zhuǎn)基因水稻的商業(yè)化成為了熱門的議題。目前農(nóng)業(yè)部發(fā)放安全證書的轉(zhuǎn)基因水稻有抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻“華恢1號(hào)”和“Bt汕優(yōu)63”，國家制定了關(guān)于作物和轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)[1，3]。國家質(zhì)量檢測(cè)部門有完善的種子和食品檢測(cè)系統(tǒng)，來定性檢測(cè)是否含有轉(zhuǎn)基因成分。但是隨著轉(zhuǎn)基因水稻即將大規(guī)模的種植，科研人員在研究和育種過程也有大量的樣品需要檢測(cè)，主要目的有以下幾個(gè)：①更好地進(jìn)行常規(guī)品種轉(zhuǎn)基因育種工作，防止轉(zhuǎn)基因的品種污染常規(guī)品種，保持種質(zhì)的純合，同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的水稻在田間有沒有發(fā)生漂移;②節(jié)省人力物力，大量的水稻樣品送到專門的質(zhì)檢部門檢測(cè)價(jià)格昂貴;③有些檢測(cè)樣品中的轉(zhuǎn)基因成分元件，是超出國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)范圍的。

轉(zhuǎn)基因作物和轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)方法有很多，例如PCR、Southern Blot、基因芯片等[4-7]。常規(guī)和便捷的方法是普通PCR以及由其衍生出的半定量PCR方法[8，9];在國內(nèi)外使用的最多定性作用更強(qiáng)的是Real-time PCR[10-12]。多重PCR檢測(cè)方法被廣泛使用[4]。本文根據(jù)自己的一些實(shí)踐，總結(jié)出了在食品檢驗(yàn)、科研或者育種工作中進(jìn)行多重PCR檢測(cè)分析轉(zhuǎn)基因樣品中的幾個(gè)要點(diǎn)。

1 ?污染源的杜絕

轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中，只有杜絕一切污染源，才有可能在后續(xù)的檢測(cè)中做出正確的判斷。如果沒有做好防止污染，很容易出現(xiàn)假陰性和假陽性。因此所有的試劑須新鮮現(xiàn)配、滅菌，槍頭、離心管等要嚴(yán)格滅菌，玻璃器皿需要清洗干凈[13]。樣品必須防止交叉污染，條件允許的話，可以進(jìn)口高質(zhì)量的離心管、槍頭等，以便在后續(xù)的試驗(yàn)中起到排除污染的作用[12]。

2 ?樣品DNA的提取方法

DNA的提取方法既可以采用經(jīng)典的CTAB方法，也可以按照農(nóng)業(yè)部的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)書的方法，這兩種方法用于PCR和半定量PCR、Real-time熒光定量PCR都有很好的結(jié)果[3，14];條件允許的話，也可以采用試劑盒。有學(xué)者采用快速提取法獲得的轉(zhuǎn)基因番茄DNA，用于Real-time PCR檢測(cè)，取得了很好的結(jié)果;鑒于這一點(diǎn)，快速方法提取的轉(zhuǎn)基因水稻DNA，也應(yīng)該可以適用于Real-time PCR的檢測(cè)，這就為檢測(cè)大量的水稻DNA樣品提供了便捷的途徑[3，15-17]。Cankar等[18]、Demeke等[19]在水稻轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的實(shí)踐中，采取適用于RFLP分子標(biāo)記檢測(cè)的水稻DNA快速提取法，取得了比較好的效果。endprint

3 ?轉(zhuǎn)基因水稻的多重PCR檢測(cè)

根據(jù)農(nóng)業(yè)部的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)書，采用的是多重PCR和Real-time PCR的方法。在轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)中，有4個(gè)檢測(cè)元件：?jiǎn)?dòng)子、終止子、靶基因、內(nèi)參基因。轉(zhuǎn)基因的定性檢測(cè)中，首先要檢測(cè)的是內(nèi)參基因，因?yàn)閮?nèi)參基因能確定DNA模板的質(zhì)量;然后是檢測(cè)啟動(dòng)子和終止子，在檢測(cè)出啟動(dòng)子或者終止子以后，還要進(jìn)一步檢測(cè)靶基因。只有兩個(gè)以上的轉(zhuǎn)基因元件被檢測(cè)出，才能定性為轉(zhuǎn)基因的水稻[3，4，9，20]。

3.1 ?內(nèi)參基因的檢測(cè)

在定性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻中，會(huì)設(shè)置內(nèi)參基因，農(nóng)業(yè)部的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)書采用的是水稻sps（蔗糖磷酸合成酶）基因[3，21];也可以采用常規(guī)試驗(yàn)中經(jīng)常用的水稻β-Actin基因的引物（在不同的物種中高度保守，組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定內(nèi)參基因的檢測(cè)），可以對(duì)模板進(jìn)行定性為水稻的DNA，同時(shí)可以根據(jù)PCR產(chǎn)物條帶的亮度來確定模板的質(zhì)量。

3.2 ?啟動(dòng)子的檢測(cè)

3.2.1 ?CaMV 35S啟動(dòng)子的檢測(cè) ?根據(jù)農(nóng)業(yè)部制定的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)書，在目前的轉(zhuǎn)基因水稻中的定性檢測(cè)一般檢查的是花椰菜病毒35S啟動(dòng)子。早期的水稻轉(zhuǎn)基因多采用這個(gè)啟動(dòng)子，這次農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)的“Bt汕優(yōu)63”也是采用的CaMV 35S啟動(dòng)子。

3.2.2 ?含CaMV 35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻和病毒感染的定性區(qū)分 ?轉(zhuǎn)基因食品中CaMV 35S啟動(dòng)子中有一個(gè)關(guān)鍵性問題就是區(qū)別轉(zhuǎn)基因與病毒感染和污染[22-24]。在食品的安檢和十字花科蔬菜的轉(zhuǎn)基因定性檢測(cè)中，通常會(huì)檢測(cè)是否有CaMV 35S啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因元件還是被花椰菜病毒感染了[22]。但是在確定沒有污染的情況下，檢測(cè)出35S啟動(dòng)子并不能定性樣品含有轉(zhuǎn)基因成分?；ㄒ瞬《緯?huì)感染很多十字花科的蔬菜，病毒基因組也會(huì)整合到其侵染的植物基因組里面（感染水稻的可能性很?。?，在這種情況下，可以根據(jù)花椰菜病毒的外殼蛋白基因或復(fù)制酶基因設(shè)計(jì)特異性引物，也可以根據(jù)被花椰菜病毒感染后的特殊產(chǎn)物設(shè)計(jì)特異性引物，在轉(zhuǎn)錄水平上來定性是含CaMV 35S啟動(dòng)子成分的樣品還是被花椰菜病毒感染了[25-31]。在一般情況下，水稻并不是花椰菜病毒的宿主，被感染的可能性不大，因此，這項(xiàng)檢測(cè)只有在質(zhì)量檢測(cè)要求特別嚴(yán)格的情況下會(huì)被采用。同時(shí)，通過定量熒光Real-time PCR也可以排除樣品是被花椰菜病毒感染或者污染還是轉(zhuǎn)基因，具體的方法參見后文關(guān)于熒光PCR定量檢測(cè)的內(nèi)容[3，10]。

3.2.3 ?其他啟動(dòng)子 ?隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，更多被農(nóng)業(yè)科學(xué)家采用的是組織特異性的啟動(dòng)子，例如新一代的轉(zhuǎn)基因水稻就是采用組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子[32]。因此，隨著轉(zhuǎn)基因水稻品種越來越多，更多種類的啟動(dòng)子檢測(cè)將會(huì)出現(xiàn)在質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)中[33]。

3.3 ?終止子的檢測(cè)

3.3.1 ?植物基因工程的原理 ?根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒和發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒，其特定部位能與植物的DNA發(fā)生整合，因此常被用作植物基因工程中的載體。

3.3.2 ?Nos終止子 ?在轉(zhuǎn)基因植物中，常采用Nos終止子來構(gòu)建載體，“華恢1號(hào)”和“Bt汕優(yōu)63”也是采用的Nos終止子， 因此可以按照農(nóng)業(yè)部的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)書用PCR定性檢測(cè)Nos終止子[3，34]。Nos終止子是農(nóng)桿菌菌株Ti質(zhì)粒的T-DNA上的胭脂堿合成酶的終止子。胭脂堿屬于冠癭堿，在與植物共生或者轉(zhuǎn)化植物以后，會(huì)釋放出對(duì)植物有害的毒素，因此在Ti質(zhì)粒上構(gòu)建載體的過程中，會(huì)剪切掉這個(gè)基因，但是會(huì)保留這個(gè)基因的終止子（Nos），并通常用這個(gè)Nos終止子作為轉(zhuǎn)基因的終止子[35]。

3.3.3 ?其他終止子 ?植物轉(zhuǎn)基因的構(gòu)建方法表明，轉(zhuǎn)基因載體基本采用的是農(nóng)桿菌T-DNA上的冠癭堿的終止子。農(nóng)桿菌的不同菌株含有不同Ti質(zhì)粒，其包含的T-DNA上的冠癭堿也不同。例如，農(nóng)桿菌菌株LBA4404的毒性區(qū)來自章魚堿型質(zhì)粒，農(nóng)桿菌菌株GV3101的毒性區(qū)來自胭脂堿型質(zhì)粒，農(nóng)桿菌菌株EA101、EA105的毒性區(qū)來自琥珀堿型質(zhì)粒。冠癭堿有4種類型：章魚堿（Octopine）、胭脂堿（Nopaline）、農(nóng)桿堿（Agropine）、琥珀堿（Succinamopine），其終止子分別為 Ocs、Nos、Ags、Sus。在基因工程上最常用的是上面提到的胭脂堿型質(zhì)粒和它的Nos終止子，其次就是章魚堿型質(zhì)粒和它的Ocs終止子[36-38]。因此在轉(zhuǎn)基因的定性檢測(cè)中，可以根據(jù)每個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用的質(zhì)粒和構(gòu)建方法的不同，設(shè)計(jì)別的終止子引物，例如Ocs終止子的引物[35]。

3.4 ?靶基因的檢測(cè)

最近中國頒發(fā)安全證書的“Bt汕優(yōu)63”和“華恢1號(hào)”都是轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻，是高抗鱗翅目害蟲轉(zhuǎn)基因水稻品系;含有Bt融合型殺蟲蛋白基因Cry1Ac/Cry1Ab[1]。對(duì)這兩種轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)，需要根據(jù)Bt融合殺蟲蛋白的基因來設(shè)計(jì)引物。

隨著越來越多的轉(zhuǎn)基因水稻將要獲批準(zhǔn)上市，農(nóng)業(yè)科研單位在種質(zhì)創(chuàng)新和科研中的需要，會(huì)有更多的農(nóng)用基因在檢測(cè)中出現(xiàn)[33]。

3.5 ?標(biāo)記基因的檢測(cè)

在轉(zhuǎn)基因水稻中常會(huì)含有GUS基因、抗生素基因、除草劑等標(biāo)記基因，因此也可以對(duì)這些轉(zhuǎn)基因元件進(jìn)行檢測(cè);但是隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，在現(xiàn)階段轉(zhuǎn)基因育種中，標(biāo)記基因在后期的工作中通常用共轉(zhuǎn)化等方法被剔除掉，這樣剔除了標(biāo)記基因的品種才更安全，才會(huì)用于商業(yè)化[39，40]。因此，標(biāo)記基因的檢測(cè)在早期的轉(zhuǎn)基因篩選檢測(cè)中會(huì)用到，但是在后期的育種鑒定一般不會(huì)采用。不過也可以用在轉(zhuǎn)基因的后期工作中，鑒定品種是否進(jìn)一步剔除了標(biāo)記基因。

4 ?模板和引物endprint

根據(jù)農(nóng)業(yè)部的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)書，采用的是含有“Bt汕優(yōu)63”或“華恢1號(hào)”的DNA作為陽性模板，并采用CaMV 35S啟動(dòng)子、Nos終止子、Bt融合蛋白基因和內(nèi)參基因來檢測(cè)樣品;陽性模板應(yīng)該為單拷貝插入，這樣將便于在定量熒光PCR的分析。

由于樣品的不確定性，在進(jìn)行上述檢測(cè)以外，還可以采用別的模板和引物來檢測(cè)可能出現(xiàn)的其他種類的轉(zhuǎn)基因元件。例如Ocs終止子、抗除草劑基因、花椰菜病毒的基因、韌皮部特異性表達(dá)啟動(dòng)子等。如果沒有現(xiàn)成的水稻DNA模板，含有這些元件基因的質(zhì)粒也可以被選作模板，在做PCR的過程中，要根據(jù)試劑盒中的說明，水稻模板DNA和質(zhì)粒DNA要選擇不同的終濃度[41，42]。引物要送到技術(shù)質(zhì)量好的公司合成，模板要保證質(zhì)量和選擇的正確性，防止反應(yīng)出現(xiàn)假陰性、假陽性。

5 ?轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量Real-time PCR的定性分析作用

轉(zhuǎn)基因中的定量實(shí)時(shí)熒光PCR是為普通PCR做補(bǔ)充的。由于轉(zhuǎn)基因的普通PCR檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.1%[20]， 而且花椰菜病毒的35S啟動(dòng)子非常容易污染檢測(cè)樣品，在沒有別的辦法排除樣品被污染或病毒感染的情況下，實(shí)時(shí)熒光PCR可以提供非常好的分析數(shù)據(jù)[3，10，12]。以被含CaMV 35S啟動(dòng)子的外源物污染和被病毒感染的樣品為例，分析如下：第一，樣品被含有CaMV 35S啟動(dòng)子的外源物污染。這種情況下熒光PCR會(huì)檢測(cè)出35S啟動(dòng)子，但是其豐度會(huì)比單拷貝轉(zhuǎn)基因DNA陽性模板的豐度要低;第二，樣品被病毒感染。由于病毒一般不會(huì)感染植物的每個(gè)細(xì)胞，因此檢測(cè)出來的啟動(dòng)子豐度也會(huì)比單拷貝轉(zhuǎn)基因的DNA陽性模板要低。因此可以根據(jù)定量PCR來區(qū)分樣品是轉(zhuǎn)基因還是被污染或者被病毒感染了[9，10]。

6 ?小結(jié)

針對(duì)這次農(nóng)業(yè)部發(fā)放安全證書的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻品種“Bt汕優(yōu)63”和“華恢1號(hào)”的PCR定性檢測(cè)，可以選取含有啟動(dòng)子CaMV 35S、終止子Nos、含有Bt融合蛋白基因的轉(zhuǎn)基因水稻DNA作為陽性模板，選取非轉(zhuǎn)基因水稻DNA作為陰性模板，對(duì)水稻DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)。但這種檢測(cè)只能定性檢測(cè)出樣品是不是“Bt汕優(yōu)63”或“華恢1號(hào)”，國內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)室在轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)育種中，還生產(chǎn)了很多其他的轉(zhuǎn)基因水稻品種，采用的轉(zhuǎn)基因元件跟這兩個(gè)是不完全一樣的，甚至完全不一樣。對(duì)一個(gè)未知樣品完全定性確定是否為轉(zhuǎn)基因的水稻，還需要多設(shè)計(jì)出幾對(duì)引物（其他終止子、啟動(dòng)子、靶基因）進(jìn)行檢測(cè)。由于越來越多的轉(zhuǎn)基因品種并非采用的CaMV 35S的啟動(dòng)子，而且這個(gè)啟動(dòng)子在檢測(cè)中很容易受到污染和病毒感染的干擾，因此檢測(cè)終止子反而更為可靠。現(xiàn)有的報(bào)道結(jié)果表明，在構(gòu)建植物基因工程載體中，基本上采用的是農(nóng)桿菌的T-DNA上的冠癭堿的終止子（Nos終止子、Ocs終止子），因此，可以根據(jù)這些終止子設(shè)計(jì)引物組，對(duì)未知樣品進(jìn)行檢測(cè)。此外，本研究也可以在實(shí)踐中摸索出快速提取水稻DNA的方法，提取的DNA質(zhì)量可以適用于Real-time PCR和半定量常規(guī)PCR，可以為大量的轉(zhuǎn)基因水稻樣品檢驗(yàn)提供便捷。

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