高血壓頸動(dòng)脈斑塊陽(yáng)性患者miR—375表達(dá)檢測(cè)

李鴻翔　李近都　梁燁　李天資　藍(lán)家富　李清鋒

【摘要】目的探討miR-375在高血壓頸動(dòng)脈斑塊陽(yáng)性患者的表達(dá)變化情況及其臨床意義。方法檢測(cè)23例高血壓頸動(dòng)脈斑塊陽(yáng)性患者（實(shí)驗(yàn)組）的血壓和血清miR-375表達(dá)水平，并與12例健康者（對(duì)照組）比較。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組的收縮壓、舒張壓、頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度（IMT）和miR-375表達(dá)平均水平分別為（170.4±6.0）mmHg、（106.3±8.7）mmHg、（1.28±0.08）mm和（3.53±0.77），對(duì)照組分別為（132.2±3.8）mmHg、（86.4±6.6）mmHg、（0.83±0.17）mm和（2.36±0.76），實(shí)驗(yàn)組的收縮壓和舒張壓平均水平明顯高于對(duì)照組（P<001），miR-375表達(dá)的平均水平也明顯高于對(duì)照組（P<0.01）。結(jié)論miR-375或許作為致病因素，而不是保護(hù)因素參與高血壓頸動(dòng)脈斑塊陽(yáng)性疾病的發(fā)生和發(fā)展，miR-375過(guò)高表達(dá)對(duì)高血壓頸動(dòng)脈斑塊陽(yáng)性患者疾病可能有促進(jìn)作用。

【關(guān)鍵詞】原發(fā)性高血壓；頸動(dòng)脈斑塊陽(yáng)性；miR-375；基因調(diào)控

中圖分類(lèi)號(hào)：R544.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2015.01.004

高血壓頸動(dòng)脈斑塊陽(yáng)性是慢性血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一，其與慢性血管事件關(guān)系密切，研究表明，高血壓及其動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率和患病率呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅居民的生命健康，備受關(guān)注[1]。miR-375是一類(lèi)特異性高表達(dá)于胰腺組織的非編碼小RNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）和肌侵蛋白（myotrophin，MTPN）調(diào)控血管細(xì)胞的病理和生理，維持動(dòng)脈的正常機(jī)能，miRNA表達(dá)水平對(duì)其與靶基因結(jié)合的效率及其轉(zhuǎn)錄的活性有影響，并與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)聯(lián)[2～7]。為探討高血壓頸動(dòng)脈斑塊陽(yáng)性患者與miR-375表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性，本項(xiàng)研究檢測(cè)了23例高血壓患者（實(shí)驗(yàn)組）的頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度（IMT）和血清miR-375表達(dá)水平，并與12例健康者（對(duì)照組）比較，結(jié)果報(bào)道如下。1對(duì)象與方法1.1研究對(duì)象選取2014年1～5月在我院體檢部接受體檢者，符合下列條件：①連續(xù)2天檢測(cè)符合下列條件為患者：收縮壓≥140 mmHg或舒張壓≥90 mmHg即可診斷為高血壓[8]；②頸動(dòng)脈超聲測(cè)量頸總動(dòng)脈（CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）、頸外動(dòng)脈（ECA）內(nèi)IMT，其中IMT≥1.2 mm，≤1.4 mm者為斑塊陽(yáng)性。③排除血栓出血性疾病、糖尿病、免疫性疾病、嚴(yán)重感染、腫瘤、慢性中毒、繼發(fā)性高血壓。并經(jīng)閱讀《臨床實(shí)驗(yàn)觀察須知》，充分了解治療方法及其觀察措施，理解可能存在的風(fēng)險(xiǎn)，愿意配合治療和觀察，簽署《同意書(shū)》者入選為實(shí)驗(yàn)組，共23例，男13例，女10例，年齡50～60（54.5±3.0）歲。對(duì)照組12例，男7例，女5例，年齡51～59（54.3±3.0）歲，收縮壓<140 mmHg并舒張壓<90 mmHg，頸動(dòng)脈超聲測(cè)量CCA、ECA、ICA內(nèi)IMT，IMT<1.0 mm。

1.2 方法①血壓測(cè)量：使用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的電子血壓計(jì)，氣囊長(zhǎng)22～26 cm、寬12 cm的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格袖帶。受試者應(yīng)至少坐位安靜休息5分鐘，30分鐘內(nèi)禁止吸煙或飲咖啡，排空膀胱，取坐靠背椅，裸露上臂，上臂置于心臟水平，以Korotkoff第I音和消失音確定收縮壓和舒張壓水平。至少間隔5分鐘再測(cè)量1次，取2次讀數(shù)的平均值記錄。如果2次血壓值讀數(shù)相差≥5 mmHg，應(yīng)再次測(cè)量，取3次讀數(shù)的平均值記錄。②頸動(dòng)脈超聲檢查用儀器ALOKA-α10型超聲顯像系統(tǒng)，探頭頻率為7.5 MHz。受檢者取仰臥位，頭略向后伸，轉(zhuǎn)向被查的對(duì)側(cè)，充分暴露頸部。先從鎖骨內(nèi)側(cè)端橫向檢查頸總動(dòng)脈，然后沿胸鎖乳突肌外緣縱切掃查，依次顯示CCA、ICA、ECA和椎動(dòng)脈（VA）。

1.3 標(biāo)本的采集與處置研究對(duì)象空腹10 h以上于早晨7：00～8：00采集靜脈血，用靜脈真空采血管（BD 762165 PAX gene Blood RNA Tube，由上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司提供）采全血4 ml，血樣采集后，立即將采血管上下顛倒10次混勻，并于18℃～25℃正立放置至少2 h。先于-20℃放置24 h，然后轉(zhuǎn)移至-80℃保存，于1 M內(nèi)用RN23 RNA liquid超速全血（液體樣本）總RNA提取試劑盒提取RNA。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) miR-375的表達(dá)轉(zhuǎn)染48 h后，用Trizol試劑法提取總RNA。A260/A280為1.8～2.0之間方可用于檢測(cè)。取500 ng總RNA做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。試劑盒提供RT及qPCR通用引物，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)總體積為10 μL，包含cDNA模板1 μL（1∶10稀釋?zhuān)?、qPCR通用引物1 μL，反應(yīng)條件：95℃變性3 min，95℃作用5 s，62℃作用35 s，共40個(gè)循環(huán)，以U6為內(nèi)參照，結(jié)果分析采用2-△△Q方法，以此值表示miR-375的表達(dá)水平。反應(yīng)結(jié)束后由配套的計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算各反應(yīng)管內(nèi)的Ct值。miRNA的表達(dá)水平采用相對(duì)定量方法，以2-ΔΔCt表示每個(gè)miRNA的變化倍數(shù)，再將結(jié)果轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)形式，ΔCt=CtmiRNA-CtU6（以此表示相對(duì)表達(dá)量），ΔΔCt=ΔCt（高血壓組）-ΔCt（對(duì)照組）。

1.5 儀器和試劑盒 儀器：德國(guó)Biometra Tpersonal PCR，由上海恒久醫(yī)療器械有限公司提供；美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems

？倕 ）實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀Step OnePlusTM，由愛(ài)普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易（上海）有限公司提供。試劑盒：miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒，均由上海江萊生物科技有限公司提供。所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.6 miRNA-375的表達(dá)檢測(cè) 用qRT-PCR法：按miR-cute miRNA（吸附柱法）提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。引物序列由Prime premier 5.0軟件自行設(shè)計(jì)，miR-375上游引物CCCTCTAGACCCCAAGGCTGATGCTGAGAAG，下游引物AAAGGTCCGCCGCCCGGCCCCGGGTCTTC。endprint

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料組間比較用兩獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果實(shí)驗(yàn)組的收縮壓和舒張壓平均水平明顯高于對(duì)照組（P<0.01），miR-375表達(dá)的平均水平也明顯高于對(duì)照組（P<0.01），miR-375與IMT相關(guān)性分析結(jié)果為：r=0.580，t=3.364，P=0.002，提示miR-375或許作為致病因素，而不是保護(hù)因素參與高血壓頸動(dòng)脈斑塊陽(yáng)性疾病的發(fā)生和發(fā)展。見(jiàn)表1。

表1兩組血壓、IMT與miR-375表達(dá)水平比較（±s）

組別n收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）IMT（mm）miR-375實(shí)驗(yàn)組23170.4±6.0106.3±8.71.28±0.083.53±0.77對(duì)照組12132.2±3.886.4±6.60.83±0.172.36±0.76t-19.8906.93410.7504.269P-0.0000.0000.0000.000

3討論miR-375是近年發(fā)現(xiàn)的非編碼小RNA，起初認(rèn)為miR-375直接調(diào)控胰島組織中特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，參與調(diào)控基因及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響糖、脂代謝，對(duì)胰腺的形態(tài)、發(fā)育和功能有重要的作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，miR-375的靶基因和靶蛋白比較多，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)比較復(fù)雜，目前認(rèn)為miR-375在高血壓的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色。肌侵蛋白可與NF-κB相互作用，從而執(zhí)行調(diào)節(jié)NF-κB活性的作用。而肌侵蛋白誘導(dǎo)的高血壓血管細(xì)胞的生長(zhǎng)又由活化的NF-κB途徑介導(dǎo)。肌侵蛋白誘導(dǎo)的血管細(xì)胞的生長(zhǎng)與NF-κB的結(jié)合和活化密切相關(guān)，提示肌侵蛋白激活NF-κB的核轉(zhuǎn)運(yùn)，并且活化了高血壓基因的表達(dá)[9～11]。高血壓頸動(dòng)脈斑塊陽(yáng)性患者長(zhǎng)時(shí)間血壓升高引起的動(dòng)脈增生性病變，導(dǎo)致動(dòng)脈管壁增厚、僵硬而失去彈性和（或）管腔狹窄，由于其血液對(duì)血管壁的側(cè)壓力增加，損傷血管內(nèi)膜，平滑肌細(xì)胞變性，血漿脂質(zhì)滲入血管內(nèi)膜細(xì)胞，形成血管粥樣硬化，因此肌侵蛋白被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化起重要作用的效應(yīng)因子[12]。NF-κB通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)，在機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥及本病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要功能，NF-кB作為炎性反應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，在動(dòng)脈粥樣硬化中對(duì)白細(xì)胞介素-8和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的異常表達(dá)具有重要的啟動(dòng)作用[13～16]。

本研究結(jié)果顯示，高血壓頸動(dòng)脈斑塊陽(yáng)性患者miR-375表達(dá)的平均水平明顯高于對(duì)照組（P<001），miR-375與IMT密切相關(guān)，提示miR-375或許作為致病因素，而不是保護(hù)因素參與高血壓頸動(dòng)脈斑塊陽(yáng)性疾病的發(fā)生和發(fā)展，其過(guò)高表達(dá)對(duì)高血壓頸動(dòng)脈斑塊陽(yáng)性疾病可能有促進(jìn)作用，本課題組認(rèn)為，進(jìn)一步挖掘miR-375及其在高血壓頸動(dòng)脈斑塊陽(yáng)性疾病中的調(diào)控機(jī)制，尋找miR-375的調(diào)控基因以及靶基因，以miR-375為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)小分子物質(zhì)拮抗miR-375的作用，或許可以作為治療高血壓病的藥用靶向，對(duì)提高本病的防治效果，保障患者的生命質(zhì)量等有重要意義。參考文獻(xiàn)[1] Lahmy R，Soleimani M，Sanati MH，et al.MiRNA-375 promotes beta pancreatic differentiation in human induced pluripotent stem （hiPS） cells[J].Mol Biol Rep，2014，41（4）：2055-2066.

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（收稿日期：2014-12-05 修回日期：2015-01-27）

（編輯：潘明志）endprint