壯通飲對(duì)糖尿病腎病大鼠腎小球病理改變的影響

江旭鋒　曾慶春　劉軍杰　劉燕平　黃炳臣　黃永秩　黃岑漢

【摘要】目的實(shí)驗(yàn)性研究壯通飲（ZTY）對(duì)DN大鼠腎小球病理改變的影響。方法采用單腎切除合并腹腔空腹注射鏈脲佐菌素（STZ），建立DN大鼠模型，并隨機(jī)分為空白對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、西藥組和壯通飲低劑量組、中劑量組、高劑量組7個(gè)組。治療組每日灌胃，壯藥組用壯通飲（低劑量組6.8 g/kg，中劑量組13.6 g/kg，高劑量組27.2 g/kg），西藥組用卡托普利1 g/kg。于實(shí)驗(yàn)給藥治療6周后，檢測(cè)各組大鼠血糖、體重、右腎指數(shù)，且通過(guò)光鏡、透射電鏡觀察各組大鼠腎小球的病理改變。結(jié)果與空白對(duì)照組比較，假手術(shù)組各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)均無(wú)明顯差異（P>005）；模型組及各治療組24 h尿蛋白量、血糖、右腎指數(shù)及體重均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；HE、PAS染色及電鏡下，模型組與各治療組均出現(xiàn)不同程度的病理改變，其中模型組病理改變最明顯，腎小球明顯肥大、基底膜增寬、系膜區(qū)明顯增生，毛細(xì)血管腔明顯變窄，陽(yáng)性物質(zhì)明顯增多，系膜基質(zhì)明顯增多，腎小球內(nèi)毛細(xì)血管呈節(jié)段性硬化，毛細(xì)血管管腔狹窄，足細(xì)胞的足突融合、消失。與模型組比較，各治療組24 h尿蛋白量、血糖、右腎指數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），而體重雖有所改善，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）；HE、PAS染色及電鏡下，各治療組病理改變均有不同程度的減輕，其中壯通飲中劑量組減輕最為明顯。而各治療組之間，雖然壯通飲中劑量組各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)及病理改變的減輕、改善程度最為明顯，但與其他治療組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。結(jié)論壯通飲可以改善DN大鼠的一般情況，減輕腎小球病理學(xué)改變，對(duì)DN大鼠的腎臟具有一定的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】壯通飲；糖尿病腎??；腎小球；病理改變；實(shí)驗(yàn)研究

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.01.001

糖尿病腎?。―N）是糖尿?。―M）常見(jiàn)的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，隨著患者病情的發(fā)展，本病對(duì)腎臟具有不可逆的損害，終致腎功能衰竭及尿毒癥，致死致殘。伴同我國(guó)DM患病率的增長(zhǎng)與人口老齡化的趨勢(shì)[1]，潛在的DN患者數(shù)量也因此增加。壯通飲（ZTY）為民間壯藥方，以壯醫(yī)“人體三道兩路”理論為基礎(chǔ)，由扶芳藤、參三七和黃花倒水蓮3味壯藥組成，常用于治療“啊肉甜水毒”（糖尿病腎病水腫）。臨床已有應(yīng)用壯通飲治療高脂血癥、腦梗死[2，3]等，我們就壯通飲對(duì)DN大鼠腎小球病理改變的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，旨在為壯通飲臨床治療DN提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組SPF級(jí)純種SD大鼠140只，雌雄各半，體重（200±20）g，鼠齡4個(gè)月，檢疫合格，血糖正常，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（合格證編號(hào)：SCXK桂2009-000）。給予普通飼料、自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)取10只為空白對(duì)照組，20只為假手術(shù)組，其余為造模組。參照模型制備和成模標(biāo)準(zhǔn)[4]，將假手術(shù)組與造模組皆以10%水合氯醛3.0 ml/kg腹腔注射麻醉，但假手術(shù)組僅切開(kāi)皮層、肌層，不切除腎臟并縫合，而造模組結(jié)扎左腎門(mén)血管行左腎切除術(shù)并縫合，且于術(shù)后恢復(fù)2周后，禁食12 h，以2%鏈脲佐菌素 （STZ）溶液50 mg/kg，一次性腹腔注射造模。72 h后測(cè)尾靜脈血糖，其值≥16.7 mmol/L即為造模成功。之后繼續(xù)飼養(yǎng)1個(gè)月，造模組微量白蛋白>30 mg/d后，隨機(jī)取30只為模型組，其余為治療組（西藥組和壯通飲低劑量組、中劑量組、高劑量組）各20只。各治療組大鼠每日灌胃量為：壯通飲各組用壯通飲水煎液（低劑量組6.8 g/kg，中劑量組13.6 g/kg，高劑量組27.2 g/kg），西藥組用卡托普利液（10 mg/kg）。模型對(duì)照組與假手術(shù)組大鼠：用0.5% CMCNa，按“100 g/ml”大鼠體重與灌胃體積比灌胃。空白組不予處理。各組大鼠自由飲水和標(biāo)準(zhǔn)飲食，每天9：00～10：00一次性灌胃，連續(xù)灌胃用藥6周。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品及設(shè)備

1.2.1壯通飲水煎液及卡托普利液制備壯通飲水煎液：按中藥飲片（廣西柳州百草堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20131023）“扶芳藤∶黃花倒水蓮∶參三七=6∶4∶3”的用藥質(zhì)量比稱取，將三藥一并加適量蒸餾水浸泡過(guò)夜（參三七打成粉末并紗袋包裝），加熱至沸騰，改用文火煎煮1 h，濾出藥液，加水再次煎煮1 h，后將兩次煎液合并，且濃縮至含生藥為2.72 g/ml的壯通飲高劑量組濃度，然后依次取其適量體積，倍比稀釋至含生藥為1.36 g/ml、0.68 g/ml的壯通飲中劑量組、低劑量組濃度?？ㄍ衅绽海簩⒖ㄍ衅绽ㄒ?guī)格：25 mg/片，廣東臺(tái)城制藥股份有限公司，批號(hào)：20130302）研磨成粉末，按1 mg/ml的濃度配制。上藥均分裝滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2其他實(shí)驗(yàn)藥品與設(shè)備水合氯醛（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20130513）；鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：90513038）；目測(cè)尿蛋白試紙（廣州市花都高爾寶生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20130717），尿蛋白定量測(cè)試盒（由右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供）。日立7060全自動(dòng)生化分析儀（由右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供，型號(hào)：7600020）；安穩(wěn)血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）；HMIAS2000W高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析管理系統(tǒng)（由右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科提供，型號(hào)：LOGENEI）；透射電鏡（TEM，由廣西醫(yī)科大學(xué)提供，型號(hào)：日立H7650）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1一般情況的測(cè)定于末3次給藥后，連續(xù)收集3次各組大鼠的24小時(shí)尿液，用于檢測(cè)24 h尿蛋白量（24 h尿蛋白量=尿蛋白定量×24 h尿量）。于末次給藥后，給各組大鼠稱重并測(cè)尾靜脈血糖，禁食 （不禁水 ）10 h，行10%水合氯醛3.5 g/kg腹腔注射麻醉，取出右腎，剝離被膜稱右腎質(zhì)量，計(jì)算右腎指數(shù)（即右腎質(zhì)量與體重比，單位：mg/g）。endprint

1.3.2腎小球病理改變觀察取各組大鼠右腎，經(jīng)腎門(mén)縱向剖開(kāi)，用10%福爾馬林固定50%的腎組織、經(jīng)常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片，分別行HE、PAS染色，應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)各組大鼠腎小球的病理改變做光鏡分析。取各組大鼠腎皮質(zhì)1 mm3，常規(guī)透射電鏡制作樣本，超薄切片，應(yīng)用日立H7650型透射電鏡，放大倍數(shù)：10 000倍，常規(guī)觀察腎小球病理改變并攝片。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組計(jì)量資料的比較采用ANOVA檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1一般資料動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中，假手術(shù)組死亡6只、模型組死亡16只、西藥組死亡7只；壯通飲低劑量組、中劑量組、高劑量三組各死亡10只。死亡原因可能是感染、血糖過(guò)高，尤其是模型組無(wú)藥物的治療。

2.2壯通飲對(duì)DN大鼠一般情況的影響與空白組相比，假手術(shù)組一般情況的各項(xiàng)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組及各治療組24 h尿蛋白量、血糖及右腎指數(shù)均升高，體重均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組相比，西藥組與壯通飲低劑量組、中劑量組、高劑量組各組24 h尿蛋白量、血糖及右腎指數(shù)均有所改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而體重雖有所改善，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。且各治療組之間，24 h尿蛋白量、血糖、體重、右腎指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。其原因可能與DN大鼠治療時(shí)間短等因素有關(guān)。見(jiàn)表1。

表1壯通飲（ZTY）對(duì)DN大鼠24 h尿蛋白量、血糖、體重、右腎指數(shù)的影響（±s）

組別n24 h尿蛋白量（g/24h）血糖（mmol/L）體重（g）右腎指數(shù)（mg/g）空白組1020.18±9.386.29±0.38432.80±71.192.00±0.83假手術(shù)組1421.76±7.225.91±0.50446.21±88.232.22±0.45模型組1459.60±25.82a24.87±3.26a276.50±30.22a5.53±0.67a西藥組1340.95±5.67ab18.88±5.62ab311.38±43.63a3.86±1.49abZTY（低）1039.55±7.10ab20.11±4.87ab286.50±62.19a3.62±1.08abZTY（中）1038.65±6.05ab19.13±7.82ab305.30±37.84a3.42±1.16abZTY（高）1040.97±7.65ab20.18±5.55ab296.80±45.15a3.69±1.05ab注：各組與空白組相比，aP<0.01；各治療組與模型組相比，bP<0.05。

2.3壯通飲對(duì)DN大鼠腎小球病理改變的影響光鏡下：空白組與假手術(shù)組大鼠，HE染色見(jiàn)腎小球結(jié)構(gòu)清楚，基底膜完整，系膜區(qū)無(wú)增生，毛細(xì)血管腔開(kāi)放性良好；PAS染色見(jiàn)腎小球內(nèi)紅染物質(zhì)均勻分布。模型組大鼠，HE染色見(jiàn)腎小球明顯肥大，基底膜增寬，系膜區(qū)明顯增生，毛細(xì)血管腔明顯變窄；PAS染色見(jiàn)腎小球內(nèi)陽(yáng)性物質(zhì)明顯增多，系膜基質(zhì)明顯增多，腎小球內(nèi)毛細(xì)血管呈節(jié)段性硬化，毛細(xì)血管管腔狹窄。各治療組相對(duì)模型組，HE染色見(jiàn)腎小球內(nèi)病變均有所減輕，PAS染色見(jiàn)腎小球內(nèi)陽(yáng)性物質(zhì)均有不同程度的減少，腎小球內(nèi)毛細(xì)血管節(jié)段性硬化病變均有不同程度的減輕，病變的腎小球數(shù)量均有不同的減少，其中壯通飲中劑量組減輕程度最為明顯。見(jiàn)圖1A～G、圖2A～G。電鏡下：空白組與假手術(shù)組大鼠腎組織足細(xì)胞的足突排列整齊、分布均勻，附著于基底膜上；模型組大鼠足細(xì)胞的足突融合、消失，基底膜未見(jiàn)明顯增厚；各治療組相對(duì)模型組，其足細(xì)胞足突融合、消失均有所改善，其中壯通飲中劑量組改善最為明顯。見(jiàn)圖3A～G。

圖1各組大鼠腎組織HE染色（×400）。A：空白組；B：假手術(shù)組；C：模型組；D：西藥組；E：ZTY低劑量組；F：ZTY中劑量組；

G：ZTY高劑量組。

圖2各組大鼠腎組織PAS染色（×400）。A：空白組；B：假手術(shù)組；C：模型組；D：西藥組；E：ZTY低劑量組；F：ZTY中劑量組；

G：ZTY高劑量組。

圖3各組大鼠足細(xì)胞TEM觀察（×10 000）；A：空白組 ；B：假手術(shù)組；C：模型組；D：西藥組；E：ZTY低劑量組；F：ZTY中

劑量組；G：ZTY高劑量組。

3討論DN發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，迄今尚未完全闡釋清楚。目前對(duì)其機(jī)制的研究，大多從腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變、非酶糖基化、氧化應(yīng)激、多元醇通路的激活、細(xì)胞因子等方面進(jìn)行[5]。其臨床表現(xiàn)為早期腎小球?yàn)V過(guò)率升高，出現(xiàn)一過(guò)性微量蛋白尿，轉(zhuǎn)為中后期持續(xù)性大量蛋白尿、水腫、腎功能進(jìn)行性減退甚至衰竭。而出現(xiàn)這些臨床表現(xiàn)，大多是由于腎臟體積增大、腎小球?yàn)V過(guò)屏障損害、腎小球硬化等腎臟病理學(xué)改變引起。

在腎小球超微結(jié)構(gòu)中，足細(xì)胞是一種終末分化上皮細(xì)胞，無(wú)再生功能，為腎小球?yàn)V過(guò)屏障之一。足細(xì)胞損傷在DN發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，與蛋白尿的產(chǎn)生和腎小球硬化的發(fā)生關(guān)系密切[6]。血糖升高為糖尿病的主要臨床表現(xiàn)，也是引起DN的最主要原因。高血糖可以通過(guò)激活PI3K/Akt通路導(dǎo)致足細(xì)胞內(nèi)Ⅳ型膠原的表達(dá)，介導(dǎo)足細(xì)胞損傷[7]。足突為足細(xì)胞標(biāo)志性特征，足突的融合、消失是足細(xì)胞損傷的最后通路[8]。因此改善足突融合、消失的改變，可以減輕足細(xì)胞損傷。

壯通飲為壯醫(yī)傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)方，用藥精專(zhuān)，配伍嚴(yán)謹(jǐn)，已有研究發(fā)現(xiàn)本方有利于保護(hù)和延緩DM腎臟及心血管并發(fā)癥的進(jìn)展[9]。本實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，壯通飲可以改善DN大鼠24 h尿蛋白量、血糖、右腎指數(shù)及體重等一般情況，減輕腎小球病理改變，并有利于改善足突融合、消失，從而減輕足細(xì)胞的損傷，對(duì)DN大鼠的腎臟具有一定保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用壯通飲防治DN提供理論基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)[1] 王海鵬，孟慶躍.2000—2009年我國(guó)成年人診斷糖尿病流行趨勢(shì)分析[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2013，14（2）：132135.

[2] 劉燕平，黃岑漢.壯通飲治療濁脂瘀阻型高脂血癥56例[J].陜西中醫(yī)，2009，30（2）：169170.

[3] 陳曉鋒，王婧婧.壯通飲治療恢復(fù)期腦梗死60例臨床觀察[J].中西醫(yī)結(jié)合腦血管病，2013，11（8）：959960.

[4] 邢淑麗，鄭君芙，黃文政.單側(cè)腎切除STZ誘導(dǎo)糖尿病腎病大鼠動(dòng)物模型研究[J].中國(guó)中醫(yī)急診，2006，15（6）：643644.

[5] 林子桐，張超，沈雪梅.糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2014，28（5）：765773.

[6] 曾慶春，江旭鋒，劉軍杰，等.中醫(yī)藥治療糖尿病腎病作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，17（3）：5759.

[7] 邢玲玲，段惠軍，劉青娟，等.PI3/Akt通路在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞分泌Ⅳ型膠原中的作用[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2011，20（6）：559562.

[8] 李金紅，陶建瓴，李航.足細(xì)胞損傷與糖尿病腎病的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，32（5）：590596.

[9] 劉燕平，黃娜，藍(lán)嬌娜，等.壯藥通絡(luò)飲對(duì)糖尿病大鼠心、腎、腹主動(dòng)脈血管緊張素影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，35（6）：769770.

（收稿日期：2015-01-14修回日期：2015-01-31）

（編輯：梁明佩）endprint