鞘氨醇單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)韋蘭膠的研究

董學(xué)前，劉元濤，王偉，張永剛，武琳，吉武科，劉建軍

（1.山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，山東 濟南 250013；2.阜豐集團有限公司 山東 莒南 276600）

鞘氨醇單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)韋蘭膠的研究

董學(xué)前1，劉元濤2，王偉1，張永剛1，武琳1，吉武科1，劉建軍1

（1.山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，山東 濟南 250013；2.阜豐集團有限公司 山東 莒南 276600）

韋蘭膠（welan gum）是由鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas paucimobilis）分泌的一種可溶性胞外多糖。利用實驗室優(yōu)化篩選的一株韋蘭膠產(chǎn)生菌Sphingomonas sp.511，通過單因素實驗，研究了韋蘭膠發(fā)酵工藝條件，得出韋蘭膠適宜的發(fā)酵條件為：種齡15 h，接種量10%，裝液量80mL（500 mL搖瓶），初始pH 8.0，搖床轉(zhuǎn)速300 r/min，培養(yǎng)溫度32℃，發(fā)酵時間72 h，在此實驗基礎(chǔ)上進行10 L發(fā)酵罐的放大試驗，韋蘭膠產(chǎn)率為25.76 g/L。

韋蘭膠；鞘氨醇單胞菌；發(fā)酵工藝

韋蘭膠（welan gum）是由鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sp.）分泌的一種可溶性胞外多聚糖，其主鏈結(jié)構(gòu)由D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖重復(fù)單元構(gòu)成，側(cè)鏈由單一的L-吡喃鼠李糖基或L-吡喃甘露糖基構(gòu)成［1-2］，此外約半數(shù)的主鏈重復(fù)單元含有乙?；案视突鶊F［3-4］，平均分子量在400～2 000 kDa之間［5］。韋蘭膠溶液是一種典型的假塑性流體，與黃原膠相比，同等濃度下水溶液黏度高，特別是在低濃度下能保持較好的黏度；耐酸堿能力強，在pH 2～12范圍內(nèi)黏度幾乎保持不變；溫度對韋蘭膠溶液的黏度影響較?。?-7］，0.4%的黃原膠溶液在135℃時黏度已趨于零，但同等條件下韋蘭膠溶液在163℃時黏度才接近于零。另外韋蘭膠具有很好的兼容性，例如，當其與黃原膠復(fù)配使用時，表現(xiàn)出很強的協(xié)同增稠作用，且耐鹽、熱可逆性質(zhì)不受影響［8］。韋蘭膠溶液受剪切后稀化，作為膠體流變特性優(yōu)良，可作為增稠劑、黏合劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、潤滑劑和成膜劑被廣泛應(yīng)用，特別是在石油開采、混凝土、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域中具有較高的應(yīng)用價值［9］。韋蘭膠最早是由美國CP.Kelco公司研究開發(fā)［10］的一種新型微生物多糖，由于性能優(yōu)良，近幾年市場需求增長迅速，但國內(nèi)韋蘭膠生產(chǎn)領(lǐng)域還存在產(chǎn)率低，成本高，難以大規(guī)模推廣應(yīng)用的問題。開展韋蘭膠的生產(chǎn)工藝研究有助于降低韋蘭膠生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益。

近年來，韋蘭膠在國內(nèi)的研究逐步增多，但主要集中于實驗室研究階段，研究內(nèi)容主要為菌種選育、搖瓶培養(yǎng)基優(yōu)化、韋蘭膠流變學(xué)性質(zhì)及其影響因素等方面［11-15］，有關(guān)工業(yè)化生產(chǎn)的報道較少。本研究采用以Sphingomonas sp.ATCC31555為出發(fā)菌株篩選得到的韋蘭膠高產(chǎn)菌株Sphingomonas sp.511為生產(chǎn)菌，進行韋蘭膠發(fā)酵條件的優(yōu)化，有效提高了韋蘭膠發(fā)酵產(chǎn)率，并通過10 L發(fā)酵罐的驗證，最終獲得韋蘭膠的高產(chǎn)發(fā)酵條件，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種

菌株Sphingomonas sp.511是本實驗室利用Sphingomonas sp.ATCC31555為出發(fā)菌株篩選優(yōu)化的一株高產(chǎn)韋蘭膠的鞘氨醇單胞菌。

1.2 基本培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂粉20，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖20，酵母膏1，K2HPO42，MgSO4·7H2O 0.1，pH 7.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30，豆粕粉4，K2HPO42，MgSO4·7H2O 0.3，pH 7.5。

1.3 主要儀器與試劑

全自動發(fā)酵罐10 L（上海百倫生物科技有限公司）；NDJ-1黏度計（上海天平儀器廠）；紫外分光光度計（上海美析儀器有限公司）；pH計（德國賽多利斯集團）；恒溫培養(yǎng)搖床（上海知楚公司）。

1.4 方法

1.4.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：將保存菌種接到新鮮斜面培養(yǎng)基上活化，30℃恒溫培養(yǎng)3 d。將活化的斜面種子刮取兩環(huán)接入裝有100 m L種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速為300 r/min，溫度為30℃，培養(yǎng)12～16 h。

搖瓶培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液按10%（V/V）的接種量接入裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速為300 r/min，溫度為30℃，時間70～72 h。

1.4.2 菌種生長曲線的繪制

按照1.4.1中所述種子培養(yǎng)方法，每隔3 h取1 mL發(fā)酵液樣品，適當稀釋，在600 nm下測定OD值，繪制菌種生長曲線。

1.4.3 檢測方法

生物量測定：取5 mL發(fā)酵液并適當稀釋，置于已預(yù)先稱重的干燥離心管中，8 000 r/min離心20 min，棄上清，用去離子水洗滌2次，105℃烘箱內(nèi)烘至恒重，稱量即可。

殘?zhí)菧y定：3，5-二硝基水楊酸（DNS）法。

韋蘭膠含量測定：取一定體積的發(fā)酵液，加入2倍體積的95%乙醇，玻璃棒攪動至析出韋蘭膠，過濾得粗品，再用95%乙醇洗滌一遍，過濾，烘干至恒重，電子天平稱重。

發(fā)酵液黏度測定：使用NDJ-1黏度計，4號轉(zhuǎn)子，60 r/min室溫下測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種培養(yǎng)液對發(fā)酵過程的影響

2.1.1 菌種培養(yǎng)液菌種生長曲線

菌種培養(yǎng)過程中每隔3 h取樣，測定菌液中菌體濃度，得到菌種生長曲線如圖1。

圖1 種子生長曲線

由圖1可知，種子在經(jīng)過6 h的延滯期后達到對數(shù)生長期，24 h后種子進入生長穩(wěn)定期。

2.2.2種齡及接種量的選擇

一般接種發(fā)酵的最適種齡是微生物對數(shù)生長期的中后期，研究考察了培養(yǎng)12～24 h之間不同種齡的種子液對韋蘭膠合成的影響，結(jié)果如圖2所示。最適種齡為15 h，接種對數(shù)生長期后期（18～24 h）的種子液，發(fā)酵結(jié)果呈下降趨勢，這可能是因為15 h后菌體開始產(chǎn)膠，種子液黏度上升，被膠體包裹的菌體再次轉(zhuǎn)接后代謝活性受影響。接種量的大小一般取決于菌株在發(fā)酵液中的生長速度?？刂平臃N量在1%～15%之間，考察其對韋蘭膠合成的影響，結(jié)果如圖3所示。接種量小于10%時，膠產(chǎn)量與接種量接近線性關(guān)系，接種量大于10%時韋蘭膠產(chǎn)膠率保持在一定的水平且略有下降，因此選定10%的接種量為最佳。

圖2 種齡對韋蘭膠合成的影響

圖3 接種量對韋蘭膠合成的影響

2.2 溶氧對韋蘭膠發(fā)酵過程的影響

在好氧發(fā)酵過程中，發(fā)酵液溶氧高低是影響發(fā)酵過程的一個重要因素，特別是高黏度發(fā)酵液，發(fā)酵液溶氧量往往是發(fā)酵進程的制約因素。本文通過控制裝液量考察溶氧對韋蘭膠合成的影響，將500 mL搖瓶的裝液量控制在40～180 mL之間，結(jié)果如圖4所示。裝液量小于80 mL時，產(chǎn)膠率和發(fā)酵液黏度較高，隨著裝液量的增加，產(chǎn)量變化不大，而發(fā)酵液黏度下降明顯，隨著裝液量的增加，氧的傳遞受到限制，影響了韋蘭膠的生物合成。因此，選取80mL為最適裝液量。

圖4 裝液量對韋蘭膠合成的影響

2.3 發(fā)酵液初始pH對韋蘭膠發(fā)酵過程的影響

將發(fā)酵液初始pH控制在6.0～9.0之間，結(jié)果如圖5所示。發(fā)酵液的初始pH在6.0～8.0之間時，產(chǎn)膠率和發(fā)酵液黏度隨pH的升高而增加；在pH高于8.0以后，產(chǎn)膠率和發(fā)酵液黏度值則隨著pH的增加有所下降，因此，選擇初始pH為8.0。

圖5 發(fā)酵液初始pH對韋蘭膠合成的影響

2.4 溫度對韋蘭膠發(fā)酵過程的影響

溫度對于菌體的生長及代謝活性影響極為顯著。將發(fā)酵溫度分別控制在28～36℃范圍內(nèi)，考察溫度對韋蘭膠發(fā)酵過程的影響，結(jié)果如圖6所示。該菌株在此溫度范圍內(nèi)均能生長發(fā)酵，以32℃為最佳，產(chǎn)膠率和發(fā)酵液黏度最高。這一結(jié)果與以前普遍采用的30℃發(fā)酵有顯著區(qū)別［14，16-17］，很可能是由于菌株間的差異導(dǎo)致。

2.5 10L發(fā)酵罐中韋蘭膠分批發(fā)酵特征

采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基和工藝條件，進行10 L發(fā)酵罐發(fā)酵實驗，裝液量7 L，通風(fēng)比1∶1 vvm，發(fā)酵初期攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min，隨著發(fā)酵的進行，黏度上升，適當增加攪拌轉(zhuǎn)速。韋蘭膠分批發(fā)酵過程曲線見圖7。菌體生長有明顯的延滯期，在6 h后進入對數(shù)生長期，韋蘭膠的合成開始于12 h左右，底物開始快速消耗，符合產(chǎn)物合成與菌體生長部分偶聯(lián)的特征［18］。發(fā)酵進入后期（48 h后），由于發(fā)酵液黏度高且基質(zhì)濃度較低，消耗速率下降，韋蘭膠合成速率顯著變慢，在48 h之前產(chǎn)生的韋蘭膠占合成總量的70%以上。韋蘭膠含量在發(fā)酵72 h左右達到最高，最終產(chǎn)率為25.76 g/L。

圖6 溫度對韋蘭膠合成的影響

圖7 發(fā)酵罐中韋蘭膠分批發(fā)酵過程曲線

3 總結(jié)

以實驗室篩選優(yōu)化的Sphingomonas sp.511作為韋蘭膠生產(chǎn)菌株，優(yōu)化了發(fā)酵生產(chǎn)韋蘭膠的工藝，確定最佳發(fā)酵條件為：種齡15 h，接種量10%，裝液量80 mL（500 mL搖瓶），初始pH 8.0，搖床轉(zhuǎn)速300 r/min，培養(yǎng)溫度32℃，發(fā)酵時間72 h。在上述實驗基礎(chǔ)上在10 L發(fā)酵罐中開展發(fā)酵實驗，裝液量7 L，通風(fēng)比1∶1，發(fā)酵初期攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min，并在發(fā)酵過程通過增加攪拌轉(zhuǎn)速提高溶氧，韋蘭膠最終產(chǎn)率可達到25.76 g/L，比優(yōu)化前顯著提高，為后續(xù)中試放大研究奠定了基礎(chǔ)。

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（責任編輯：朱小惠）

Study on fermentation of welan gum by Sphingomonas sp.

DONG Xueqian1，LIU Yuantao2，WANGWei1，ZHANG Yonggang1，WU Lin1，JIWuke1，LIU Jianjun1
(1.Key Laboratory of Food and Fermentation Engineering of Shandong Province，Jinan 250013，China；2.Fufeng Group Co.，Ltd.，Junan 276600，China)

Welan gum is a soluble exopolysaccharide produced by Sphingomonas sp.The fermentation conditionswere optimized by single-factor experiments using a welan gum producing strain Sphingomonas sp.511 screened in our laboratory.The optimal fermentation conditionswere as follows：inoculum age 15 h，inoculum volumn 10%(V/V)，medium volumetric ratio 16%(V/V)，initial pH value 8.0，rotate speed 300 r/min，culture temperature 32℃and fermentation period 72 h.The scale-up test was carried out under these conditions and the concentration of welan gum reached 25.76 g/L.

welan gum；Sphingomonas sp.；fermentation

TQ92

A

1674-2214(2015)04-0030-04

2015-06-19

董學(xué)前（1978—），男，山東惠民人，高級工程師，研究方向為微生物發(fā)酵工程，E-mail：dxqn@163.com.