生物素類活性探針在酶分離中的應用研究進展

朱，俞家俊，應向賢

（浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州 310014）

生物素類活性探針在酶分離中的應用研究進展

（浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州 310014）

酶是一類具有重要意義的生命活性物質(zhì)，而如何高效快速地從生物體內(nèi)提取目的酶已成為生物學領(lǐng)域的一個關(guān)鍵性問題。近年來，越來越多的研究將蛋白質(zhì)組學的熱門技術(shù)——活性探針技術(shù)運用于酶的分離純化中。對近年來研究得最多的鏈霉素親和層析相關(guān)的活性探針技術(shù)應用于酶分離的研究進行了綜述，并例舉了絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、脯氨?；央拿?、組蛋白脫乙酰酶的分離技術(shù)及其機理。

活性探針；酶分離；鏈霉素親和層析

酶是生物體內(nèi)重要的活性物質(zhì)，幾乎所有的生命活動都需要酶的參與［1］，酶的研究對生命科學有重要的意義。同時在發(fā)酵工程領(lǐng)域，從微生物中分離提取酶對產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也具有重大的促進作用。傳統(tǒng)的方法過程比較繁瑣，尤其是酶與雜蛋白的分離過程，要分別鑒定分離后的酶是否為目標酶，而且還存在有的酶在細胞或者菌株中含量比較低，其他的雜質(zhì)比較多，酶本身易失活等缺點。因此作為一種更加有效的純化方法——活性探針技術(shù)被越來越多地應用于快速篩選和分離提取酶［2］。

1 活性探針的定義

活性探針，又名為機制探針，是指能直接檢測酶的活性位點的化學探針［3］，被廣泛應用于酶檢測與分離中?；钚蕴结樦饕扇糠纸M成［4］（如圖1）：活性基團、報告基團、連接基團。

圖1 活性探針的組成

活性基團通過共價修飾靶標蛋白的氨基酸殘基或與之有強烈親和力的殘基，使得探針分子和靶標蛋白緊密結(jié)合，以形成蛋白-探針復合物，從而為后續(xù)對報告基團探測、富集和純化靶標蛋白的實驗提供前提［5］。

報告基團的作用是用來快速簡便地富集、純化和探測與小分子探針相互作用的靶標蛋白。在蛋白的分離中運用最多的是生物素標簽。生物素（biotin）又稱維生素H，它能與鏈霉親和素-瓊脂糖珠子特異性緊密結(jié)合而達到富集和純化靶標蛋白的目的［6］。

連接基團（linker）是活性基團和報告基團之間的連接鏈，其最主要的作用就是將上述兩部分隔開。另外，連接基團本身也會對活性探針與靶標蛋白的結(jié)合產(chǎn)生重要的影響［7］。長鏈烷基、聚乙二醇以及多肽片段等都是常見的連接基團。

2 活性探針在酶分離中的研究進展

蛋白酶與人類的疾病密切相關(guān)。人體內(nèi)不同蛋白酶的含量甚至可以直接作為某些疾病的診斷依據(jù)。因此對蛋白酶的研究顯得尤為重要。利用活性探針對蛋白酶的分離成為近年來的研究熱點，并且已經(jīng)取得了很多的成就。

1999年，Liu等［8］從重組的HEK-293細胞中分離得到絲氨酸蛋白酶。圖2所示，絲氨酸蛋白酶上面有活性基團羥基，它能與探針上面的活性基團氟發(fā)生取代反應，從而將生物素共價結(jié)合到酶上。后續(xù)利用鏈霉素親和層析分離得到目的酶。

圖2 絲氨酸蛋白酶探針反應機理

2000年，Doron等［9］從鼠腎臟細胞中分離得到了半胱氨酸蛋白酶。圖3所示，這類蛋白酶結(jié)構(gòu)上的活性基團巰基能與探針上面的環(huán)氧乙醚發(fā)生加成反應將生物素共價地標記到蛋白上。

圖3 半胱氨酸蛋白酶探針反應機理

圖4 脯氨?；央拿柑结樈Y(jié)構(gòu)

為了觀察探針-蛋白質(zhì)的結(jié)合情況，還可以在活性探針上面修飾熒光基團。同時考慮到直接標記對探針活性和選擇性的干擾，可以采用點擊化學反應（Click反應）來實現(xiàn)對酶的標記［10-13］。2009年，Eduard等［14］用熒光標記法從鼠大腦細胞中分離得到脯氨酰基寡肽酶(POP；EC3.4.21.26)。這類活性探針的結(jié)構(gòu)如圖4所示。結(jié)構(gòu)2中既有能進行鏈霉素親和層析的活性物質(zhì)生物素，又有一個熒光基團羅丹明，同時在末端結(jié)構(gòu)還有一個Click反應的活性基團炔基。這類探針可以利用熒光基團的成像作用使得目的蛋白直接可視化，同時還能使用生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)來富集和純化靶標蛋白，這種探針被稱為“三功能”型探針［15］。探針的作用機理與前述類似，探針1首先與脯氨?；央拿附Y(jié)合，再通過與2進行的亞銅催化Click反應將生物素與羅丹明標記到酶上。

除了蛋白酶以外，在動植物細胞以及微生物細胞中，還有很多其他重要的水解酶。對這些酶的分離，活性探針技術(shù)也有很廣泛的運用。

2001年，Mie Ichikawa等［16］利用親和標記技術(shù)從鼠脾臟細胞分離得到能催化裂解N-乙酰葡萄糖胺與絲氨酸或者蘇氨酸之間化學鍵的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（O-GlcNAc，ase）。探針的機理如圖5所示，當探針進入酶的活性中心以后，糖苷鍵隨即被斷開，并釋放出氟化氫。隨后酶上面的親核基團與探針殘基共價結(jié)合形成穩(wěn)定的酶-生物素產(chǎn)物。

圖5 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶探針機理

為了增強探針與酶的結(jié)合能力，以減少在層析分離過程中的損失。因此在設計活性探針中經(jīng)常會引入光交聯(lián)基團。光交聯(lián)基團在特定波長紫外光的照射下形成的活性中間體（如氮賓、羰基自由基、碳烯）會和酶上的基團形成穩(wěn)定的共價結(jié)合，使探針能牢固地結(jié)合到酶上［17］。常見的光交聯(lián)基團包括重氮環(huán)、二苯乙烯等［18-19］。2007年，Cleo等［20］設計了一類有二苯丙酮光交聯(lián)基團的活性探針，并成功運用于從人類黑素瘤細胞MUM2B和MUM2C中分離得到組蛋白脫乙酰酶HDAC1、HDAC2以及這兩種酶的關(guān)聯(lián)蛋白MBDB3。探針的結(jié)構(gòu)如圖6所示，包含三部分：酶抑制劑活性基團、光交聯(lián)基團和反應基團。

圖6 組蛋白脫乙酰酶探針結(jié)構(gòu)

探針的作用機理如圖7，HDAC的抑制劑活性基團先進入到酶的活性位點中，然后通過紫外照射，二苯丙酮會與旁邊蛋白上面的基團發(fā)生共價結(jié)合。再通過亞銅催化的點擊化學反應將生物素連接到被標記的酶上。最后利用鏈霉素的親和層析技術(shù)，分離得到HDAC以及MBD3。

圖7 組蛋白脫乙酰酶探針機理

3 展望

生物素類活性探針技術(shù)發(fā)展至今已較為成熟，它具有選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點，并且已被成功地應用于生物體內(nèi)許多酶的提取上，特別是在蛋白質(zhì)組學上的應用非常廣泛。對藥物靶蛋白、致病機理等等領(lǐng)域的研究有很重要的貢獻。然而活性探針技術(shù)在生物化工領(lǐng)域應用目前并不是很多。通常微生物來源的酶的分離方法主要有離子交換層析、羥基磷灰石層析、凝膠過濾層析以及疏水層析等。隨著純化設備的發(fā)展，一些新穎的分離純化方法也被開發(fā)出來，如膜分離、免疫親和純化、以聚乙二醇為固相的層析技術(shù)、雙水相界面層析等。雖然這些分離純化方法已經(jīng)有大量的報道，但是這個過程相當復雜，而且往往需要幾種方法結(jié)合使用才能分離得到預期純度的酶，因此分離效率并不高。而活性探針技術(shù)的發(fā)展為生物化工領(lǐng)域酶的分離提供了一種更加有效的方法。例如，對于在生物化工中應用十分廣泛的具有手性拆分功能的酶類，我們可以根據(jù)其底物特異性來針對性地設計一類探針，該探針可特異性地共價結(jié)合到目標酶上，然后運用鏈霉素親和層析技術(shù)分離得到目的酶。這種方法較傳統(tǒng)上的層析技術(shù)無論在效率上還是成本上都具有很大的優(yōu)勢。因此，我們相信在不久的將來，活性探針技術(shù)必將在生物化工領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。

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（責任編輯：朱小惠）

Research progress of the app lication of biotinylated activity-based probe in the separation of the enzymes

ZHUQin，YU Jiajun，YING Xiangxian
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China)

Enzyme is a kind of biologically active compounds with important significance.It has become a critical problem to extract the target enzyme in vivo quickly and efficiently.In recent years，more and more researchers applied the popular technology of activity-based probes in proteomics to separate and purify enzymes.This paper summarized the application of activitybased probes in the separation and purification of enzymes based on the streptavidin affinity chromatography.And we also listed the separation technologies and their functionalmechanism for serine and cysteine protease，N-Acetylglucosaminidase，prolyloligopeptidase and histone deacetylase with probes.

activity-based probe；separation of enzymes；streptavidin affinity chromatography

Q814

A

1674-2214(2015)04-0051-04

2015-08-26

國家基金新型近紅外水解酶FRET探針設計、制備及可視化研究（21272212）

朱（1970—），男，浙江義烏人，教授，博士，研究方向為化學生物學，E-mail：zhuq@zjut.edu.cn.