基于16S rDNA序列分析和BIOLOG快速鑒定方法鑒定杭州地區(qū)原料乳中嗜冷菌

葉慧，謝海華，黃俊，劉士旺，毛建衛(wèi)，樓堅(jiān)

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院/輕工學(xué)院，浙江杭州310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州 310023）4.溫州醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)和視覺科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江溫州325027）

基于16S rDNA序列分析和BIOLOG快速鑒定方法鑒定杭州地區(qū)原料乳中嗜冷菌

葉慧1，2，3，謝海華4，黃俊1，2，3，劉士旺1，2，3，毛建衛(wèi)1，2，3，樓堅(jiān)1，2，3

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院/輕工學(xué)院，浙江杭州310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州 310023）4.溫州醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)和視覺科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江溫州325027）

以杭州地區(qū)四個(gè)牧場(chǎng)的原料乳為對(duì)象，采用傳統(tǒng)平板法分離培養(yǎng)嗜冷菌，得到嗜冷菌的生長(zhǎng)曲線。通過形態(tài)學(xué)觀察及鏡檢分離純化出15株形態(tài)各異的菌種?；?6S rDNA序列分析和BIOLOG微生物快速鑒定方法，最終鑒定為假單胞菌屬、類黃假單胞菌、熒光假單胞菌、乳酸菌等種屬。其中假單胞菌屬有13株，為杭州地區(qū)原料乳中嗜冷菌的優(yōu)勢(shì)菌。

原料乳；嗜冷菌；BIOLOG鑒定；16S rDNA序列

國(guó)際乳品聯(lián)合會(huì)（IDF）把能在20℃以下繁殖，且10～15℃為最適生長(zhǎng)溫度的微生物定義為嗜冷菌。嗜冷菌可細(xì)分為兩類，一類是專性嗜冷菌（psychrophiles），最高生長(zhǎng)溫度不高于20℃，最適生長(zhǎng)溫度為15℃，嚴(yán)格低溫生長(zhǎng)；另一類為兼性嗜冷菌（psychrotrophs），最高生長(zhǎng)溫度高于2℃，最適生長(zhǎng)溫度高于15℃，在原料乳中更為常見［1］。嗜冷菌具有膜流動(dòng)性高、tRNA轉(zhuǎn)錄后修飾程度低、酶分子柔性高等共同特點(diǎn)，但是不同科、屬的嗜冷菌之間形狀差異仍然較大。有研究表明，原料乳中嗜冷菌的優(yōu)勢(shì)菌為假單胞菌屬［2］，在乳制品儲(chǔ)藏、運(yùn)輸過程中產(chǎn)生極其耐熱的蛋白酶和脂肪酶，分解奶制品中的脂肪和蛋白質(zhì)，出現(xiàn)苦味、腐敗味或形成膠凝，從而導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)發(fā)生變化。原料乳中嗜冷菌的菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法為平板計(jì)數(shù)法，該法準(zhǔn)確，但耗時(shí)長(zhǎng)，在工業(yè)生產(chǎn)中無法廣泛使用。目前國(guó)內(nèi)外在原有標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上創(chuàng)新，通過與時(shí)下新興技術(shù)結(jié)合，開發(fā)出一些新的基于微生物學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、生物技術(shù)的快速、自動(dòng)化的分析方法，如酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、電阻抗法、流式細(xì)胞術(shù)（FCM）、脂肪酶活測(cè)定［3-4］，均適用于對(duì)乳制品的檢測(cè)，與傳統(tǒng)方法相比大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，但在某種程度上存在一定的不足之處。

研究一種安全有效的原料乳中嗜冷菌的快速鑒定方法十分必要，本文采用的基于16S rDNA序列分析的檢測(cè)方法及BIOLOG快速鑒定方法，旨在鑒定杭州地區(qū)原料乳中嗜冷菌并找出優(yōu)勢(shì)菌株，再進(jìn)行比較，這對(duì)控制嗜冷菌繁殖、提高乳品質(zhì)量、延長(zhǎng)乳品貨架期具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本試驗(yàn)使用的原料乳產(chǎn)自杭州周邊地區(qū)的四個(gè)牧場(chǎng)，取樣時(shí)間為2014年3月。

用于配制培養(yǎng)基的相關(guān)試劑大多購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；用于鏡檢的相關(guān)試劑購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；用于16S rDNA序列分析的相關(guān)試劑購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；BIOLOG相關(guān)試劑及BIOLOG Gen IIIMicrostation購(gòu)自美國(guó)BIOLOG公司；PCR儀（Veriti 96-Well Thermal Cycler）購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）；凝膠成像分析儀（Tanon2500）購(gòu)自上海圣科儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備［2］

按培養(yǎng)基成分表（酵母提取物2.5 g，脫脂奶粉1.0 g，胰蛋白胨5.0 g，葡萄糖1.0 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL）稱量各組分，并用蒸餾水配成溶液，調(diào)節(jié)pH至6.8～7.0，置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌（121℃，20min）。將滅好菌的培養(yǎng)基從滅菌鍋中取出，待冷卻至45℃左右時(shí)，倒平板。將倒好的平板置于7℃培養(yǎng)箱中備用。

1.2.2 接種與培養(yǎng)

將四個(gè)牧場(chǎng)的原料乳依次編號(hào)為A、B、C、D，進(jìn)行梯度稀釋。用移液槍均勻吸取原料乳1 mL，加入9mL的無菌蛋白胨水中，稀釋至10-1倍，從10-1倍稀釋液中取1mL，加入到第二支蛋白胨水試管中，稀釋至10-2倍，按此方法將樣品稀釋至10-8。分別取1 mL 8個(gè)稀釋度樣液均勻涂布在已倒好培養(yǎng)基的平板中，置于7℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。同時(shí)做空白對(duì)照組，此過程均為無菌操作。

1.2.3 嗜冷菌的分離純化

仔細(xì)觀察平板中各菌的菌落形態(tài)，觀察菌落大小、形狀、色澤、色素產(chǎn)生、表面光滑程度、邊緣整齊度，并結(jié)合各菌種的革蘭氏染色情況將嗜冷菌分離，將不同菌落形態(tài)的嗜冷菌菌落編號(hào)并進(jìn)行純化，轉(zhuǎn)接至斜面，重復(fù)純化3次。

1.2.4 樣品鏡檢

鏡檢操作參考《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（第四版）》［5］。

1.2.5 16S rDNA序列分析

1）DNA提取

細(xì)菌總DNA提取參照文獻(xiàn)［6］。

2）引物合成及PCR擴(kuò)增

嗜冷菌16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增采用如下通用引物［7］：16S(F)：5＇-AGAGT TTGAT CMTGG CTCAG-3＇；16S(R)：5＇-CGGYT ACCTT GTTAC GACTT-3＇。

PCR擴(kuò)增采用50μL反應(yīng)體系，體系組成如表1所示，并根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整模板的加入量以獲得最佳的擴(kuò)增效果。

反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸2 min，循環(huán)35次，72℃延伸10 min，最后冷卻至4℃。其中退火溫度需根據(jù)不同引物的Tm值進(jìn)行調(diào)整。使用UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

3）PCR反應(yīng)體系

表1 PCR反應(yīng)體系組分

4）瓊脂糖凝膠電泳

電泳操作參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版）》［8］，所用瓊脂糖凝膠濃度為1.00%，Goldview低毒染色劑與瓊脂糖充分混勻后倒入制膠膜，插上梳子，室溫放置20 min使膠凝固，然后置于電泳槽中進(jìn)行電泳，工作電壓為140 V。

5）16S rDNA序列測(cè)定及比對(duì)

擴(kuò)增的16S rDNA的測(cè)序和PCR引物的合成委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行。將獲得的序列登陸Genbank（http：//www.ncbinlm.nih.gov），應(yīng)用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行相似性比較分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 BIOLOG快速鑒定

在Garland和Mills的方法上稍作修改［9］。

1）菌懸液的制備

初步確定微生物類型后，將純化后的嗜冷菌接種到BIOLOG專用接種液中，上下移動(dòng)棉簽，將分散的菌落和接種液充分混合，制備成均一的菌懸液，濁度調(diào)整為90%～100%。

2）加樣和培養(yǎng)

得到的菌懸液倒入儲(chǔ)液槽，用微量加樣器吸取上述稀釋液，加入至BIOLOG ECO微平板中，150μL/孔，加完之后蓋上蓋子。培養(yǎng)條件為：在7℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d，并保持一定的濕度。

3）鑒定與對(duì)比

培養(yǎng)24 h后在讀數(shù)儀上讀取菌株的代謝指紋特征，在BIOLOG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性比對(duì)，查找最接近的結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 平板計(jì)數(shù)的生長(zhǎng)曲線

圖1 四個(gè)牧場(chǎng)的菌落生長(zhǎng)曲線

如上圖所示，A、B、C、D四個(gè)牧場(chǎng)的菌落在開始培養(yǎng)的0～48 h生長(zhǎng)緩慢，48～120 h菌落數(shù)迅速增加，120～144 h生長(zhǎng)趨于平緩。第168 h菌落數(shù)達(dá)到最高，四個(gè)牧場(chǎng)菌落數(shù)分別為1.16×108，1.32×108，3.4×108，7.5×108CFU/mL。根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，分別對(duì)應(yīng)生長(zhǎng)延遲期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期，上述結(jié)果與文獻(xiàn)較為接近［10-12］。此生長(zhǎng)曲線為下一步細(xì)菌的分離純化提供了培養(yǎng)時(shí)間的理論依據(jù)，大部分嗜冷菌在7℃下培養(yǎng)7 d即達(dá)到生長(zhǎng)飽和。

2.2 嗜冷菌篩選結(jié)果

對(duì)產(chǎn)自杭州周邊地區(qū)四個(gè)牧場(chǎng)的原料乳中嗜冷菌進(jìn)行分離純化，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，一共篩選出15株菌落形態(tài)各異的嗜冷菌，通過鏡檢對(duì)嗜冷菌進(jìn)行革蘭氏染色以及菌落形態(tài)描述，結(jié)果如表2所示。

篩選菌株的顯微觀察照片結(jié)果如圖2所示。分離得到15株菌，隨機(jī)均勻分成兩組，其中7株用PCR快速檢測(cè)方法鑒定，另外8株采用BIOLOG快速鑒定方法，并作比較。

2.3 PCR快速檢測(cè)方法結(jié)果

搖瓶培養(yǎng)嗜冷菌并收集菌體后，用試劑盒提取基因組，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物擴(kuò)增序列。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見表1，略作調(diào)整以降低非特異性擴(kuò)增，提高目的片段的純度和濃度，最終選擇的模板加入量為1μL，退火溫度為54℃。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳如圖3所示。由電泳圖可知，擴(kuò)增所得該7個(gè)菌株的16S rDNA基因片斷大小均在1 500 bp左右。

表2 分離出嗜冷菌的革蘭氏染色結(jié)果及菌落形態(tài)描述

圖2 篩選菌株的顯微觀察照片

圖3 嗜冷菌16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖

使用UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)16S rDNA PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收之后送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

較之傳統(tǒng)方法，通過16S rDNA序列同源性分析的方法能準(zhǔn)確地將未知菌鑒定到種水平。由圖4系統(tǒng)發(fā)育樹可知，與NO.1、15同源性較高的是莓實(shí)假單胞菌（Pseudomonas fragi），NO.2與假單胞菌（Pseudomonas gessardii）形成一個(gè)分支，NO.7的16S rDNA序列與乳酸菌（Lactobacilluspiscium）的同源性較高，而與NO.4、5、13有較高同源性的是類黃假單胞菌（Pseudomonas synxantha）。通過對(duì)7株菌株的16S rDNA序列比對(duì)以及系統(tǒng)發(fā)育分析，由此鑒定出優(yōu)勢(shì)菌為假單胞菌屬。吳石金等［13］從155份原料乳樣品中分離純化得到嗜冷菌分離物16株，經(jīng)微生物形態(tài)及生理生化特征鑒定，確定為假單胞菌10株，微球菌4株，產(chǎn)堿桿菌2株。岳喜慶等［14］從原料乳中篩選出氣單胞菌、乳球菌等，說明這些菌是普遍存在于原料乳中的，而我們的結(jié)果表明假單胞菌較多的存在于杭州地區(qū)的原料乳中。

2.4 BIOLOG微生物全自動(dòng)鑒定結(jié)果

2.4.1 革蘭氏陰陽(yáng)性結(jié)果

圖4 基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 不同菌株的革蘭氏陰陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)

從表3可以看出，8株待測(cè)菌株都呈革蘭氏陰性，將其與傳統(tǒng)的革蘭氏染色法進(jìn)行比較，可知兩種革蘭氏陰陽(yáng)性鑒別方法對(duì)8株菌株的鑒定結(jié)果是一致的。

2.4.2 BIOLOG鑒定

初步確定微生物類型后，將純化后的嗜冷菌接種到BIOLOG專用接種液中，制備成均一的菌懸液，濁度調(diào)整為90%～100%。菌懸液加至BIOLOG ECO微平板中，置于7℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h讀取數(shù)據(jù)，鑒定結(jié)果見表4。

表4 BIOLOG鑒定結(jié)果

BIOLOG系統(tǒng)鑒定結(jié)果主要有3個(gè)參數(shù)，即可能性（PROB）、相似性（SIM）和位距（DIST）。其中SIM值和DIST值是兩個(gè)重要參數(shù)，DIST值表示測(cè)試結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)相應(yīng)數(shù)據(jù)的距離，SIM值表示測(cè)試結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)相應(yīng)數(shù)據(jù)的相似程度［15］。BIOLOG系統(tǒng)規(guī)定：細(xì)菌培養(yǎng)4～6 h其SIM≥0.75或培養(yǎng)16～24 h其SIM≥0.5，系統(tǒng)自動(dòng)給出鑒定結(jié)果為種名；反之，當(dāng)SIM值小于0.75（4～6 h）或0.5（16～24 h），但鑒定結(jié)果中屬名相同的結(jié)果的SIM值之和大于0.75或0.5時(shí)，自動(dòng)給出的鑒定結(jié)果為屬名，其他情況則不給出結(jié)果［17］。

由表4可知，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為24 h時(shí)，NO.3、6、8、11、12的PROB分別為0.509、0.569、0.522、0.674、0.660，均大于0.519，結(jié)果給出了種名；而NO.9、10、14只給出了屬名，測(cè)定結(jié)果表示NO.3為拉烏爾菌屬，其余7株均為假單胞菌屬。

圖5給出了BIOLOG鑒定24 h時(shí)各菌株對(duì)鑒定板上不同碳源的代謝情況。從圖中可以看出，8株菌中每一株的代謝指紋特征都不一樣，同一種屬的菌株代謝情況也有差別。革蘭氏結(jié)果表明均為陰性菌，這與傳統(tǒng)革蘭氏染色法和KOH溶液法的鑒定結(jié)果一致。采用BIOLOG自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)從原料乳中分離得到的嗜冷菌的鑒定結(jié)果是可信的［15］。

圖5 菌株的代謝指紋特征圖

2.5 16SrDNA序列分析和BIOLOG快速鑒定

方法的比較

原料乳中的嗜冷菌種類繁多，其組成、數(shù)量和生態(tài)分布因地域和時(shí)間不同而有較大差別。在已鑒定出來的嗜冷菌中，細(xì)菌是最多的一類，有30多個(gè)屬，且絕大多數(shù)為革蘭氏陰性菌。其余種屬有假單胞菌、弧菌、無色桿菌、黃桿菌、嗜纖維菌和螺菌等［2］。常用的嗜冷菌檢測(cè)方法是標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法，計(jì)數(shù)準(zhǔn)確但過程繁瑣而耗時(shí)。本文主要采用基于16S rDNA序列分析和BIOLOG快速鑒定方法鑒定杭州地區(qū)原料乳中嗜冷菌，總結(jié)如下：

1）在低溫條件下，原料乳中嗜冷菌占主導(dǎo)地位，成為影響產(chǎn)品質(zhì)量的主要因素。采用含脫脂奶粉1.0 g/L的培養(yǎng)基，可以較好富集原料乳中的嗜冷菌。鏡檢結(jié)果表明，多數(shù)嗜冷菌為革蘭氏陰性菌。

2）對(duì)產(chǎn)自杭州周邊地區(qū)四個(gè)牧場(chǎng)的原料乳中嗜冷菌進(jìn)行培養(yǎng)，得到嗜冷菌的生長(zhǎng)曲線，四個(gè)牧場(chǎng)最高菌落數(shù)分別為1.16×108，1.32×108，3.4× 108，7.5×108CFU/mL。

3）對(duì)產(chǎn)自四個(gè)牧場(chǎng)的嗜冷菌進(jìn)行分離純化，篩選得到15株形態(tài)各異的菌株，分別用分子生物學(xué)法和BIOLOG快速鑒定方法進(jìn)行鑒定。分子生物學(xué)法結(jié)果表明，待測(cè)7株菌株的鑒定結(jié)果為：NO.1、2、4、5、13、15為假單胞菌屬，其中NO.4、5、13為類黃假單胞菌，NO.1、15為莓實(shí)假單胞菌，而NO.7為乳酸菌。BIOLOG快速鑒定方法，其結(jié)果是NO.3、6、8、11、12給出了種名，分別是土生拉烏爾菌、熒光假單胞桿菌、綠針假單胞菌、莓實(shí)假單胞菌、莓實(shí)假單胞菌；而NO.9、10、14只給出了屬名，都是假單胞菌屬。

4）分子生物學(xué)檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，具有高靈敏度和高特異性，BIOLOG快速鑒定方法快速、準(zhǔn)確，兩者都是快速檢測(cè)食品微生物的重要方法。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Identification of psychrophilic bacteria in raw m ilk from Hangzhou area based on 16S rDNA sequences analysis and BIOLOG m ethod

YE Hui1，2，3，XIE Haihua4，HUANG Jun1，2，3，LIU Shiwang1，2，3，MAO Jianwei1，2，3，LOU Jian1，2，3
(1.School of Biological and Chemical Engineering/School of Light Industry，Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310023，China；2.Zhejiang Provincial Key Lab for Chemical and Biological Processing Technology of Farm Products，Hangzhou 310023，China；3.Zhejiang Provincial Collaborative Innovation Center of Agricultural Biological Resources BiochemicalManufacturing，Hangzhou 310023，China；4.State Key Laboratory Cultivation Base and Key Laboratory of Vision Science，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325027，China)

Based on raw milk provided by four pastures in Hangzhou district，15 psychrophile were isolated from culture plate and their growth curves were obtained.According tomorphology，16S rDNA sequences analysis and BIOLOG method，the isolated strains were identified as Pseudomonas sp.，Pseudomonas synxantha，Pseudomonas fluorescens and Lactobacillus sp..Among them，there are 13 species of Pseudomonas sp.，which are the dominant bacteria in raw milk from Hangzhou.

raw milk；psychrophilemicroorganisms；BIOLOG identifieation；16S rDNA sequence

Q93

A

1674-2214(2015)04-0024-06

2015-07-20

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（201311057009）

葉慧（1994—），女，浙江臺(tái)州人，本科生，研究方向?yàn)樯锕こ?，E-mail：yhuiruc@163.com.通信作者：樓堅(jiān)，講師，E-mail：loujianzust@126.com.