基因工程菌糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)研究

陳小龍，連振靜，范永仙

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州 310014）

基因工程菌糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)研究

陳小龍，連振靜，范永仙

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州 310014）

將含重組質(zhì)粒pET28b-ValG在BL21（DE3）宿主菌中成功表達(dá)，以鎳柱親和層析、超濾脫鹽及真空冷凍干燥結(jié)晶獲得糖基轉(zhuǎn)移酶并初步研究酶學(xué)性質(zhì)。在10～40°C或pH 5～11下，該酶還能保持較好的穩(wěn)定性，且最適反應(yīng)溫度及pH分別為30°C與8.0。1 mmol/L金屬離子Ca2+、Mg2+、Mn2+、Co2+對(duì)酶反應(yīng)有著顯著的促進(jìn)作用，而Cu2+、Zn2+對(duì)酶反應(yīng)有強(qiáng)烈的抑制效果。當(dāng)酶反應(yīng)進(jìn)程中酶活達(dá)到最大時(shí)，底物及產(chǎn)物的最適濃度分別為8 μmol/L與2 μmol/L。以底物井岡羥胺A足量為前提，雙倒數(shù)作圖法表明KmB為35.275 μmol/L，Vm為0.153 μmol/（L· min），酶對(duì)井岡羥胺A的親和力較尿苷二磷酸葡糖（UDPG）好，因此在全細(xì)胞酶催化過(guò)程中對(duì)提高UDPG供應(yīng)量的研究是有必要的。

糖基轉(zhuǎn)移酶；純化；酶學(xué)性質(zhì)

井岡霉素是一類(lèi)氨基環(huán)醇類(lèi)抗生素，包含一個(gè)有效烯胺結(jié)構(gòu)，被廣泛應(yīng)用于水稻紋枯病的防治。井岡霉素主要由A、B、C、D、E、F、G、H共8個(gè)組分組成，其中井岡霉素A是井岡霉素的主要有效成分。在井岡霉素發(fā)酵生產(chǎn)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)井岡霉素A的前體井岡羥胺A會(huì)大量積累，直接影響井岡霉素的產(chǎn)量和產(chǎn)品的質(zhì)量[1]。而井岡霉素生物合成的遺傳學(xué)研究表明，井岡霉素A生物合成的最后一步就是由糖基轉(zhuǎn)移酶將一分子葡萄糖轉(zhuǎn)移至井岡羥胺A生成井岡霉素A，研究表明編碼該糖基轉(zhuǎn)移酶的基因?yàn)榫畬顾厣a(chǎn)菌吸水鏈霉菌ValG基因[2]。

為了減少井岡羥胺A的積累，提高產(chǎn)品中井岡霉素A的含量和產(chǎn)品質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建了糖基轉(zhuǎn)移酶基因工程菌，并初步運(yùn)用于生物轉(zhuǎn)化井岡羥胺A為井岡霉素A，但是全細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率并不高，這可能是由于沒(méi)有找到適宜糖基轉(zhuǎn)移酶催化的最優(yōu)條件。

以重組蛋白中His-tag鎳柱親和層析[3]分離糖基轉(zhuǎn)移酶并對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究全細(xì)胞轉(zhuǎn)化井岡羥胺A糖基化指明方向；另一方面，通過(guò)對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的深入研究，將為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)該糖基轉(zhuǎn)移酶在抗生素等活性分子糖基化修飾的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

基因工程菌pET28b-ValG BL21（DE3）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。

1.1.2 試劑與設(shè)備

用于配制酶催化反應(yīng)的不同pH緩沖液的緩沖鹽及金屬離子鹽購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)各子公司；用于酶純化、蛋白膠的相關(guān)試劑大多購(gòu)自上海生工生物工程有限公司與美國(guó)Bio-Rad公司；尿苷二磷酸二鈉鹽購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其他試劑大多來(lái)自國(guó)內(nèi)生產(chǎn)廠(chǎng)家；HPLC為日本島津公司生產(chǎn)的LC-20AT；PCR儀為美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)的S1000。

1.2 方法

1.2.1 蛋白純化

將培養(yǎng)好的菌體，4°C下10000 r/min離心5 min獲得菌體，菌體用50 mmol/L pH為8.0的Tris-HCl緩沖液洗滌3次，獲得濕菌體。

將菌體懸浮于50 mmol/L pH為8.0的Tris-HCl緩沖液中，菌體濃度大約為0.05 g/mL，冰浴條件下200 W功率超聲破碎，工作1 s，停1 s，一次3 min，重復(fù)8次。于4°C下12000 r/min離心30 min，取上清。

將Ni-NTA填料裝于1.6 cm×20 cm柱子中，柱床體積大約為10 mL；柱子裝好以后，在柱上緩慢加入5倍柱體積的平衡液（pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl），以充分平衡Ni-NTA柱子；平衡完成后取過(guò)濾后的工程菌破碎液勻速加入鎳柱，直至樣品完全進(jìn)入。

用10倍柱體積的平衡液繼續(xù)洗滌凝膠柱，保持流速為1 mL/min，分別用含5 mmol/L咪唑的洗脫液（pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl）及250 mmol/L咪唑的洗脫液（pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl）進(jìn)行洗脫，流速為1 mL/min，下端用試管接住流出液體，將試管標(biāo)記順序。

將含有目標(biāo)蛋白的穿透液放入Millipore超濾管中，于4°C下5000 r/min離心，用適量的25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）洗滌兩次，最后加入適量的超純水溶解蛋白，將蛋白溶液置于冷凍干燥機(jī)中干燥，干燥得白色絲狀物，置于-20°C保存。

以3 μL 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液，2 μL 25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液溶解的純化酶儲(chǔ)液（50 μg/mL），2 μL尿苷二磷酸葡糖（UDPG）儲(chǔ)液（終濃度8.20 μmol/L），3 μL底物井岡羥胺A儲(chǔ)液（10.44 μmol/L）的10 μL反應(yīng)體系，在30°C溫度下反應(yīng)20 min，完畢于100°C加熱6 min淬滅反應(yīng)。取5 μL HPLC測(cè)定井岡霉素的生成量。酶活定義如下：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol井岡霉素A所需酶量為一活力單位U。

1.2.2 SDS-PAGE鑒定

將誘導(dǎo)后的1 mL菌液12000 r/min離心5 min，懸浮于1 mL去離子水中，分別取20 μL懸浮的菌液、細(xì)胞超聲波破碎液、鎳柱親和層析穿透峰溶液與2×上樣緩沖液充分混勻，沸水煮8 min制成樣品，取10 μL上樣，濃縮膠電壓65 V，分離膠電壓改為120 V，染色脫色后判斷蛋白純化的情況。

1.2.3溫度對(duì)純酶酶活影響的測(cè)定

以3 μL 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液，2 μL 25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液溶解的純化酶儲(chǔ)液（50 μg/mL），2 μL尿苷二磷酸葡糖（UDPG）儲(chǔ)液（終濃度8.20 μmol/L），3 μL底物井岡羥胺A儲(chǔ)液（10.44 μmol/L）的10 μL反應(yīng)體系，在10～60°C溫度范圍內(nèi)，以5°C為梯度溫度，反應(yīng)20 min，完畢于100°C加熱6 min淬滅反應(yīng)。取5 μL測(cè)定井岡霉素的生成量。

1.2.4 純酶的溫度穩(wěn)定性測(cè)定

將純酶放在10～60°C溫度范圍內(nèi)，以5°C為梯度溫度處理30 min，在10 μL反應(yīng)體系下進(jìn)行酶反應(yīng)，反應(yīng)方法同上所述，取5 μL測(cè)定井岡霉素的生成量。

1.2.5 pH對(duì)純酶酶活影響的測(cè)定

分別配制50 mmol/L pH為3、4、5、6、7、8、9、10的緩沖液（pH 3～4（Na2HPO4-檸檬酸緩沖液）、pH 5～7（Na2HPO4-NaH2PO4）、pH 8～9（Tris-HCl）、pH 10～11（Na2CO3-NaHCO3），各緩沖離子對(duì)配成50 mmol/L溶液，按比例混合成pH不同的緩沖液），采用10 μL反應(yīng)體系，在30°C溫度下反應(yīng)20 min，完畢于100°C加熱6 min淬滅反應(yīng)，取5 μL測(cè)定井岡霉素的生成量。

1.2.6 純酶的pH穩(wěn)定性測(cè)定

將上述酶儲(chǔ)液放于50 mmol/L pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11的緩沖液中，在室溫下放置30 min，10 μL反應(yīng)體系反應(yīng)方法同上所述，取反應(yīng)液5 μL檢測(cè)井岡霉素A生成量。

1.2.7 金屬離子對(duì)純酶酶活的影響

稱(chēng)取相應(yīng)可溶性金屬離子鹽（KCl、CaCl2、MgCl2、MnCl2、CrCl3、CoCl2、ZnCl2、FeCl2、NiSO4、Cu-SO4、AlCl3）配制10 mmol/L K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cr3+、Co2+、Zn2+、Fe2+、Ni2+、Cu2+、Al3+金屬離子儲(chǔ)液，采用10 μL反應(yīng)體系：其中3 μL 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液，2 μL 25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）緩沖液溶解的純化酶儲(chǔ)液（50 μg/mL），2 μL UDPG儲(chǔ)液（終濃度8.20 μmol/L），2 μL底物井岡羥胺A儲(chǔ)液（10.44 μmol/L），1 μL 10 mmol/L的金屬離子儲(chǔ)液（反應(yīng)體系中金屬離子終濃度1 mmol/L）。反應(yīng)方法同上所述，取反應(yīng)液5 μL檢測(cè)井岡霉素A生成量。

1.2.8 底物與產(chǎn)物對(duì)純酶酶活的影響

采用上述10 μL反應(yīng)體系：其中3 μL 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液，2 μL 25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液溶解的純化酶儲(chǔ)液（50 μg/mL），2 μL UDPG儲(chǔ)液（終濃度8.20 μmol/L），3 μL不同濃度的井岡羥胺A儲(chǔ)液（井岡羥胺A終濃度分別為1.49、2.98、5.96、7.45、8.95、10.44、11.93、14.91、17.89 μmol/L）。反應(yīng)方法同上所述，取反應(yīng)液5 μL檢測(cè)井岡霉素A生成量。

采用上述10 μL反應(yīng)體系：其中3 μL 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液，2 μL 25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液溶解的純化酶儲(chǔ)液（50 μg/mL），2 μL UDPG儲(chǔ)液（終濃度8.20 μmol/L），2 μL井岡羥胺A儲(chǔ)液（終濃度10.44 μmol/L），1 μL不同濃度的井岡霉素A（井岡霉素A終濃度分別為0.08、0.20、0.40、0.80、1.21、1.61、2.01、3.62、4.82、6.83 μmol/L）。反應(yīng)方法同上所述，取反應(yīng)液5 μL檢測(cè)井岡霉素A生成量。

1.2.9 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)的測(cè)定

第一次作圖，固定反應(yīng)體系中的UDPG的濃度為13.67、10.25、6.83 μmol/L，改變井岡羥胺A的濃度為3.58、4.47、5.96、7.45、8.95 μmol/L，反應(yīng)方法同上所述，取反應(yīng)液5 μL檢測(cè)井岡霉素A生成量，從而求出反應(yīng)速率，雙倒數(shù)作圖。第二次作圖，固定井岡羥胺A的濃度為28.33 μmol/L，改變UDPG的濃度為3.41、4.78、6.83、10.25、13.66 μmol/L，酶反應(yīng)與上述實(shí)驗(yàn)相同。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶的分離純化

鎳柱親和層析色譜圖、純化穿透峰電泳圖如圖1、2所示。

圖1 糖基轉(zhuǎn)移酶鎳柱親和層析純化圖

圖1的鎳柱層析色譜圖的左側(cè)縱坐標(biāo)為穿透峰的紫外吸收，右側(cè)縱坐標(biāo)為穿透峰的電導(dǎo)率。從圖中推測(cè)在50～80 min左右，是一些未被鎳離子結(jié)合的雜蛋白，且含量較高，80～110 min之間出現(xiàn)了一個(gè)小的雜峰，推測(cè)是被5 mmol/L咪唑洗脫液洗下來(lái)的弱吸附雜蛋白，在135～150 min之間出現(xiàn)一個(gè)窄而尖的穿透峰，推測(cè)是被250 mmol/L咪唑洗脫液洗下來(lái)的目的蛋白峰。而從圖2的凝膠電泳圖可以看出推測(cè)是否正確及純化的效果是否理想。圖2的右側(cè)開(kāi)始第一泳道為蛋白質(zhì)Marker，往左側(cè)依次為未破碎的菌體、菌體破碎液、雜蛋白穿透峰，最左側(cè)為目的蛋白穿透峰。SDS-PAGE圖譜經(jīng)掃描，BandScan軟件分析菌體破碎液中ValG約占細(xì)胞總蛋白的32%。從圖中可以看到在45 kD處看到明顯的蛋白條帶，這與目標(biāo)蛋白的大?。?7 kD）一致，推測(cè)為糖基轉(zhuǎn)移酶，進(jìn)一步酶活實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證。另在雜蛋白穿透峰中并沒(méi)有看到很亮的目的蛋白條帶，說(shuō)明鎳柱對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶的特異性吸附較強(qiáng)，而從目的蛋白的穿透峰鋒形看出，250 mmol/L咪唑洗脫液能很好的從鎳柱上洗脫目的蛋白，通過(guò)對(duì)純化后ValG的總酶活1862.5 U與破碎完后粗酶的總酶活2191.2 U之比，計(jì)算得ValG回收率在85%以上。綜上所述，該方法分離糖基轉(zhuǎn)移酶快速有效。

2.2 溫度對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶酶活的影響[4]

溫度對(duì)酶活影響的研究以最高酶活（100%）作為參照，分別計(jì)算各溫度下的相對(duì)酶活（為了減小誤差，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都取兩個(gè)平行的平均值），糖基轉(zhuǎn)移酶的溫度穩(wěn)定性研究以未處理酶的酶活為參照，分別計(jì)算各溫度條件下處理過(guò)的酶的剩余酶活力，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可知，糖基轉(zhuǎn)移酶催化糖基轉(zhuǎn)移的最適溫度為30°C，當(dāng)溫度在10～30°C之間時(shí)，酶活隨著溫度上升而增大，而當(dāng)溫度為10°C時(shí)，相對(duì)酶活只有62.64%，這可能是因?yàn)榈蜏貤l件下，酶、底物分子的擴(kuò)散速率變慢，酶與底物碰撞幾率降低所致，而當(dāng)溫度超過(guò)35°C時(shí)，酶活隨著溫度的升高劇烈下降，到60°C時(shí)相對(duì)酶活只有8%左右，這是因?yàn)殡S著溫度的上升，酶逐漸變性所致；而溫度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果正好驗(yàn)證了這一點(diǎn)，在10～40°C時(shí)，酶是較為穩(wěn)定的，當(dāng)溫度大于45°C，酶基本失活。

2.3 pH對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶酶活的影響[5]

pH對(duì)酶活影響的研究以最高酶活（100%）作為參照，分別計(jì)算各pH緩沖液反應(yīng)體系的相對(duì)酶活，糖基轉(zhuǎn)移酶的pH穩(wěn)定性研究以未處理酶的酶活為參照，分別計(jì)算各pH緩沖液處理過(guò)的酶的剩余酶活力，結(jié)果如圖4所示。

圖2 純化的糖基轉(zhuǎn)移酶電泳圖

圖4 pH對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶的影響

從圖4可知，糖基轉(zhuǎn)移酶催化糖基轉(zhuǎn)移的最適pH在8～9之間，當(dāng)pH在4～8之間時(shí)，酶活隨著pH增大而升高，而當(dāng)pH為3時(shí)，酶完全變性，沒(méi)有檢測(cè)到酶活。而當(dāng)pH超過(guò)10時(shí)，酶活隨著pH的升高劇烈下降，到pH為11時(shí)，相對(duì)酶活只有9%左右。從上可知，在pH 8～10之間，酶的活力相對(duì)較高，結(jié)合糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)特征，由于該酶存在DTG基序（對(duì)應(yīng)于其他糖基轉(zhuǎn)移酶的DXD基序）[6]，這可能是該酶催化的活性位點(diǎn)，無(wú)論該酶是采用堿催化機(jī)制還是雙取代機(jī)制，都需要該酶在催化時(shí)活性中心有一個(gè)去質(zhì)子化的親和基團(tuán)，DTG基序可以提供這樣一個(gè)基團(tuán)，當(dāng)pH為堿性時(shí)，更有利于活性中心的親核基團(tuán)的去質(zhì)子化，從而加速催化反應(yīng)中的親核攻擊，加快反應(yīng)速率。酶pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該酶的pH穩(wěn)定性還是很好的，在pH 5～11之間，剩余酶活均在80%以上，特別是在堿性條件下，酶的穩(wěn)定性更好，而當(dāng)pH小于4時(shí)，酶就容易變性失活。

2.4 金屬離子對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶酶活的影響[7]

以未添加金屬離子反應(yīng)體系的酶活（100%）作為參照，研究添加1 mmol/L金屬離子對(duì)酶活的影響，分別計(jì)算添加不同金屬離子反應(yīng)體系的相對(duì)酶活，結(jié)果如圖5所示。

圖5 金屬離子對(duì)酶活的影響

從圖5中可以看出，1 mmol/L的Al3+、Cr3+、Fe2+對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶酶活基本上沒(méi)有影響，而Ni2+對(duì)酶反應(yīng)有輕微的抑制作用，Cu2+、Zn2+對(duì)酶反應(yīng)有強(qiáng)烈的抑制作用，1 mmol/L的Cu2+、Zn2+離子對(duì)酶的抑制率都達(dá)到了90%，相反K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Co2+卻對(duì)酶反應(yīng)有不同程度的促進(jìn)作用，且相對(duì)酶活都達(dá)到了150%以上，最高的相對(duì)酶活（加Mg2+）達(dá)到了234%。可以推測(cè)大多數(shù)糖基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)過(guò)程中，當(dāng)活性位點(diǎn)的親核基團(tuán)攻擊磷酸離去基團(tuán)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生部分負(fù)電荷，推測(cè)加入的二價(jià)金屬陽(yáng)離子穩(wěn)定了這些負(fù)電荷，加速了磷酸離去基團(tuán)的脫離，從而加快了酶反應(yīng)速率。

2.5 底物與產(chǎn)物對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶酶活的影響[8]

通過(guò)改變酶反應(yīng)體系中底物井岡羥胺A的含量，以最高酶活作為對(duì)照（100%），計(jì)算各個(gè)底物濃度下的相對(duì)酶活，從而研究底物對(duì)酶反應(yīng)速率的影響及可能存在的底物抑制。通過(guò)向酶反應(yīng)體系中添加不同濃度的井岡霉素A，以未添加產(chǎn)物的反應(yīng)體系作為對(duì)照（100%），計(jì)算各反應(yīng)體系的相對(duì)酶活，研究產(chǎn)物對(duì)酶反應(yīng)速率的影響及可能存在的產(chǎn)物抑制，結(jié)果如圖6、7所示。

圖6 底物濃度對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶酶活的影響

圖7 產(chǎn)物對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶酶活的影響

從圖6可知，當(dāng)?shù)孜餄舛仍?.49～8 μmol/L之間時(shí)，相對(duì)酶活隨著底物濃度的增加而提高，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到8 μmol/L以上時(shí)，相對(duì)酶活達(dá)到最大，而當(dāng)濃度超過(guò)18 μmol/L時(shí)，可能出現(xiàn)輕微的底物抑制現(xiàn)象（不同底物濃度下的酶學(xué)反應(yīng)都有著底物的殘留）；從圖7可知，當(dāng)產(chǎn)物濃度為1.5 μmol/L時(shí)，產(chǎn)物對(duì)酶反應(yīng)并沒(méi)有影響，而有趣的是當(dāng)產(chǎn)物濃度為2 μmol/L，相對(duì)酶活居然達(dá)到了167%，這說(shuō)明一定量的產(chǎn)物可能對(duì)酶反應(yīng)有促進(jìn)效果，顯現(xiàn)一定正反饋的作用，而當(dāng)產(chǎn)物濃度達(dá)到7 μmol/L時(shí)，并未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物的反饋抑制作用。

2.6 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)的測(cè)定

采用研究多底物酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)較常用的方法：二次作圖法，具體方法見(jiàn)上，結(jié)果如圖8、9所示。

通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，發(fā)現(xiàn)圖8中出現(xiàn)三條幾乎平行的直線(xiàn)，這符合多底物催化兵乓機(jī)制的動(dòng)力學(xué)模型特征，根據(jù)兵乓機(jī)制的反應(yīng)歷程及穩(wěn)態(tài)學(xué)說(shuō)，可推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)方程為：1/V=1/Vm（1+ KmB/[B]+KmA/[A]），其中A為井岡羥胺A，B為UDPG；第二次雙倒數(shù)作圖是以底物井岡羥胺A達(dá)到飽和濃度為前提，如圖9所示，運(yùn)用單底物動(dòng)力學(xué)模型得出動(dòng)力學(xué)方程為：1/V=1/Vm（1+KmB/ [B]），1/C（UDPG）—1/V的回歸方程為y=230.43x+ 6.5323，R2=0.9932，從該回歸方程可以可以得出糖基供體UDPG的KmB值為35.275 μmol/L，酶表觀最大反應(yīng)速率Vm為0.153 μmol/（L·min），代入圖8的動(dòng)力學(xué)方程可以計(jì)算出井岡羥胺A的KmA值為8.943 μmol/L，從得出的動(dòng)力學(xué)參數(shù)可以得知，酶對(duì)底物井岡羥胺A的親和性較好，對(duì)UDPG的親和性沒(méi)有那么高，可以推測(cè)，當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，UDPG量是影響轉(zhuǎn)化率的主要因素之一。

而另一方面，通過(guò)雙倒數(shù)作圖，我們可以進(jìn)一步推測(cè)該酶的催化機(jī)制，該酶有DTG基序，且該酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的糖基構(gòu)型與供體底物的構(gòu)型是一致的，該酶屬于保留型糖基轉(zhuǎn)移酶，各種證據(jù)指向該酶的催化機(jī)制符合保留型糖基轉(zhuǎn)移酶催化機(jī)制中的雙取代機(jī)制，酶結(jié)構(gòu)上已經(jīng)存在一個(gè)親核的活性中心，于是提出該酶可能的催化過(guò)程：酶活性中心的親核基團(tuán)攻擊UDPG的異頭碳導(dǎo)致異頭碳糖苷鍵斷裂，葡萄糖與酶形成復(fù)合物，而磷酸離去基團(tuán)作為堿催化劑攻擊井岡羥胺A羥基，質(zhì)子化的井岡羥胺A親核攻擊葡萄糖與酶，最終形成井岡霉素A，金屬離子的加入，能穩(wěn)定酶活性中心的親核基團(tuán)攻擊UDPG的異頭碳產(chǎn)生的負(fù)電荷，加速磷酸離去基團(tuán)的脫離，金屬離子對(duì)催化的影響正好說(shuō)明了這一點(diǎn)，另酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)結(jié)果也支持這一推論，當(dāng)然要確認(rèn)酶催化機(jī)制，還需要更多更深入的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖8 固定UDPG濃度雙倒數(shù)作圖

圖9 固定井岡羥胺A濃度雙倒數(shù)作圖

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Studies on purification and characteristics of glycosyltransferase from an engineering strain

CHEN Xiaolong,LIAN Zhenjing,FAN Yongxian
（College of Biological and Environmental Engineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China）

The recombinant plasmid pET28b-ValG was functionally expressed in E.coli BL21 （DE3）and the overexpressed glycosyltransferase was purified sequentially by nickel affinity chromatography,ultra-filtration desalination and freeze-drying.Then the purified enzyme was characterized and it showed good stability at 10-40°C and pH 5-11.The optimum reaction temperature and pH were 30°C and 8.0,respectively.The metal ions,such as Ca2+,Mg2+,Mn2+and Co2+,activated the enzyme activity,while Cu2+and Zn2+inhibited the enzyme activity instead.The maximum enzyme activity was obtained at substrate and product concentrations of 8 μmol/L and 2 μmol/L, respectively.When sufficient validoxylamine A was added as substrate,the Lineweaver-Burk plot showed that the KmBand Vmwere 35.275 μmol/L and 0.153 μmol/（L·min）,respectively.The affinity of validoxylamine A was much better than that of the uridine diphosphate glucose（UDPG）to the glycosyltransferase,which made it necessary to study the supply of UDPG in the process of the whole-cell catalysis.

glycosyltransferase;purification;enzymatic properties

Q55

A

1674-2214（2015）02-0001-06

2014-12-15

浙江省科技廳重大科技專(zhuān)項(xiàng)重點(diǎn)農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（2012C12003-1）

陳小龍（1970—），男，浙江仙居人，教授，主要從事抗生素的發(fā)酵與結(jié)構(gòu)修飾，E-mail:richard_chen@zjut.edu.cn.