Wistar大鼠SHG-44腦膠質(zhì)瘤動物模型建立①

李英夫，李明軍，廉曉宇，宣兆博，魯艷梅，涂麗莉

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，黑龍江 佳木斯 154003)

Wistar大鼠SHG-44腦膠質(zhì)瘤動物模型建立①

李英夫，李明軍，廉曉宇，宣兆博，魯艷梅，涂麗莉

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：建立Wistar大鼠SHG-44腦膠質(zhì)瘤模型，為膠質(zhì)瘤藥物的藥效學(xué)研究提供實驗基礎(chǔ)。方法：采用立體定向技術(shù)，將體外培養(yǎng)的SHG-44膠質(zhì)瘤細胞濃縮懸液，5×106/10μL接種于Wistar大鼠的右側(cè)尾狀核區(qū)，種植后連續(xù)觀察大鼠的生存狀態(tài)，并于7d行MRI掃描，將未成瘤的大鼠去除，分別于7d、14d、21d、自然死亡幾個區(qū)間觀察大鼠的生存狀態(tài)，21d處死和自然死亡的大鼠，取腦制作病理切片，HE染色，光鏡下觀察。結(jié)果：1周內(nèi)均較活潑，全部正常，術(shù)后1～2周表現(xiàn)為表現(xiàn)為精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，食欲不振，活動減少，體重下降，步態(tài)不穩(wěn)，2周后上述癥狀加重，逐漸有死亡的大鼠。HE染色可明顯觀察到大鼠腦膠質(zhì)瘤的形成。結(jié)論：建立的Wistar大鼠SHG-44腦膠質(zhì)瘤動物模型可靠穩(wěn)定， 其腫瘤生長特性及病理特征與人腦膠質(zhì)瘤相似，可作為臨床膠質(zhì)瘤研究的理想模型。

腦膠質(zhì)瘤模型；Wistar大鼠；SHG-44； 病理學(xué)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)病率高，是顱內(nèi)常見的惡性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的35.26%～60.96%[1，2]，膠質(zhì)瘤是惡性腫瘤之一，威脅著人類的健康， 目前膠質(zhì)瘤的治療以手術(shù)治療為主，術(shù)后給予放療和化療，以及其它方面的治療，包括基因治療、免疫治療等，但是膠質(zhì)瘤的預(yù)后較差，隨著膠質(zhì)瘤研究的逐漸深入，需要建立穩(wěn)定的膠質(zhì)瘤模型，是臨床藥效學(xué)評估的基礎(chǔ)，C6膠質(zhì)瘤細胞來源于Wistar大鼠的額葉，SHG-44來源于人膠質(zhì)瘤細胞，從生物學(xué)特性上看，更接近于人的膠質(zhì)瘤細胞，將SHG-44細胞接種于Wistar大鼠右側(cè)尾狀核區(qū)，腫瘤細胞植入成功，血腦屏障也逐漸建立，因此Wistar大鼠SHG-44腦膠質(zhì)瘤模型更接近于人類的腦膠質(zhì)特性，這是更理想的膠質(zhì)瘤模型，本課題組參照其它相關(guān)文獻[3～6],成功建立Wistar大鼠SHG-44腦膠質(zhì)瘤模型，現(xiàn)將具體情況報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

SHG-44細胞株，Wistar雄性大鼠，體重160～200g。試劑主要包括：F12K培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清， 10%甲醛平衡灌注固定液胎牛血清。主要儀器包括:超凈工作臺，腦立體定向儀，倒置顯微鏡，MCO175 型二氧化碳培養(yǎng)箱， 25μL微量注射器，臺式冷凍離心機。

1.2 實驗方法

1．2.1SHG-44細胞懸液制備

SHG-44來源于人額葉星形膠質(zhì)瘤的穩(wěn)定培養(yǎng)，具有特異性標(biāo)志膠質(zhì)酸性纖維蛋白(GFAP)，SHG-44是目前較理想的細胞株，能夠穩(wěn)定的培養(yǎng)，并在Wistar大鼠尾狀核區(qū)成功植入，將復(fù)蘇成功的SHG-44細胞株，放于50cm2培養(yǎng)瓶中接種，DMEM培養(yǎng)基中含有10%滅活的胎牛血清，還含有鏈霉素100mg/mL、青霉素100U/mL、NaHCO33.7g/L，培養(yǎng)瓶置于5%CO2的培養(yǎng)箱中，溫度恒定于37℃，SHG-44細胞滿瓶后,將培養(yǎng)液傾倒出去,0.25%胰酶消化培養(yǎng)瓶中的SHG-44細胞,顯微鏡下觀察SHG-44細胞，當(dāng)細胞開始皺縮時,加入營養(yǎng)液,并反復(fù)吹打，使SHG-44細胞脫壁,并用離心機離心5min，離心轉(zhuǎn)數(shù)為1000r/min，將上清液棄出，制成106細胞/瓶的細胞懸液,接種于25cm2培養(yǎng)瓶中。

1.2．2 動物模型制作前準備

全實驗過程每周兩次注射地塞米松，0.15mg腹腔內(nèi)注射，接種前3d，每日給予地塞米松，劑量為100g體重1mg，給藥方式為灌胃，降低排斥反應(yīng)，用10%水合氯醛麻醉，給藥劑量為每100克體重0.4mL，剪去穿刺點周圍毛，面積約1.0cm×1.5cm。

1.2.3 模型制作

植入靶點為右側(cè)尾狀核區(qū)，穿刺點為矢狀縫右旁開3.5mm和前囟中點前1.0mm，麻醉滿意后，將Wistar大鼠固定于立體定向儀上，剪去穿刺點周圍毛,高效碘消毒,鋪無菌洞巾，切開內(nèi)眥連線與正中矢狀面交點向后1mm，定位預(yù)先穿刺點，牙科鉆顱骨鉆孔，直徑1.2mm，用1mm微量注射器針頭刺破硬膜，向下垂直進入硬膜下6mm, 再后撤1mm，將細胞懸液1×106/20μL，以每分鐘1μL的速度緩慢注入右側(cè)尾狀核區(qū)，穿刺針停留5min，骨蠟封閉骨孔，縫合頭皮。

1.2.4 觀察指標(biāo)

7d時進行頭部MRI檢查，將成瘤的大鼠作為實驗對象，分別于接種后的7d、14d、21d、自然死亡的幾個時間點觀察大鼠的生存狀態(tài)，包括如下幾個方面：飲食情況；肢體是否有活動障礙；顱神經(jīng)是否有功能確實；以及視覺反應(yīng)；全身抽搐和持續(xù)時間等。21d處死大鼠和死亡的大鼠進行H-E染色，光鏡下觀察[5]。

2 結(jié)果

2.1 腦瘤鼠行為學(xué)表現(xiàn)為

大鼠術(shù)后1d逐漸恢復(fù)飲食及活動，2d后基本恢復(fù)到術(shù)前狀態(tài)，1周內(nèi)均較活潑，全部正常，術(shù)后1～2周表現(xiàn)為表現(xiàn)為精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，食欲不振，活動減少，體重下降，步態(tài)不穩(wěn)，2周后上述癥狀加重，逐漸有死亡的大鼠。移植的Wistar大鼠動物50只，顱內(nèi)出血致死4%(2/50),感染致死6%(3/50),意外傷害致死2%(1/50),顱內(nèi)成瘤21只，成瘤率42%。

2.2 組織病理學(xué)

以多聚甲醛灌注主動脈，取腫瘤組織，甲醛固定，制成標(biāo)本，用HE染色，顯微鏡下表現(xiàn)為核大、染色較深，并在腫瘤中心區(qū)切片可見壞死區(qū)，邊界不清。

3 討論

膠質(zhì)瘤為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤，如何提高其治療效果，延長患者生命，科研工作者和神經(jīng)外科醫(yī)生在不斷的探索，VottorionM等認為[7]，理想的腦膠質(zhì)瘤動物模型應(yīng)具備以下特點：具備惡性膠質(zhì)瘤細胞的生物特性；體外培養(yǎng)能生長；成瘤的時間較短，能夠測定腫瘤的生長率，動物生存期穩(wěn)定；腫瘤模型與人腦膠質(zhì)瘤相似的生長特性；用于治療的模型須能夠模擬人腦膠質(zhì)瘤臨床治療過程。本課題組用立體定向方法將SHG-44細胞植入到Wistar大鼠右側(cè)尾狀核區(qū)域，成功建立Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤模型，大鼠成瘤后可出現(xiàn)明顯的行為學(xué)改變，有較典型的癥狀。H-E染色，光鏡下觀察腫瘤呈侵襲性生長，建立的Wistar大鼠SHG-44膠質(zhì)瘤動物模型基礎(chǔ)上，觀察大鼠的行為學(xué)改變，為抗膠質(zhì)瘤藥物的藥效學(xué)研究提供了借鑒，更好的選擇時間窗。

腦膠質(zhì)瘤原位移植瘤動物模型的成功建立，應(yīng)從以下幾個方面嚴格操作，現(xiàn)做如下總結(jié)，模型制作過程，要求操作精細，控制好細胞數(shù)量、細胞增殖活力、靶點的確定、進針的速度和深度以及與靶點腦組織接觸時間，細胞注射速度等方面嚴格操作，首先保證細胞的數(shù)量和活力，接種SHG-44大鼠腦膠質(zhì)瘤細胞活力應(yīng)>90%，達不到標(biāo)準不能操作，接種前將細胞懸液置于恒溫搖床中，溫度恒定于37℃，留置時間不超過90min，接種前輕輕搖晃，以保證細胞懸液均勻，接種細胞的數(shù)量是影響模型成功率的關(guān)鍵，要保證細胞的數(shù)量，其次，穿刺針進入不能過深，也不能過淺，過深會導(dǎo)致大鼠死亡，過淺細胞 會向外溢出，把握好進針深度，是模型能否成功的關(guān)鍵因素之一，注射SHG-44懸液要把握好注射速度，保證細胞懸液植入在腦內(nèi)，緩慢退針后，骨臘封閉骨孔，通常在腫瘤生長較慢的時期，進行對比實驗?zāi)芨玫嘏卸ㄖ委熜Ч鸞8]。成瘤的大鼠，7d大鼠腦內(nèi)腫瘤己經(jīng)形成，但其生存狀態(tài)良好;7～14d隨診腫瘤的生長，大鼠表現(xiàn)為食欲減退、反應(yīng)下降，14d后上述癥狀明顯，部分大鼠出現(xiàn)偏癱、眼眶淤血、精神萎靡、體重下降較快。從以上觀察看，進行藥效學(xué)觀察的時間點選在接種后10～14d為好?？傊凑丈鲜龇椒ㄟM行的腦膠質(zhì)瘤模型的制備，可以達到臨床腦膠質(zhì)瘤藥效學(xué)研究的要求，因此，Wister大鼠SHG-44腦膠質(zhì)瘤模型是可靠的動物模型。

[1]王忠誠主編. 王忠誠神經(jīng)外科學(xué)[M]. 湖北：科學(xué)技術(shù)出版社, 2004,518

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黑龍江省衛(wèi)計委課題項目，編號：2014-222。

李英夫(1979～)男，黑龍江明水人，碩士，主治醫(yī)師。

李明軍(1965～)男，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，主任醫(yī)師。E-mail:liyingfu79@sohu.com。

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1008-0104(2015)02-0024-02

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