聚合酶鏈反應(yīng)檢測梅毒螺旋體的應(yīng)用進展

薛耀華 楊斌 鄭和平

聚合酶鏈反應(yīng)檢測梅毒螺旋體的應(yīng)用進展

薛耀華 楊斌 鄭和平

梅毒的診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)，血清學(xué)檢測和梅毒螺旋體暗視野檢查。隨著人們對梅毒螺旋體基因組的認識，已經(jīng)建立了多種基于梅毒螺旋體特異性基因序列的聚合酶鏈反應(yīng)檢測方法，常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)、巢式聚合酶鏈反應(yīng)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、多重聚合酶鏈反應(yīng)和實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)可以檢測多種不同類型的臨床標本，用于梅毒螺旋體的基因檢測。聚合酶鏈反應(yīng)擴增的靶基因有tpp47、polA、bmp、tmpA、arp、tpr等，其中tpp47、polA為常用的靶基因。皮損拭子、血液、腦脊液、病理組織、羊水等均可進行聚合酶鏈反應(yīng)檢測。

梅毒；蒼白密螺旋體；聚合酶鏈反應(yīng)；基因擴增；靶基因

梅毒是由梅毒螺旋體（Tp）感染引起的全身多系統(tǒng)疾病，近年來發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題［1-2］。梅毒的防治主要在于早發(fā)現(xiàn)，早診斷和早治療［3-4］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）在梅毒診斷和流行病學(xué)方面得到了不斷地更新和完善。在過去的20多年里，已經(jīng)建立了多種基于Tp特異性基因序列的PCR檢測方法，可以檢測多種不同類型的臨床標本［5］。

作者單位：510515廣州，南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗系（薛耀華）；廣東省皮膚性病防治中心（薛耀華、鄭和平、楊斌）

1 Tp PCR檢測類型

1.1常規(guī)PCR：Tp基因是由1138006個堿基對組成的環(huán)狀DNA，有1 081個開放讀碼框架。常規(guī)PCR擴增后需做凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行鑒定，擴增產(chǎn)物容易造成假陽性污染，是早期廣泛應(yīng)用的基因診斷方法，但對Tp含量較低的標本敏感性較低［6］。

1.2 反轉(zhuǎn)錄PCR：是將1條RNA鏈反轉(zhuǎn)錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。Centurion-Lara等［7］用反轉(zhuǎn)錄 PCR檢測 Tp16S rRNA，先反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以cDNA為模板擴增366 bp的基因片段。

1.3 巢式PCR：利用兩對PCR引物進行兩輪PCR擴增反應(yīng)，第2次PCR擴增片段短于第1次擴增片段。由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴增，增加了檢測的敏感性；又有兩對PCR引物與檢測模板配對，從而增加了檢測的可靠性。Grange等［8］收集拭子標本進行巢式PCR與暗視野顯微鏡檢查，其中一期梅毒患者65例，二期梅毒44例，非梅毒患者43例，巢式PCR檢測的敏感性為82%，特異性為95%；暗視野顯微鏡檢查的敏感性為73%，特異性為88%。Grange根據(jù)Tp tpp47基因設(shè)計兩對引物，第1次擴增片段長度為1 103 bp，以此PCR產(chǎn)物為模板，第2次擴增片段長度為168 bp，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行分析。由于巢式PCR進行2次PCR反應(yīng)，操作較繁瑣。

1.4 多重PCR：在同一PCR反應(yīng)體系里有2對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)。與常規(guī)PCR方法相比，多重PCR的主要特點是高效，在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)能同時檢出多種病原微生物。Scott等［9］設(shè)計 Tp、單純皰疹病毒的特異性引物，用多重PCR檢測692例生殖器潰瘍標本，結(jié)果皰疹陽性275例，15例Tp陽性，1例梅毒和皰疹病毒雙陽性。

1.5 實時熒光PCR：實時熒光PCR融合了PCR的高靈敏性、DNA分子雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量等優(yōu)點，可直接探測PCR過程中熒光信號的變化以獲得結(jié)果，不需要PCR后處理或電泳檢測，完全閉管操作，避免了產(chǎn)物的污染。近年來，實時熒光PCR已經(jīng)成為Tp PCR檢測的主要方法，實時熒光PCR包括實時熒光定性PCR和實時熒光定量 PCR。Heymans等［10］擴增 Tp polA 基因，TaqMan探針5′端標記熒光染料FAM，3′端標記熒光淬滅基團BHQ-1，Ct值 <36判斷為陽性結(jié)果。Tipple等［11］用實時熒光定量PCR技術(shù)擴增tpp47基因，應(yīng)用SYBR GreenⅠ染料進行熒光定量，最低檢出限為10 μl模板 DNA 中有 1 個 Tp DNA。 Cruz等［12］擴增Tp polA基因，用TaqMan探針技術(shù)進行PCR定量，探針5′端標記熒光染料Cy5，3′端標記熒光淬滅基團BHQ-3，該方法的檢出限為每毫升全血標本中15～150個Tp。Cruz還檢測全血標本，發(fā)現(xiàn)二期梅毒患者Tp拷貝數(shù)范圍在194～1 954拷貝/ml。實時熒光定量PCR對于研究螺旋體在體內(nèi)的感染量有重要意義。

2 PCR擴增的靶基因

2.1 tpp47基因：tpp47基因編碼相對分子質(zhì)量為47 000膜蛋白，常規(guī)PCR、巢式PCR和實時熒光PCR應(yīng)用較多。tpp47基因在Tp亞種中均可高水平表達，而且是各種Tp亞種表達水平最高的基因之一，因此，是Tp檢測最常用的PCR靶基因。Brustain［13］用常規(guī)PCR擴增螺旋體相對分子質(zhì)量為47 000膜蛋白基因，羊膜液、新生兒血液和新生兒腦脊液的敏感性為78%。Gayet-Ageron等［14］應(yīng)用實時熒光定性PCR檢測tpp47基因，一期梅毒皮損拭子、全血、血清和尿液的敏感性分別為80%、28%、55%和29%；二期梅毒皮損拭子、全血、血清、尿液的敏感性分別為 20%、36%、47%和 44%。雷震山等［15］用巢式 PCR法對195例硬下疳棉拭子和血液標本中Tp特異性基因tpp47進行擴增檢測，所有標本同時做暗視野鏡檢和Tp-ELISA血清學(xué)檢測。結(jié)果顯示，巢式PCR檢測出陽性標本176例，其靈敏度和特異性分別為90.3%和100%。暗視野鏡檢和Tp-ELISA檢測的靈敏度分別為82.1%和84.6%，特異性分別為85.8%和93.3%。

2.2 polA基因：polA即DNA聚合酶Ⅰ，比較Tp與其他微生物polA基因的同源性，發(fā)現(xiàn)polA基因非常獨特，所有編碼的半胱氨酸多達24個，占多聚酶氨基酸總數(shù)的2.4%，而絕大多數(shù)微生物只有l(wèi)～2個，僅占0.1%，并有4個特殊的插入點，因而Tp polA基因具有較高的敏感性和特異性。Cruz等［12］應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)擴增Tp polA基因。Castro等［16］設(shè)計了擴增Tptpp47基因和polA基因的引物，檢測隱性梅毒患者的血液標本，tpp47基因的敏感性為39.1%，polA基因的敏感性為31.1%。張森淼等［17］以tpp47和polA為靶基因檢測40例隱性梅毒患者全血、血漿和血清的Tp，結(jié)果tpp47檢測全血、血漿、血清的DNA陽性率分別為30.0%、37.5%、20.0%，polA陽性率分別為22.5%、27.5%、15.0%，兩種方法檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Gayet-Ageron等［18］系統(tǒng)性評價了Tp擴增的靶基因，tpp47和polA為常用靶基因，在這兩個位置設(shè)計引物擴增Tp，PCR陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 其他靶基因：在早期梅毒PCR研究中，Bruisten［13］應(yīng)用巢式PCR反應(yīng)檢測編碼相對分子質(zhì)量為39 000的膜蛋白bmp基因，收集372例生殖器潰瘍拭子標本，PCR的敏感性為75.0%，特異性為100%；血清學(xué)檢測的敏感性為43.8%，特異性為100%。PCR檢測Tp并不僅局限于Tp DNA，16S rRNA和23S rRNA分子也可應(yīng)用于Tp的檢測。Centurion-Lara等［7］用反轉(zhuǎn)錄 PCR 檢測 Tp 16S rRNA，可以檢測到1個拷貝的梅毒螺旋體。Chen等［19］檢測Tp阿奇霉素耐藥的23S rRNA的A2058G和A2059G點突變。近年來arp和tpr作為靶基因應(yīng)用于 Tp 基因分型研究［20］。

3 PCR檢測標本類型

2013年世界衛(wèi)生組織頒布的《性傳播疾病包括人類免疫缺陷病毒實驗室診斷》一書明確指出，Tp PCR檢測的標本類型包括皮損、病理組織和體液等，這些樣本可以是新鮮的、凍存的、固定的或石蠟包埋的［21］。目前國內(nèi)外學(xué)者最常用的標本類型是一期梅毒患者生殖器潰瘍分泌物樣本和二期梅毒患者的血液樣本。

Grange等［8］應(yīng)用巢式 PCR技術(shù)擴增 tpp47基因，檢測拭子和血液標本的Tp，其中一期梅毒87例，二期梅毒103例，早期隱性梅毒40例。對于有皮損的梅毒患者，用拭子收集組織液。如果二期梅毒患者沒有潰瘍，但皮膚有斑點或丘疹，用刀刮取皮膚，盡量收集皮膚滲液。同時收集梅毒患者的血液標本，包括全血、血漿、血清和單個核細胞。作者還收集拭子標本進行巢式PCR檢測，敏感性為82%，特異性為95%；暗視野顯微鏡檢查的敏感性為73%，特異性為88%。178例一期和二期梅毒患者，單個核細胞、血漿、血清和全血樣本的敏感性為12%～38%，40例早期隱性梅毒患者的敏感性為4%～16%，一期、二期和早期隱性梅毒患者血標本總特異性為92%～97%。

Dumaresq等［22］應(yīng)用實時熒光PCR檢測122例HIV感染的早期梅毒患者的腦脊液，評價PCR在神經(jīng)梅毒診斷中的價值。PCR檢測的敏感性為58%，特異性為67%，PCR檢測可輔助診斷神經(jīng)梅毒。Castro等［16］發(fā)現(xiàn)，晚期隱性梅毒患者耳垂刮取液的Tp檢出率最高，為56%，血漿、全血和血清分別為42.9%、38.1%和25%，作者認為耳垂血最適合做隱性梅毒患者PCR檢測。目前文獻顯示，只有Castro采用耳垂血進行梅毒PCR檢測，尚無其他學(xué)者進行耳垂血的PCR研究，耳垂血的優(yōu)勢還需要更多的實驗來證實。

4 PCR的應(yīng)用

4.1 一期梅毒：臨床表現(xiàn)主要為硬下疳，因此一期梅毒患者主要取潰瘍組織液標本進行PCR檢測。Müller等［23］研究 4例一期梅毒的皮損組織病理標本，PCR全部陽性。 Shields等［24］檢測55例一期梅毒患者的生殖器潰瘍、直腸拭子和口腔潰瘍標本，49例PCR陽性，敏感性為89.1%，特異性為99.1%。Gayet-Ageron等［14］研究26例一期梅毒患者，發(fā)現(xiàn)潰瘍拭子陽性率為80%，全血為28%。目前認為，一期梅毒患者潰瘍拭子PCR檢測的敏感性高，適用PCR檢測。尤其是血清學(xué)陰性的極早期梅毒患者，檢測更有臨床意義。

4.2 二期梅毒：臨床表現(xiàn)主要是皮膚黏膜損害，包括斑疹、丘疹等，外陰及肛周的濕丘疹或扁平濕疣為其特征性損害。Müller等［23］研究34例二期梅毒皮損組織病理標本，發(fā)現(xiàn)26例PCR檢測陽性（76%）。Shields等［24］收集22例二期梅毒患者梅毒疹拭子和黏膜皮損拭子，11例PCR陽性，敏感性為50%，特異性為100%。Gayet-Ageron等［14］研究40例二期梅毒患者，全血PCR陽性率為36%。以上研究提示，二期梅毒血液標本的陽性率<40%，PCR檢測不適用于二期梅毒患者的診斷。

4.3 三期梅毒：可有一期或二期梅毒史，病程2年以上。Müller等［23］研究7例三期梅毒的皮損組織病理標本，1例PCR檢測陽性（14%）。三期梅毒的PCR陽性率很低，不適用PCR檢測。

4.4 神經(jīng)梅毒：為Tp侵犯神經(jīng)系統(tǒng)所致，采集腦脊液檢測。Dumaresq等［22］研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)梅毒患者腦脊液PCR的敏感性為58%，特異性為67%。García等［25］檢測了8例神經(jīng)梅毒患者的腦脊液，敏感性為50%。Molepo等［26］采集50例懷疑神經(jīng)梅毒患者的腦脊液，PCR檢測28例陽性，陽性率為56%，腦脊液PCR檢測陽性可輔助診斷神經(jīng)梅毒。

4.5 胎傳梅毒：我國梅毒診療指南指出，暗視野顯微鏡檢查，或鍍銀染色在早期胎傳梅毒皮膚、黏膜損害及組織標本中查到螺旋體，或Tp核酸檢測陽性可確診為胎傳梅毒［4］。Michelow 等［27］研究 76 例未接受抗生素治療的梅毒孕婦分娩的胎兒，17例腦脊液PCR檢查螺旋體陽性，其中15例胎兒體檢符合胎傳梅毒的診斷。

綜上所述，實時熒光PCR為梅毒PCR檢測的主要方法，PCR擴增的靶基因主要有tpp47和polA。梅毒PCR檢測主要適用于一期梅毒的潰瘍拭子，其他各期梅毒標本檢測陽性率較低，用于輔助診斷梅毒。

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Detection ofTreponema pallidumwith PCR

Xue Yaohua*,Yang Bin,Zheng Heping.
*Department of Clinical Laboratory,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China

The diagnosis of syphilis is mainly based on clinical manifestations,serological analysis,and dark-field microscopy for detection ofTreponema pallidum.With further clarification of the genomic sequence ofTreponema pallidum,several PCR methods based onTreponema pallidum-specific gene sequences have been developed during the last 20 years.Classical PCR,nested-PCR,reverse transcription-PCR,multiplex PCR and real-time fluorescent PCR can be used to amplifyTreponema pallidumDNA in different types of clinical specimens,including lesion swabs,blood,cerebrospinal fluid,biopsy tissue,amniotic fluid,and so on.The target genes for PCR amplification include tpp47,polA,bmp,tmpA,arp and tpr,with tpp47 and polA as the most common target genes.

Syphilis;Treponema pallidum;Polymerase chain reaction;Gene amplification;Targeted gene

Zheng Heping,Email:zhhpf@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.06.018

廣東省科技廳計劃項目（2011B031800225）

鄭和平，Email:zhhpf@hotmail.com

2014-12-02）