天津博物館文物庫房部分文物與囊匣中霉菌的分離與鑒定

張艷紅，劉自軍，劉根亮，李 彬，潘 皎，馬清林

(1． 天津博物館，天津 300201； 2． 分子微生物學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室(南開大學(xué))，天津 300071； 3． 南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物系，天津 300071； 4． 山東大學(xué)文化遺產(chǎn)研究院，山東濟南 250100 )

0 引 言

館藏文物中的書畫、古籍、紡織品和竹木漆器等有機質(zhì)文物，常常遭受霉菌的破壞。霉菌在生長代謝過程中產(chǎn)生的有機酸會使文物材料遭到酸腐蝕，且代謝產(chǎn)物可能污染文物表面形成單一色或混合色的霉斑；有機質(zhì)文物材料作為營養(yǎng)基被微生物分解，使文物機械強度顯著下降，這是文物遭到破壞的原因之一。絲狀真菌通過發(fā)達(dá)的菌絲體覆蓋文物，并向文物內(nèi)部滲透吸收營養(yǎng)，對文物造成機械破壞[1]。對文物表面霉菌的鑒定與研究是文物保護工作的重要內(nèi)容，也是實施有效防治措施的基礎(chǔ)。例如，馬淑琴[2]對發(fā)霉書畫文物做實驗分析，發(fā)現(xiàn)霉菌種類有黑曲霉、黃曲霉和綠色木霉等；唐歡等[3]采集的書畫污染霉菌有曲霉屬，如黑曲霉、黃曲霉和米曲霉。申艾君等[4]對館藏竹木漆器文物表面霉斑進行實驗研究，鑒定出曲霉屬和脈孢菌屬等霉菌。2016年初，天津博物館文物庫房的部分有機質(zhì)文物中有明顯的菌斑出現(xiàn)，針對這些霉菌進行采樣、培養(yǎng)、分離與鑒定，以期為今后的防治工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1培養(yǎng)基 霉菌的分離純化使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L，自然pH(配完培養(yǎng)基后不用調(diào)節(jié)pH，PDA培養(yǎng)基的自然pH為7.0左右)。

1．1．2主要試劑 50 mol/L Tris-HCl(pH 8)，10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 8)，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，苯酚，氯仿，異丙醇，無水乙醇等購自北京伊諾凱科技有限公司。RNaseA(TakaRa)，Transtaq-T DNA聚合酶等購自大連寶生物工程公司。Trans 2K Plus DNA標(biāo)記，10×PCR緩沖液，6×DNA Loading緩沖液等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1．1．3主要儀器 DL-CJ-1NDII型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；HVA-85型高壓滅菌鍋(日本HIRAYAMA)；Nikon ECLIPSE 80i型生物顯微鏡；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；電熱培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；全溫恒溫?fù)u床(上海智城分析儀器制造有限公司)；PCR擴增儀(Mastercycler gradient，Eppendorf公司)；凝膠成像儀(ChemiDocTM XRS，Bio-Rad公司)等。

1．2 方法

1．2．1樣品采集 天津博物館文物庫房位于地下一層，面積約11 000 m2，收藏文物近20萬件。2016年初，在A1庫、A8庫、A18庫和C7庫內(nèi)的部分囊匣(其內(nèi)部保存的文物表面未出現(xiàn)霉斑)和文物上發(fā)現(xiàn)霉斑。4月7日，針對這4個庫房內(nèi)的霉斑進行采樣分析，采樣方式為無菌棉簽蘸取菌斑，然后在PDA培養(yǎng)皿中劃線，其中樣品(a)取自A8庫房的紙質(zhì)書畫囊匣，樣品(b)和(c)分別取自A1庫房的木質(zhì)筆筒囊匣和木質(zhì)漆盒文物，樣品(d)、(e)和(f)分別取自C7庫房的藏式皮箱-1、藏式皮箱-2和雕花鳥紋方桌，各個樣品特征見圖1。

1．2．2霉菌的分離 將取回的樣品置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，PDA平板上出現(xiàn)絲狀真菌。選擇分離效果明顯，菌落形態(tài)、顏色多樣的平板，分別挑取單菌落進行劃線純化，分離2～3次。純化得到的菌株置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3DNA的提取 對純化得到的真菌進行液體培養(yǎng)，菌絲尖端接種轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃下120 r/min搖床培養(yǎng)2 d，利用真空抽濾泵獲取菌絲，提取DNA采用CTAB法[5]。

1．2．4ITS序列的擴增 真核生物ITS序列(Internal Transcribed Spacer)具有廣泛的序列多態(tài)性，即使是親緣關(guān)系非常接近的兩個物種在ITS序列上也會表現(xiàn)出差異，廣泛應(yīng)用于真核生物的鑒定中。擴增真核生物ITS序列使用引物ITS1(5’-TCCGT AGGTGAACCTGCGG-3’)/ITS4(5’-TCCTC CGCTTATT GATATGC-3’)[6]。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。PCR過程在50 μL的體系中(10×PCR緩沖液5 μL，2.5 mmol/L dNTP混合物4 μL，10 mmol/L ITS1 2 μL，10 mmol/L ITS4 2 μL，DNA 2 μL，5 U/μL Transtaq-T DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 34.5 μL)進行擴增。PCR反應(yīng)程序為預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火54 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 40 s，反應(yīng)30個循環(huán)，延伸72 ℃ 10 min。

1．2．5PCR產(chǎn)物的純化與測序 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢PCR產(chǎn)物，將得到的PCR產(chǎn)物均采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit進行純化回收。將純化后的PCR產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序，將測序結(jié)果提交到GenBank，采用NCBI Blast功能進行同源比對，采用以下標(biāo)準(zhǔn)(s：待測序列與數(shù)據(jù)庫中序列的相似度)。真菌ITS基因間隔區(qū)：s≥99%為同種；95%

2 結(jié) 果

2．1 分離純化與形態(tài)觀察

通過2～3次的平板劃線分離，從不同的文物表面共分離出14株真菌，利用Nikon ECLIPSE 80i型生物顯微鏡對其進行觀察分析。從菌落形態(tài)、顏色、生長速度以及顯微形態(tài)初步分為A類(菌株TJM 2、4、6、9、10和11)、B類(菌株TJM 7和8)、C類(菌株TJM 12和13)、D類(菌株TJM 1)、E類(菌株TJM 3)和F類(菌株TJM 5和14)，共6類，各類的形態(tài)特征見圖2。

2．2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

對測序獲得的14株菌株的ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知的ITS序列進行同源性比對，待測菌株與數(shù)據(jù)庫中參照序列的同源性大于或等于99%(菌株TJM 3和菌株TJM 6與數(shù)據(jù)庫中參照序列的同源性分別是98%和94%)，分別對應(yīng)毛殼菌屬(Chaetomium)、曲霉屬(Aspergillus)、枝孢屬(Cladosporium)、畸枝霉屬(Malbranchea)、派倫霉屬(Peyronellaea)和Comoclathris(暫無對應(yīng)的中文名稱)。將獲得的14株菌株的ITS序列提交到NCBI GenBank，獲得登錄號KY823597-KY823610。每個菌株的比對結(jié)果如表1所示。

表1 14株菌株的ITS序列同源性比對

(續(xù)表1)

注： 樣品a和c未培養(yǎng)出真菌。

在本次采樣的4個庫房中，A1庫和C7庫的樣品培養(yǎng)分離出了霉菌，其余兩個庫房沒有分離出菌種。A1庫的文物囊匣上分離出三株霉菌，鑒定結(jié)果是毛殼菌屬、派倫霉屬和Comoclathrissp．。C7庫的三件文物上分離出11株霉菌，其中藏式皮箱-1上分離出五株，鑒定結(jié)果是毛殼菌屬、曲霉屬和枝孢屬；藏式皮箱-2上分離出四株，鑒定結(jié)果是毛殼菌屬、曲霉屬、畸枝霉屬，雕花鳥紋方桌上采樣鑒定結(jié)果是毛殼菌屬。本次實驗結(jié)果表明，毛殼菌屬菌株數(shù)量最多，在A1庫和C7庫均有出現(xiàn)；C7庫內(nèi)文物表面滋生霉菌狀況最為嚴(yán)重，亟待采取有效防治措施。

3 討 論

一些霉菌不僅對人體有直接影響，同時也是侵害不同質(zhì)地文物的重要真菌[8]，其可分解各種有機物質(zhì)，輕則損害文物的機械強度或展示效果，重則導(dǎo)致文物面貌全非[9]。因此，對霉菌種屬的鑒定可以更有針對性地選擇和使用抑制劑，為后續(xù)的微生物防治工作提供一定依據(jù)。本實驗分離得到14株霉菌菌株，通過形態(tài)學(xué)觀察及真菌ITS序列進行序列比對分析，將其鑒定為毛殼菌屬、畸枝霉屬、曲霉屬、派倫霉屬、枝孢屬和Comoclathris。其中毛殼菌屬數(shù)量最多，占到了6株。毛殼菌屬廣泛分布于自然界中各種含纖維素的基物上，是造成紙類和其他含纖維素材料生物降解的主要病害真菌之一[10-11]。球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)是毛殼菌屬的一種，其適宜生長溫度是18～28 ℃，高于37 ℃不能夠生長；適宜生長的pH值為6～8[12]。曲霉屬更是分布廣泛，土壤和各種有機物上均有分布，在諸多博物館中，也常會有曲霉屬的檢出[13-15]。黃曲霉(Aspergillusflavus)最適生長溫度為37 ℃，且在12～48 ℃的溫度范圍內(nèi)均可生長。黃曲霉可分泌Ⅰ型和Ⅱ型α-D-木糖苷酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶和脂酶等其他酶類，在侵染寄主的過程中降解寄主組織，提供豐富的營養(yǎng)成分[16]。樟絨枝霉(Malbrancheacinnamomea)是畸枝霉屬的一種，其最適生長溫度為45 ℃[17]，屬于嗜熱真菌，能同時分泌多種纖維素降解酶[18]。派倫霉屬可產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶和果膠酶，可在較寬的pH范圍(2.0～9.5)營養(yǎng)液中生長[19]，菌絲生長和產(chǎn)孢最適溫度都為25 ℃[20]。

本次實驗涉及的文物材料均為有機質(zhì)，用于保存書畫、木質(zhì)筆筒和硯臺等文物的囊匣為傳統(tǒng)工藝制作，所用材料有紙板、紡織品和棉質(zhì)填充物等。藏式皮箱為木質(zhì)箱體，外表覆蓋一層皮質(zhì)。雕花鳥紋方桌屬于木質(zhì)文物。霉菌對不同質(zhì)地文物材料的腐蝕破壞過程不盡相同，現(xiàn)以紙張、木質(zhì)文物、顏料和皮質(zhì)文物為例進行分析。紙張和木質(zhì)文物屬于植物纖維，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等組成，其中纖維素在霉菌分泌的多種生物酶作用下，會發(fā)生一系列水解反應(yīng)，生成單糖葡萄糖。由于生成的葡萄糖不穩(wěn)定，徹底氧化后會釋放能量，部分能量儲存在機體內(nèi)供微生物生理活動的需要，部分以熱的形式散發(fā)出去[21]。從而引起溫度和濕度的變化并導(dǎo)致霉菌生長繁殖的加速，引發(fā)惡性循環(huán)[22]，對文物造成進一步的損害。繪畫顏料分為礦物顏料和植物顏料。顏料層往往是彩繪類文物的主要部分和精華所在。礦物顏料中的膠結(jié)材料為有機膠粘劑，這些是霉菌繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。霉菌形成的可溶性色素直接造成彩繪色度的改變，在生長代謝過程中形成大量的草酸鹽[23]，并使顏料晶體的晶形發(fā)生變化[24]。微生物的作用可使鉛丹的價態(tài)改變，在鉛丹的色變中起著重要的作用[25]。皮質(zhì)文物主要是由蛋白質(zhì)和脂肪組成，皮質(zhì)中的蛋白質(zhì)被霉菌分泌出的蛋白酶(特別是一些能水解膠原纖維的酶類)水解為可以溶于水的小分子氨基酸，皮質(zhì)中的脂肪類物質(zhì)被霉菌分泌出的酯酶分解為小分子的甘油和脂肪酸等物質(zhì)，以及皮質(zhì)中還存在的少量的無機物質(zhì)等，都會成為霉菌所需的營養(yǎng)源[26]。霉變過程不僅影響皮質(zhì)文物的外觀，而且會顯著降低其物理力學(xué)性能[27]。

本次實驗的采樣時間在2016年4月初，此時北方冬季供暖已經(jīng)結(jié)束，夏季供冷還未開始，空氣濕度處于一年中相對干燥的時期。在對菌斑進行采樣時，A1庫內(nèi)溫度為20.5 ℃，相對濕度為53.2%；C7庫內(nèi)溫度為20.9 ℃，相對濕度為50.3%。通過對庫房內(nèi)溫濕度的連續(xù)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，2016年上半年多數(shù)庫房的溫度在16～24 ℃的范圍內(nèi)，相對濕度在40%～80%的范圍內(nèi)[28]。值得注意的是，C7庫中藏式皮箱和方桌是2012年由海關(guān)移交入庫收藏的同批次文物，該批文物在入庫前進行了消毒處理。對于此次霉菌爆發(fā)的原因，受短期內(nèi)空氣濕度的影響可能不大，需要對長霉文物與囊匣的使用材料、制作工藝和保存狀況等進行綜合分析。

霉菌的治理與預(yù)防是一項棘手的工作，由于霉菌的生長與濕度、空氣運動和溫度有關(guān)，當(dāng)相對濕度大于70%，即便保持低溫，也很有可能導(dǎo)致霉菌滋生；在空氣流通狀況差的區(qū)域，相對濕度不應(yīng)超過65%，以免藏品發(fā)霉[29]。在今后需繼續(xù)加強庫房溫濕度、污染氣體和霉菌等環(huán)境因素的長期監(jiān)測[30]，結(jié)合對發(fā)霉有機質(zhì)文物材料成分分析與霉菌鑒定的科學(xué)實驗，試圖解釋有機質(zhì)文物中霉菌發(fā)生原因，以期對以后的霉菌防治工作提供科學(xué)依據(jù)[31]。

4 結(jié) 論

在對天津博物館文物庫房中部分文物與囊匣上出現(xiàn)的霉斑進行采樣、培養(yǎng)、分離和鑒定后發(fā)現(xiàn)，毛殼菌屬數(shù)量最多，曲霉屬次之，多數(shù)為能對文物產(chǎn)生危害的常見菌種。這些菌種能在不同文物質(zhì)地和囊匣上生長，且能適應(yīng)文物庫房的溫濕度等環(huán)境條件，如何對其實施有效防治是迫切需要解決的問題。本實驗過程中，利用分子生物學(xué)的方法將病害直接鑒定到屬的水平，較形態(tài)學(xué)鑒定更快速高效。由于采樣點有限，分離得到的病害真菌種類少，不能全面反應(yīng)文物庫房的真菌污染情況；且所分離得到的真菌絕大部分是從文物材料表面直接取樣得到的，今后可與空氣中真菌取樣實驗加以對比研究。