UPLC-MS/MS快速測定甘藍類蔬菜中活性成分萊菔硫烷

李占省，劉玉梅*，方智遠，楊麗梅，莊 木，張揚勇，李凌云，呂紅豪，孫培田

(1．中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京100081;2．農(nóng)業(yè)部蔬菜品質(zhì)監(jiān)測檢驗中心，北京100081)

十字花科蕓薹屬蔬菜(Brassica oleracea)如甘藍、白菜、青花菜、花椰菜、芥藍、苤藍等含有豐富的粗纖維、蛋白質(zhì)、維生素C和一些礦物質(zhì)如鈣、磷、鐵、鋅等。其中，蕓薹屬甘藍類蔬菜如青花菜、甘藍、羽衣甘藍等還含有一種抗癌活性成分——萊菔硫烷(Sulforaphane，SF)(圖1)。萊菔硫烷分子量為177．29，是一種異硫氰酸鹽類物質(zhì)。它在蔬菜中以4-甲亞磺?；』蜻?Glucoraphanin，GRA或RAA)的形式存在于植物液泡中。GRA自身并無生物活性，只有當細胞遭到破壞時才與細胞基質(zhì)中黑芥子酶發(fā)生水解反應，生成萊菔硫烷［1－2］。研究表明，萊菔硫烷能夠顯著降低多種癌癥的發(fā)病率如胃癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌等。此外，它在治療近視、老年癡呆和心腦血管疾病方面也有一定的功效［3－10］。

圖1 萊菔硫烷結(jié)構式

萊菔硫烷的檢測方法有氣相色譜(GC)、氣相色譜－質(zhì)譜(GC-MS)和高效液相色譜(HPLC)［11－12］。目前，人們多采用HPLC法測定萊菔硫烷含量，但萊菔硫烷在高溫下不穩(wěn)定且易降解，所以GC和GC-MS法逐漸被HPLC替代。由于HPLC法往往需要較長的洗脫時間或沖洗時間，檢測比較耗時［13］。因此，建立一種快速、準確檢測蔬菜中萊菔硫烷的方法，對于提高工作效率和減少試劑消耗具有重要價值。筆者采用酶解－萃取法提取萊菔硫烷，以甲醇和水為流動相，建立一種快速檢測萊菔硫烷的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)。

1 材料與方法

1．1 試驗材料 萊菔硫烷標準樣品購于美國LKTTM，純度大于98%。將10 mg標準品用甲醇(HPLC)定容到10 ml棕色容量瓶中，配制成1 000 mg/L的母液，在－20℃低溫、避光保存。根據(jù)需要吸取一定量的母液，將其分別稀釋成0．1、0．5、1．0、5．0、10．0 和 20．0 μg/L 系列標準液。

1．2 樣品采集 甘藍類蔬菜被栽培于中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所試驗基地。分別對甘藍類蔬菜可食性部分(商品器官)進行取樣，即甘藍(葉球)4份、青花菜(花球)4份、芥藍(花薹)4份和苤藍(球莖)4份。取樣后，將其去雜、擦干，然后根據(jù)需要將一定量樣品進行液氮處理，真空冷凍、干燥。

1．3 樣品前處理 將真空冷凍、干燥好的樣品統(tǒng)一機械粉碎成粉末，精確稱取干燥樣品0．5 g，按照料液比為1∶30的比例加入pH為7．0的緩沖液(磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀配制，0．1 mol/L)，在室溫下酶解1．5 h，加入30 ml乙酸乙酯進行萃取，5 500 r/min離心10．0 min，收集上清液，重復萃取2次后合并3次萃取液，將萃取液在35℃下旋轉(zhuǎn)蒸干，最后用10．0 ml甲醇定容，過濾膜(0．22 μm)，低溫 －20 ℃保存。

1．4 色譜－質(zhì)譜條件

1．4．1 色譜條件。Waters BEH 反相 C18(2．1 mm × 50．0 mm，1．7 μm)，柱溫30 ℃，流速0．25 ml/min，進樣量10 μl，流動相為甲醇和水。方法為梯度洗脫，即B泵(甲醇)初始濃度為40%，A泵為60%，10 min時B泵變?yōu)?00%，13 min時變?yōu)?0%，A泵又重新變?yōu)?0%，結(jié)束此次進樣。

1．4．2 質(zhì)譜條件。電噴霧離子源ESI(+)，毛細管電壓為3．0 kV，離子源溫度為110℃，脫溶劑氣溫度為350℃，脫溶劑氣流量為500 L/h，錐孔反吹氣流量為50 L/h。檢測模式為多反應監(jiān)測掃描模式(MRM)，見表1。保留時間為2．17 min。

表1 多反應監(jiān)測

2 結(jié)果與分析

2．1 樣品提取條件的優(yōu)化 萊菔硫烷具有旋光性，在高溫和強酸堿條件下極不穩(wěn)定［14］。萊菔硫烷前體GRA在不同的pH條件下生成的次生代謝產(chǎn)物不同，在pH 3．0～5．0時以腈類為主，在中性條件下以異硫氰酸酯類為主，而萊菔硫烷就屬于該組分，在偏堿條件下以硫氰酸酯類為主，因此要提高萊菔硫烷的生成量，就必須嚴格控制酶解條件的pH環(huán)境［15－16］。

對萊菔硫烷萃取劑的選擇，多采用乙酸乙酯［17］。該研究對乙酸乙酯、乙腈和二氯甲烷等有機溶劑展開了研究。乙腈與水互溶，分離比較困難;二氯甲烷具有中等毒性，微溶于水，與水接觸后會緩慢釋放出氯化氫氣體，且其濃度比水大，分離繁瑣;乙酸乙酯為萃取劑，不但可以降低成本和毒性，其濃度比水小，不溶于水，易收集上清液。從表2可以看出，乙酸乙酯加樣回收率為94% ～97%，能夠滿足試驗和生產(chǎn)需要。

2．2 色譜柱的選擇 萊菔硫烷是一種飽和異硫氰酸鹽，而流動相中甲醇濃度始終≥40%。Waters BEH反相C18(2．1 mm×50．0 mm，1．7μm)柱具有較好的峰對稱性和穩(wěn)定的柱效。1．7μm柱是通用的超高效液相色譜柱，具有較好的pH適應性，能夠在1．0～12．0的范圍內(nèi)進行分離。三鍵鍵合式烷基柱使其具有較好的選擇性和靈敏度。該研究表明，Waters BEH C18柱能夠很好地分離和檢測目標成分。

2．3 色譜條件的選擇 常用的流動相有甲醇和水、乙腈和水。該研究采用梯度洗脫的方法，研究流動相分離萊菔硫烷的效果。從保留時間、雜質(zhì)干擾程度、峰形和基線漂移等方面進行比較，發(fā)現(xiàn)在流速為0．25 ml/min，洗脫程序如表1所述條件下，萊菔硫烷能夠快速地被分離和檢測，保留時間為2．17 min，峰形對稱，無雜質(zhì)干擾(圖2)。因此，最終選用甲醇和水作為流動相。

圖2 樣品中萊菔硫烷的MRM圖譜

2．4 質(zhì)譜條件的選擇 將萊菔硫烷的標準液直接進樣后全掃描，找出目標的分子離子峰，對其轟擊產(chǎn)生子離子。在MRM模式檢測條件下，將分子離子和1～2個信號強度適宜的子離子組成監(jiān)測離子對，使得特征例子的豐度和比例達到最優(yōu)。

2．5 線性范圍和檢出限 將系列標準液(0．1、0．5、1．0、5．0、10．0和20．0 μg/L)進行測定，以峰面積(Y)為縱坐標，以濃度為橫坐標進行回歸分析，獲得線性方程。結(jié)果表明，線性方程為 Y=3．69e－4X － 1．27，R2=0．999 4，標準偏差為2．4%(RSD，n=6)，可見線性方程良好。根據(jù)前處理過程，計算出儀器檢出限(LOD，S/N=3)為0．06 ～0．15 μg/L，定量下限(LOQ，S/N=10)為0．3 ～0．4 μg/L，表明該方法具有較高的靈敏度，能夠進行萊菔硫烷的準確檢測。

2．6 準確度和精密度 分別以1．0和5．0μg/L 2個濃度進行加樣，測定回收率和精密度。從表2可以看出，萊菔硫烷加樣回收率為94% ～97%，相對標準偏差為0．6% ～1．2%，表明該方法準確度和精密度較好。

2．7 樣品測定 根據(jù)建立的UPLC-MS/MS檢測體系，對甘藍類蔬菜4個變種共計20份材料進行測定。從表3可以看出，在供試材料中均檢測到萊菔硫烷成分，且變種材料間存在差異。檢測結(jié)果表明，在4種甘藍變種中萊菔硫烷含量平均值分別為 38．65、376．54、151．31 和 133．79 mg/kgDW，可見青花菜花球中平均含量最高，甘藍葉球中含量最低，芥藍和苤藍含量間差別不大。

表2 萊菔硫烷回收率的測定

表3 蔬菜樣品中來萊菔硫烷含量mg/kgDW

3 結(jié)論

該研究用Waters BEH C18柱，以甲醇和水為洗脫溶劑，采用梯度洗脫的方法可準確、快速分離目標物萊菔硫烷，峰形對稱。該方法準確可靠，快速靈敏，能夠滿足在蔬菜中快速檢測萊菔硫烷的需要。研究表明，在4個甘藍類蔬菜變種中均能檢測到萊菔硫烷成分，甘藍葉球中萊菔硫烷含量為20．46 ～58．05 mg/kgDW，青花菜花球中含量范圍為85．17 ～607．95 mg/kgDW，芥藍花薹中含量范圍為 45．59 ～210．12 mg/kgDW，苤藍球莖中含量范圍為 40．51～205．33 mg/kgDW，可見該法能夠滿足試驗和生產(chǎn)需要。

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