正交設(shè)計(jì)優(yōu)選橘紅痰咳顆粒提取工藝的研究

錢(qián) 方，薛非凡，莫慧琴

（1．襄陽(yáng)市食品藥品監(jiān)督管理局 食品藥品檢驗(yàn)所， 湖北 襄陽(yáng) 441021；2.襄陽(yáng)市中心醫(yī)院， 湖北 襄陽(yáng) 441021）

橘紅痰咳顆粒收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第14冊(cè)，功能主治為理氣祛痰、潤(rùn)肺止咳，用于感冒、支氣管炎、咽喉炎引起的痰多咳嗽、氣喘。處方由化橘紅、百部（蜜制）、苦杏仁、茯苓、水半夏（制）、五味子、白前、甘草組成。由于制法中只規(guī)定了提取溶媒為水和提取次數(shù)，沒(méi)有規(guī)定浸泡時(shí)間、加水量和提取時(shí)間，為此以化橘紅中柚皮苷為考查指標(biāo)，用正交設(shè)計(jì)對(duì)水提工藝進(jìn)行了優(yōu)選試驗(yàn)，采用正交設(shè)計(jì)L9（34），進(jìn)行方差分析，以確定各因素中的顯著性水平，從而優(yōu)選出橘紅痰咳顆粒最佳提取工藝參數(shù)。

一、儀器與試劑

LC-10A高效液相色譜儀，SPD-10AVP紫外檢測(cè)器，CBM-102工作站，均由日本島津儀器（蘇州）有限公司提供；超聲波清洗器（功率100 W，頻率40 kHz），由昆山市超聲儀器有限公司提供；柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)110753-200413），由中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供；甲醇為色譜純，其它試劑為分析純。

二、方法與結(jié)果

（一）揮發(fā)油的提取工藝

分別稱(chēng)取處方量的化橘紅和苦杏仁至蒸餾器中，水蒸汽蒸餾，提取揮發(fā)油；另器收集備用。

（二）藥材提取工藝

按處方比例,稱(chēng)取處方量藥材化橘紅、苦杏仁加8倍量水浸泡24 h，水蒸汽蒸餾至提盡揮發(fā)性成分，藥液過(guò)濾，濾液另器收集；藥渣與其余6味藥材加水煎煮2次，濾過(guò)；合并濾液，濃縮至稠膏狀（相對(duì)密度為1.18～1.20，80℃），加乙醇使含醇量達(dá)75%～85%；靜置（過(guò)夜），取上清液回收乙醇，濃縮到適量，定容至250 ml。

（三）提取工藝篩選

以L(fǎng)9（34）正交表安排試驗(yàn)，工藝優(yōu)選因素及水平見(jiàn)表1。提取結(jié)束后，合并濾液減壓濃縮至一定體積（250 ml），并測(cè)定柚皮苷的含量。

表1 提取工藝優(yōu)選因素與水平

（四）HPLC法測(cè)定柚皮苷含量的方法學(xué)驗(yàn)證

1.色譜條件： 使用DiscoveryC18（5um，150mm×4.6 mm）為色譜柱；以甲醇-醋酸-水（35∶4∶61）為流動(dòng)相；流速1 ml/min；柱溫為室溫（25℃）；檢測(cè)波長(zhǎng)為 283 nm；進(jìn)樣量 10 μl。[1-8]

2.供試品溶液制備：精密量取提取液2 ml，置50 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

3.對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取柚皮苷對(duì)照品20 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻；精密量取3 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻即得（每 1 ml中含柚皮苷 60 μg）。

4.陰性對(duì)照溶液的制備：取無(wú)化橘紅的所有藥材按制法操作，制得無(wú)化橘紅的陰性對(duì)照品溶液。

5.檢測(cè)波長(zhǎng)選擇：取柚皮苷對(duì)照品溶液在200～400 nm作波長(zhǎng)掃描，樣品在283 nm有最大吸收。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm。

6.準(zhǔn)確度（加樣回收試驗(yàn)）：精密稱(chēng)取已知含量的橘紅痰咳顆粒 (含柚皮苷9.68 mg/g)9份，其中0.08 g、0.1 g和0.12 g各3份，每份分別精密加入（0.136 mg/ml）柚皮苷對(duì)照液10.00 ml，照含量測(cè)定項(xiàng)下操作，測(cè)定柚皮苷的含量，計(jì)算回收率。平均回收率為98.5%，RSD=0.77%（n=9），符合含量測(cè)定要求。

7.精密度試驗(yàn)：取樣品含量測(cè)定樣品溶液6份，各進(jìn)樣10 μl，注入液相色譜儀。測(cè)定峰面積RSD為1.46%，表明本試驗(yàn)精密度良好。

8.專(zhuān)屬性（陰性對(duì)照試驗(yàn)）：取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液照含量測(cè)定項(xiàng)下操作，陰性對(duì)照溶液在與主峰保留時(shí)間處無(wú)吸收峰。在上述條件下，對(duì)照品保留時(shí)間與峰形均理想，樣品中主峰能與其他峰很好分離（見(jiàn)圖1），說(shuō)明陰性無(wú)干擾。

圖1 橘紅痰咳顆粒HPLC色譜圖

9.溶液的穩(wěn)定性：取含量測(cè)定項(xiàng)下的樣品溶液，間隔1 h測(cè)一次，觀(guān)察其溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果樣品溶液至少在6 h內(nèi)是穩(wěn)定的（RSD=1.098%）。

10.線(xiàn)性與范圍：精密稱(chēng)取柚皮苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解并配制成濃度分別為 13.6 μg/ml、27.20 μg/ml、40.80 μg/ml、68.00 μg/ml、108.80 μg/ml、136.00 μg/ml的一系列溶液,取樣10 μl，注入液相色譜儀,結(jié)果峰面積（A）分別為 152 552、316 293、464 811、805 261、1 324 796、1 629 188，回歸方程為：Y=12186.5A-18908.89；r=0.999 8（n=6）。提示柚皮苷在 13.60μg/ml～136.00 μg/ml濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

11.耐用性試驗(yàn)：改變流動(dòng)相中有機(jī)相的量（±5%）、流動(dòng)相的 PH（±0.2PH）、柱溫（25℃，40℃）、流速（±0.2 ml），觀(guān)察對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果提示，改變流動(dòng)相中有機(jī)相的量、PH值、柱溫、流速，對(duì)結(jié)果幾乎無(wú)影響，說(shuō)明耐用性較好。

三、數(shù)據(jù)處理及方差分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)L9（34）計(jì)算表

因本試驗(yàn)中無(wú)空白項(xiàng),故直接以最小值為誤差估計(jì)值來(lái)檢驗(yàn)各因素的顯著性,方差分析見(jiàn)表3。[9]

表3 方差分析表

根據(jù)柚皮苷含量測(cè)定的數(shù)據(jù),分別計(jì)算各因素的離差平方和及第2類(lèi)離差。因?yàn)楸驹囼?yàn)正交表中無(wú)空白列，故直接以第2類(lèi)離差作為誤差估計(jì)值（即：SE=SE2=5.13）來(lái)檢驗(yàn)各因素的顯著性。

由方差分析可知,因素C為有極顯著意義的因素,因素A為顯著意義的因素,因素B和D為無(wú)顯著意義的因素,故橘紅糖顆粒的最佳提取工藝為A1B3C2D1，即加水量為10倍，提取次數(shù)為2次,煎煮時(shí)間為1 h,浸泡時(shí)間為60 min。

四、工藝驗(yàn)證

提取工藝篩選取完成后，按上述條件與方法，對(duì)最佳提取工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)定柚皮苷含量（每袋）分別為 96.9 mg、95.9 mg、96.2 mg，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,采用該工藝指標(biāo)成分柚皮苷含量高，從而證明該提取工藝設(shè)計(jì)合理。

五、討論

（一）流動(dòng)相的選擇

橘紅痰咳顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中柚皮苷的含量測(cè)定流動(dòng)相為：甲醇-水-冰醋酸（40∶59∶1），柚皮苷分離不好（拖尾）；[10]有人用乙腈-磷酸鹽緩沖液（PH3.1）（20∶85)做流動(dòng)相來(lái)測(cè)定橘紅痰咳顆粒中柚皮苷的含量，[2]柚皮苷分離也不好;文獻(xiàn)用甲醇-醋酸-水（35∶4∶61）對(duì)照品的保留時(shí)間較理想，[1]但峰形較差。用甲醇-0.025 mol/L磷酸溶液（取1.7 ml 85%的磷酸，用水稀釋至1 000 ml，三乙胺1.8 ml調(diào)節(jié)pH至3.0±0.1）（40∶60）為流動(dòng)相克服了拖尾現(xiàn)象，空白溶液在此無(wú)干擾，樣品溶液中主峰能與其他色譜峰能很好地分離。故選此甲醇-0.025 mol/L磷酸溶液為流動(dòng)相。

（二）含量測(cè)定的提取方法考察

加熱回流提取的樣品溶液較超聲提取的溶液顏色深，兩種提取方法的峰面積相當(dāng)，考慮到雜質(zhì)及操作方便等因素，選用超聲提取方法為含量測(cè)定提取方法。

（三）超聲時(shí)間考察

方法按超聲提取法，只改變超聲時(shí)間，20 min、30 min、40 min，考察含量測(cè)定結(jié)果分別為18.1 mg/g、19.9 mg/g、19.6 mg/g。結(jié)果顯示：超聲20 min含量低，超聲30 min與40 min的含量相當(dāng)，故超聲時(shí)間定為30 min。

（四）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從9次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,第3號(hào)試驗(yàn)所測(cè)柚皮苷含量最高,最佳的工藝條件為A1B3C3D3，即加水量為10倍，煎煮時(shí)間為1 h，提取次數(shù)為3次，浸泡時(shí)間為40 min。

從R行(極差)可知,因素對(duì)結(jié)果的影響幅度,數(shù)值越大對(duì)結(jié)果影響越大,數(shù)值越小對(duì)結(jié)果影響越小,因素的影響順序?yàn)镃＞A＞B＞D，說(shuō)明因素C對(duì)結(jié)果的影響最大，因素A次之，因素B和因素D對(duì)結(jié)果影響較少。

從 K 值可知,因素 C中 K1=10.73，K2=17.18，K3=18.44，K1數(shù)值較小,K2和K3數(shù)值較接近,為方便生產(chǎn)，節(jié)約成本,選擇提取兩次即可。因素A中K1=47.98，K2=15.34，K3=13.03，即 K1＞K2＞K3。由于化橘紅先進(jìn)行了蒸餾操作，提取揮發(fā)油后的水溶液與藥渣再進(jìn)行水煎煮，此時(shí)的加水量對(duì)結(jié)果的影響相對(duì)少。為方便生產(chǎn)，節(jié)約成本，選擇第一次加水10倍量,第二次加水8倍量。因素B和D中，K值較小對(duì)結(jié)果影響較小，且先進(jìn)行了蒸餾操作，對(duì)結(jié)果的影響微不足道，故選擇煎煮時(shí)間為B3（1 h），浸泡時(shí)間D1（60 min）。

綜上所述，橘紅痰咳顆粒最佳工藝為A1B3C2D1，即加水量為10倍，提取次數(shù)為2次，煎煮時(shí)間為1 h，浸泡時(shí)間為60 min。

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