一種檢測(cè)近緣物種混合樣品的新方法*

賈秀雙，王 靜，梁興國(guó)

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

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一種檢測(cè)近緣物種混合樣品的新方法*

賈秀雙，王 靜，梁興國(guó)**

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

結(jié)合雙重PCR(Duplex PCR，dPCR)和擴(kuò)增產(chǎn)物熔點(diǎn)的測(cè)定，建立了一種定量分析近緣物種混合樣品中各物種相對(duì)含量的新方法。即針對(duì)混合樣品中2種物種的DNA序列，各自設(shè)計(jì)高特異性引物，使2種物種的DNA同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增而互不干擾，且擴(kuò)增產(chǎn)物的熔點(diǎn)有足夠的差別(> 1℃)；然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)得不同溫度下PCR產(chǎn)物同熒光染料結(jié)合后的熒光值；該熒光值對(duì)溫度進(jìn)行微分所得微分曲線上會(huì)產(chǎn)生2個(gè)峰(在兩物種各自PCR產(chǎn)物熔點(diǎn)溫度處)，根據(jù)這2個(gè)峰的峰高比值同其相對(duì)含量的關(guān)系，即可完成對(duì)各物種含量的定量分析。本研究以長(zhǎng)鰭和黃鰭金槍魚的混合樣品為例，對(duì)此方法的可行性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，2種成分的含量比與對(duì)應(yīng)峰值比之間線性關(guān)系良好；當(dāng)混合樣品中含有10%以上長(zhǎng)鰭金槍魚或5%以上黃鰭金槍魚時(shí)，能夠進(jìn)行較準(zhǔn)確的定量檢測(cè)，證明了本方法切實(shí)可行。這一新方法解決了在混合樣品中難以準(zhǔn)確定量物種的難題，在食品安全和基因診斷領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。

雙重特異性PCR；熔點(diǎn)；混合樣品；定量分析；物種鑒定

不同物種在商品價(jià)值、品質(zhì)、潛在過(guò)敏原種類和受保護(hù)程度等方面存在較大的差異，因此亟需建立一種簡(jiǎn)單、快速、可靠、重復(fù)性高的檢測(cè)方法來(lái)保障消費(fèi)者的權(quán)益，規(guī)范食品市場(chǎng)和保護(hù)瀕危物種。然而混合樣品，尤其是近緣混合樣品的存在，使很多分子檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用受到了很多限制。如FINS中使用的通用引物可能會(huì)同時(shí)擴(kuò)增混合樣品中的多種成分，造成測(cè)序結(jié)果混亂[1]；限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)和單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)雖然可定性檢測(cè)不同屬、科，甚至不同目的混合物種，但在區(qū)分近緣物種的應(yīng)用方面，其結(jié)果更易受種內(nèi)變異的影響[2-4]，且序列間的高度相似性限制了它們的應(yīng)用[5]；多重PCR能夠?qū)h(yuǎn)緣物種混合樣品中的組分進(jìn)行定性分析，但反應(yīng)體系優(yōu)化和電泳分析產(chǎn)物耗時(shí)長(zhǎng)，不適于高通量快速篩選[6]。由于近緣物種模板DNA的序列高度相似，采用多重PCR區(qū)分近緣物種時(shí)，引物設(shè)計(jì)困難，很難避免假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)[7-8]。采用特異性探針和熒光定量PCR，雖能區(qū)分近緣物種及其混合樣品，但檢測(cè)成本較高，且不能對(duì)混合樣品中的物種進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析[9]?？梢?jiàn)，目前對(duì)于混合樣品，尤其是近緣物種混合樣品的定量分析，仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

利用熒光定量PCR儀測(cè)定的PCR產(chǎn)物熔解曲線(特定染料同dsDNA作用發(fā)出熒光)，可對(duì)病原菌進(jìn)行定性檢測(cè)[10-12]，也可用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測(cè)[13]。有報(bào)道認(rèn)為此法與探針?lè)z測(cè)的準(zhǔn)確度相當(dāng)[14]，且不易產(chǎn)生假陽(yáng)性[15]。但對(duì)于近緣物種混合樣品的定量檢測(cè)還未見(jiàn)報(bào)道?？紤]到PCR產(chǎn)物熔點(diǎn)一般只同其GC含量有關(guān)，而某一PCR產(chǎn)物的含量同其熔解曲線一次微分后的峰值呈正相關(guān)，作者設(shè)想，可根據(jù)雙重PCR的2個(gè)產(chǎn)物的相應(yīng)峰高的比值隨物種含量的變化情況來(lái)定量分析近緣物種的混合樣品。本文以近緣物種長(zhǎng)鰭和黃鰭金槍魚的混合樣品為例，建立了雙重PCR與熔點(diǎn)分析相結(jié)合(Combination of duplex PCR andTmanalysis，dPCR-Tm)的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)混合樣品的定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)樣品 經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定的長(zhǎng)鰭金槍魚(Albacore,n=11)、黃鰭金槍魚(Yellowfin tuna,n=20)和大目金槍魚(Bigeye tuna,n=3)，捕撈于美屬薩摩亞島，由中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院高天翔教授提供。

混合樣品 購(gòu)于青島某超市的長(zhǎng)鰭金槍魚和黃鰭金槍魚魚肉(FINS法鑒定)按不同比例混合制備混合樣品。

引物由英濰捷基公司合成；SYBR@Select Master Mix(2 ×) 購(gòu)于Invitrogen公司；苯酚、氯仿和乙醇等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；瓊脂糖G10(Biowest)；Genegreen DNA染料購(gòu)于北京天根公司；熒光定量PCR儀(Illumina公司)，伯樂(lè)凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 樣品DNA提取

標(biāo)準(zhǔn)樣品和人工混合樣品均采用改良的苯酚氯仿法[16]提取樣品DNA。

1.3 引物設(shè)計(jì)

我們應(yīng)該遵照我們本性的意愿而生活，即應(yīng)該追求過(guò)一種優(yōu)美而高尚的生活，要能做到這一點(diǎn)，就是要促使自己的內(nèi)在靈魂合乎自然地生長(zhǎng)起來(lái)。但是，人是不能靠自己孤獨(dú)的生活而促使內(nèi)在靈魂的生長(zhǎng)的，“在本性上而非偶然地脫離城邦的人，他要么是一位超人，要么是一個(gè)惡人?！@種人就仿佛棋盤中的孤子?！盵2](P6)只有在政治共同體的活動(dòng)中，人們才具有了過(guò)好生活的最終可能性。

選取GenBank上登錄的金槍魚屬(Thunnus)、鰹魚屬(Katsuwonus)和舵鰹屬(Scombridae)的15個(gè)線粒體全基因序列(登錄號(hào)： GU256526.1，AB101291.1，GU256528.1，NC014059.1，GU256523.1，GU256524.1，NC008455.1，AY302574.2，HQ425780.1，JN086154.1，AB101290.1，AB103467.1，AB105165.1，AB103468.1，NC005318.1)，運(yùn)用NCBI Blast進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析，在進(jìn)化速率適中的基因中選取種間差異性較大的部分，針對(duì)長(zhǎng)鰭(A)和黃鰭金槍魚(Y)設(shè)計(jì)特異性引物，并運(yùn)用Primer Premier 6.0軟件對(duì)引物性能進(jìn)行評(píng)估。

1.4 熒光定量PCR反應(yīng)和產(chǎn)物熔解曲線測(cè)定

熒光定量PCR的反應(yīng)體系(10μL)為：5μL通用PCR反應(yīng)預(yù)混液(SYBR@Select Master Mix(2 ×) Invitrogen產(chǎn)品)；引物(10 μmol/L)各0.2μL；模板 1μL(約4ng)。 反應(yīng)條件：50℃UDG處理 2min；95℃ 預(yù)變性 2min；98℃ 變性 15s， 一定溫度下(55、58或62℃) 退火 30s，72℃ 延伸 30s, 78℃ 10s 讀取熒光，30～35個(gè)循環(huán)。熔解曲線測(cè)定條件：98℃ 15s變性后緩慢降溫至65℃(降溫速率0.2℃/s)，保持30s，然后緩慢升溫至95℃(升溫速率0.2℃/s)，并在升溫過(guò)程中測(cè)量不同溫度下的熒光值。測(cè)量后用儀器自帶軟件進(jìn)行一次微分，并進(jìn)行相關(guān)分析。

1.5 電泳分析

取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物采用2.0%瓊脂糖凝膠(含DNA染料Genegreen)進(jìn)行電泳1h后，置于伯樂(lè)凝膠成像儀(Gel Doc XR+)上成像。

2 結(jié)果與分析

本文選取了價(jià)格差異顯著的長(zhǎng)鰭金槍魚和黃鰭金槍魚(金槍魚罐頭常用原料，前者價(jià)格顯著高于后者)作為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物進(jìn)行混合樣本的雙重特異性PCR，根據(jù)物種特異性擴(kuò)增片段的Tm值及熔解曲線的差異對(duì)樣品中各組分進(jìn)行定量分析。為評(píng)價(jià)所設(shè)計(jì)的引物的特異性，分別選取了經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定的11個(gè)長(zhǎng)鰭金槍魚(Albacore)個(gè)體和20個(gè)黃鰭金槍魚(Yellowfin tuna)個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)，同時(shí)還使用了同屬的3個(gè)大目金槍魚(Bigeye tuna)個(gè)體作為對(duì)照。

2.1 引物設(shè)計(jì)

表1 熒光定量PCR所用引物Table 1 Primers for real-time PCR assays

注：a表示引物序列中加粗字體表示引物和黃鰭金槍魚之間的錯(cuò)配堿基；下劃線標(biāo)注的字體為引物和大目金槍魚間的錯(cuò)配堿基；斜體表示引物和長(zhǎng)鰭金槍魚之間的錯(cuò)配。b表示引物與長(zhǎng)鰭金槍魚(GU256526.1, AB101291.1)、黃鰭金槍魚(GU256528.1)和大目金槍魚(NC014059.1)的結(jié)合位點(diǎn)。

a： Bold letters indicate mismatches between primer and yellowfin DNA; Underlined letters indicate mismatches between primer and Bigeye DNA; Italic letters indicate mismatches between primer and Albacore DNA.b： Locations are in reference to Albacore (GU256526.1, AB101291.1); Yellowfin tuna (GU256528.1); Bigeye tuna (NC014059.1).

2.2 引物特異性評(píng)價(jià)及擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值確定

選取來(lái)自長(zhǎng)鰭金槍魚、黃鰭金槍魚和大目金槍魚3種模板，在相同的反應(yīng)條件下對(duì)3組引物A246-F/A246-R(A)、Y303/338-F/Y338-R (Y1)和Y303/338-F/Y303R (Y2)的特異性進(jìn)行評(píng)估。如果條件適當(dāng)，引物組A只對(duì)長(zhǎng)鰭金槍魚擴(kuò)增陽(yáng)性，引物組Y1和Y2只對(duì)黃鰭金槍魚擴(kuò)增陽(yáng)性。選取55、58和62℃ 3個(gè)退火溫度分別進(jìn)行PCR反應(yīng)(35個(gè)循環(huán))。PCR的結(jié)果表明55℃退火時(shí)，大目金槍魚在30個(gè)循環(huán)時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)大量的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未給出)；退火溫度為62℃時(shí)，擴(kuò)增應(yīng)為陽(yáng)性的少數(shù)個(gè)體擴(kuò)增失敗(數(shù)據(jù)未給出)。退火溫度為58℃時(shí)，3對(duì)引物(A、Y1、Y2)都獲得了理想的區(qū)分結(jié)果，從而選取58℃為合適的PCR退火條件。

表2 單重?zé)晒舛縋CR的Ct值和Tm值統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 The statistics of Ct and Tm values of three groups of simplex-PCR annealing at 58℃

表2列出了退火溫度為58℃時(shí)，3組引物的單重?zé)晒舛縋CR的Ct值和Tm值(見(jiàn)表2)。結(jié)果顯示：引物組A檢測(cè)3種單一模板，循環(huán)數(shù)大于28.59時(shí)，能將11個(gè)陽(yáng)性樣本(長(zhǎng)鰭金槍魚)全部檢出；循環(huán)數(shù)小于31.54時(shí)，23個(gè)陰性樣本DNA不會(huì)被擴(kuò)增。同樣，引物組Y1和Y2的PCR循環(huán)數(shù)在28.73～31.32和29.57～33.09時(shí)均不會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性個(gè)體和陰性個(gè)體誤檢的情況。對(duì)于不同的個(gè)體，Ct值變化較大，可能是由于模板含量波動(dòng)造成，這里采用同種魚不同個(gè)體Ct值的平均值作為設(shè)定循環(huán)數(shù)的參考，即將雙重PCR的循環(huán)數(shù)設(shè)為30，達(dá)到區(qū)分幾種魚的目的。

綜合以上分析，最終確定雙重PCR的反應(yīng)條件為：50℃ UDG處理2min；95℃ 2min；98℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 30s, 78℃ 10s讀取熒光，30個(gè)循環(huán)。

為達(dá)到對(duì)混合樣品定量檢測(cè)的目的，一般要求Tm值相差1℃以上，同時(shí)Tm值測(cè)量誤差越小越好。因此，對(duì)擴(kuò)增片段的Tm值及其波動(dòng)范圍的確定是十分必要的。本文對(duì)3種金槍魚的多個(gè)個(gè)體進(jìn)行單重PCR并測(cè)定了產(chǎn)物的Tm值(見(jiàn)表2)。測(cè)定結(jié)果顯示來(lái)自長(zhǎng)鰭金槍魚的246 bp片段(A)Tm值為81.4～81.5℃；黃鰭金槍魚的338 bp片段(Y1)和303 bp(Y2)的Tm值分別為83.2～83.5℃和82.8～83.1℃。3種片段各自的Tm值的測(cè)量誤差在0.3℃以內(nèi)。A(246 bp)和Y1(338 bp)2種片段Tm值相差(1.9±0.1)℃，A (246 bp)和Y2 (303 bp)2種片段Tm值相差(1.5±0.1)℃；理論上，熔解曲線峰(即A-Y1組合或A-Y2組合)均能夠分開。因此，使用2組引物(A-Y1或A-Y2)雙重PCR體系的擴(kuò)增產(chǎn)物能夠通過(guò)熔點(diǎn)測(cè)定進(jìn)行區(qū)分。

從Y1和Y2的單重PCR結(jié)果(表2中Ct值)看，2對(duì)引物的特異性都很好，都不會(huì)擴(kuò)增非目標(biāo)魚種(長(zhǎng)鰭和大目金槍魚)。Y1擴(kuò)增產(chǎn)物與A擴(kuò)增片段的Tm差異大于Y2擴(kuò)增產(chǎn)物與A擴(kuò)增片段之間的差異，由此判斷由A-Y1引物組合建立的dPCR-Tm體系應(yīng)優(yōu)于用A-Y2建立的dPCR-Tm體系。

2.3 dPCR-Tm檢測(cè)混合樣品

為研究dPCR-Tm是否具有對(duì)長(zhǎng)鰭和黃鰭金槍魚的混合物組分進(jìn)行定量分析的能力，制備了由兩種金槍魚(質(zhì)量比不同)組成的混合樣品。各混合樣本中長(zhǎng)鰭和黃鰭金槍魚的質(zhì)量比依次為： 19/1、7/1、4/1、3/1、2/1、3/2、1/1、2/3、1/2、1/3、1/4、1/5.5、1/9、其中長(zhǎng)鰭金槍魚的含量為： 95%，87.5%， 80%，75%，66.7%，60%，50%， 40%， 33.3%， 25%，20%，15.4%和10%。

首先選取上述擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值相差較大和引物特異性好的A-Y1 (A246-F、A246-R、Y303/338-F、Y338-R) 引物組合建立的雙重PCR體系進(jìn)行混合樣本的檢測(cè)。結(jié)果顯示(見(jiàn)圖1)，當(dāng)長(zhǎng)鰭金槍魚含量高于25%時(shí)，能夠檢測(cè)到2個(gè)熔解曲線峰，分別為A峰(81.4～81.5℃，左)和Y1峰(83.2～83.5℃，右)(見(jiàn)圖1a)。但不幸的是不論2種金槍魚比重孰多孰少，Y峰峰值都高于A峰峰值，即A-Y1建立的dPCR-Tm體系并不適合對(duì)混合樣品進(jìn)行量化分析。

(a圖使用A-Y1引物，b圖使用A-Y2引物。縱坐標(biāo)為熒光值對(duì)溫度的一次微分值。a: Using A-Y1 combination as primers. b： Using A-Y2 combination as primers. The vertical coordinate is the value of first order differentiation.)

圖1 混合樣品的PCR產(chǎn)物熔解曲線分析
Fig.1 Anlysis of melting curves of PCR products from mixtures

為找出雙重PCR結(jié)果異常的原因，作者用A-Y1引物組擴(kuò)增單一模板(長(zhǎng)鰭金槍魚或黃鰭金槍魚)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)只存在長(zhǎng)鰭金槍魚模板(120或12 pmol/L)時(shí)，仍然檢測(cè)到2條DNA條帶，分別為246 和338 bp(見(jiàn)圖2)；當(dāng)只存在黃鰭金槍魚模板(120或12 pmol/L)時(shí)，只檢測(cè)到一條338 bp的條帶。分析原因，發(fā)現(xiàn)這是由于該體系中有一條引物(Y338-R)與2種DNA(長(zhǎng)鰭和黃鰭)均完全匹配，導(dǎo)致引物Y338-R和A246-F同長(zhǎng)鰭金槍魚模板完全互補(bǔ)而得到了338 bp的產(chǎn)物(見(jiàn)表1)。這表明建立雙重PCR方法，設(shè)計(jì)引物應(yīng)保證雙重PCR體系中的每條引物對(duì)非目的模板都有一定的區(qū)分能力，各對(duì)引物的擴(kuò)增互不干擾。

(L:100 bp DNA Ladder)圖2 2對(duì)引物對(duì)單一模板的擴(kuò)增結(jié)果

本文進(jìn)一步對(duì)A-Y2(A246-F、A246-R、Y303/338-F、Y303-R)引物組合建立的雙重PCR體系進(jìn)行了評(píng)估(圖2右側(cè))。結(jié)果顯示：A-Y2引物組合擴(kuò)增單一模板時(shí)，分別只有一種擴(kuò)增產(chǎn)物，即246 bp(長(zhǎng)鰭金槍魚)或303 bp(黃鰭金槍魚)。這表明引物互不干擾，可以使用A-Y2組合，研究dPCR-Tm方法對(duì)混合樣品定量檢測(cè)的可行性。

選用A-Y2組合建立的dPCR-Tm體系檢測(cè)混合樣品的結(jié)果如圖1b所示(另參見(jiàn)附圖1)。當(dāng)含有5%及以上長(zhǎng)鰭金槍魚時(shí)，該體系能夠檢測(cè)到A峰(對(duì)應(yīng)溫度81.5℃)即長(zhǎng)鰭金槍魚的存在；當(dāng)含有10%及以上黃鰭金槍魚時(shí)，該體系也能夠檢測(cè)到Y(jié)峰(對(duì)應(yīng)溫度82.8～83.1℃)。將Y峰和A峰的峰值比對(duì)2種魚魚肉的含量比作圖發(fā)現(xiàn)，峰高比值與混合物中黃鰭金槍魚(Y)和長(zhǎng)鰭金槍魚(A)含量比呈線性關(guān)系(見(jiàn)圖3)。當(dāng)黃鰭金槍魚含量多于長(zhǎng)鰭金槍魚時(shí)，峰值比和含量比的線性擬合相關(guān)系數(shù)：R2=0.96，線性關(guān)系良好(見(jiàn)圖3a)。當(dāng)長(zhǎng)鰭金槍魚含量多于黃鰭金槍魚時(shí)，峰值比和含量比的線性擬合相關(guān)系數(shù)：R2=0.99，線性關(guān)系良好(見(jiàn)圖3b)。由此說(shuō)明A-Y2引物組合建立的dPCR-Tm體系可以定量分析各組分的含量。

為了進(jìn)一步評(píng)估A-Y2引物組合建立的dPCR-Tm體系定量分析2種金槍魚混合物的準(zhǔn)確性，本研究制備了8個(gè)混合樣品并使用A-Y2體系進(jìn)行了檢測(cè)分析。將分析得到的熔解曲線峰值比代入圖3a 或圖3b所示的關(guān)系式中，計(jì)算混合物中長(zhǎng)鰭金槍魚或黃鰭金槍魚的含量。dPCR-Tm測(cè)定的金槍魚含量與實(shí)際含量比較結(jié)果(見(jiàn)表3)表明：該dPCR-Tm體系定量分析混合樣品含量的誤差在5% 以下。

綜上，長(zhǎng)鰭金槍魚的含量在10%～95%的范圍內(nèi)，都可以進(jìn)行定量檢測(cè)，誤差一般可控制在5%以下。而一般定量PCR的方法分析混合樣品時(shí)，需要分別進(jìn)行擴(kuò)增和定量分析，誤差較大而且難以控制。可以認(rèn)為，本文所建立的dPCR-Tm方法具有很強(qiáng)的對(duì)近緣物種混合物進(jìn)行量化分析的能力。

(a 圖為長(zhǎng)鰭金槍魚含量少于50%，b圖為長(zhǎng)鰭金槍魚含量多于50%。a: The content of Albacore was less than 50 percent. b: The content of Albacore was more than 50 percent.)

圖3 長(zhǎng)鰭和黃鰭金槍魚含量比隨對(duì)應(yīng)熔解曲線峰值比的變化

Fig.3 The ratio of content between Albacore and Yellowfin tuna along with the ratio of corresponding peak value

表3 A-Y2引物組合建立的dPCR-Tm體系檢測(cè)混合樣品中長(zhǎng)鰭金槍魚含量的誤差分析結(jié)果Table 3 Error analysis results of detection of Albacore content in mixture using A-Y2 dPCR-Tm assays

Note:①Ratio of peak value Y/A=0.99×Content ratio Y/A；②Ratio of peak value A/Y=1.12×Content ratio A/Y；③Ratio of peak value；④Measured content；⑤Actual content；⑥Relative error

3 討論

本研究將雙重PCR和熔解曲線測(cè)定法結(jié)合，利用引物的高特異性和擴(kuò)增片段熔點(diǎn)的差異以及各產(chǎn)物量的比值對(duì)熔解曲線的影響，建立了能夠?qū)壩锓N混合物組分進(jìn)行定量分析的方法。以長(zhǎng)鰭金槍魚和黃鰭金槍魚的混合樣品的檢測(cè)為例，此方法能夠檢測(cè)到5%的長(zhǎng)鰭金槍魚和10%的黃鰭金槍魚，并能進(jìn)行較準(zhǔn)確地定量分析。在一定的緩沖溶液中，較短DNA的Tm值受GC含量、雙鏈長(zhǎng)度和DNA 濃度的影響[17]。而對(duì)于長(zhǎng)鏈DNA，因其變性過(guò)程中往往產(chǎn)生局部熔解，GC含量低的部分先解鏈，一般認(rèn)為熔解單元的長(zhǎng)度為40～100 bp[18]。長(zhǎng)度大于100 bp時(shí)DNA的Tm值一般只受GC含量和溶液條件的影響。另外，種內(nèi)變異帶來(lái)的幾個(gè)堿基的變化對(duì)Tm值的影響也很小(同一物種的不同個(gè)體之間的PCR產(chǎn)物的Tm測(cè)定誤差在0.3℃以內(nèi))。因此本文建立的方法只需判斷特異性引物處的種內(nèi)保守程度，不必考慮片段內(nèi)序列的變異。這也是本方法優(yōu)于PCR-RFLF、PCR-SSCP和探針?lè)ㄖ嶽6-8]。

與分別進(jìn)行單重定量PCR，通過(guò)比較Ct值的定量方法相比，本方法同時(shí)擴(kuò)增2種模板，直接根據(jù)熔解曲線一次微分的峰值比得到各種組分的含量，大大減少了操作不當(dāng)帶來(lái)的誤差。另外，常規(guī)定量PCR方法需要分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行絕對(duì)定量，對(duì)模板質(zhì)量要求很高。而本方法只要將2種原料樣品(不是提取后的DNA)按不同比例混合，然后提取DNA進(jìn)行PCR，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可準(zhǔn)確測(cè)定未知含量的混合樣品。雖然已有研究人員利用多重PCR和熔點(diǎn)測(cè)定法對(duì)病原菌檢測(cè)[10-12]，但這些研究只是針對(duì)不同科甚至不同目的病原菌(非近緣物種)的混合樣品進(jìn)行的定性檢測(cè)。

建立此方法需要設(shè)計(jì)高特異性的引物，要求能夠?qū)⒛繕?biāo)物種與其他物種分開，即陽(yáng)性擴(kuò)增和陰性擴(kuò)增物種的Ct值(單重PCR)差異足夠大。如本文設(shè)計(jì)的3組引物(A、Y1和Y2)擴(kuò)增不同物種的Ct值相差9左右，區(qū)分相似模板的能力很強(qiáng)；但需要注意的是，不能簡(jiǎn)單通過(guò)單重PCR評(píng)估引物的特異性，還要考察雙重PCR的引物體系對(duì)單一模板的擴(kuò)增情況，必須保證2個(gè)擴(kuò)增互不影響，這是此方法對(duì)混合樣品準(zhǔn)確定量的前提。如：本文中使用的A-Y1組合，雖然A引物組和Y1引物組能很好地區(qū)分2種模板，但A引物組和Y1引物組共同存在時(shí)，使用長(zhǎng)鰭金槍魚模板能擴(kuò)增2種片段(見(jiàn)圖2)，不適合做雙重PCR。只有正反向引物都有足夠區(qū)分模板能力時(shí)才能保證雙重PCR順利進(jìn)行。A-Y2組合的Y303-R引物在3(末端引進(jìn)一個(gè)針對(duì)長(zhǎng)鰭金槍魚模板的A/T錯(cuò)配(同黃鰭金槍魚模板完全互補(bǔ))，只能擴(kuò)增黃鰭金槍魚模板，實(shí)現(xiàn)了雙重PCR擴(kuò)增。

本文針對(duì)長(zhǎng)鰭金槍魚和黃鰭金槍魚混合樣品建立的dPCR-Tm體系能夠檢測(cè)出10%的金槍魚，此檢測(cè)限低于FDA中對(duì)于混合金槍魚罐頭中對(duì)長(zhǎng)鰭金槍魚的含量要求(20%)。不同金槍魚罐頭(混合比不同)，價(jià)格差異顯著。FDA中規(guī)定標(biāo)簽為白金槍魚的產(chǎn)品中只能含有長(zhǎng)鰭金槍魚，而本文建立的方法至少可以檢測(cè)到5%的黃鰭金槍魚，可以用于白金槍魚產(chǎn)品的質(zhì)量檢測(cè)。

總之，本文建立的dPCR-Tm方法能夠快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地對(duì)混合樣品中的物種組成進(jìn)行定量分析，解決了混合樣品中各物種難以準(zhǔn)確定量的難題?？梢酝茢啵痉椒ㄔ谑称钒踩?，含多種耐藥基因的菌株篩選，以及基因診斷等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。

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責(zé)任編輯 朱寶象

A Novel Method of Identifying Close-Related Species in Mixed Species

JIA Xiu-Shuang, WANG Jing, LIANG Xing-Guo

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

A novel quantitative analysis method for measuring the content of two close-related species in their mixture were developed based on the combination of duplex PCR (dPCR) and melting temperature (Tm) measurement of PCR products. At first, primers were designed to carry out dPCR to amplify simultaneously one DNA fragment from one species and another fragment from the other species. The two PCR products were designed to have enough difference inTm(>1℃). Then dPCR was carried out, and theTms of PCR products were measured by recoding the fluorescence change with temperature, which is caused by different intensity of fluorescence between dsDNA and ssDNA in the presence of a dsDNA-binding dye. There should be two peaks on the plot of first differential of fluorescence value to temperature atTms of each PCR product, and the quantitative analysis of relative content can be carried out according to the ratio between the heights of two peaks. Here, mixtures of albacore and yellowfin tuna were taken as an example to assess the feasibility and efficiency of this method. The results showed that there is a good linearity between the content ratio and peak height ratio. The method can accurately quantify the content of each species, e.g. more than 10% of albacore or more than 5% of yellowfin tuna, indicating that this approach is practical. This novel method can solve the problem of quantitative analysis of mixed species and have a wide range of applications in food safety, genetic diagnosis and so on.

duplex PCR; melting temperature; mixed species; quantitative analysis; species identification

山東省自然科學(xué)杰出青年基金項(xiàng)目(JQ201204)；長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(IRT1188)資助

2014-03-11;

2014-05-08

賈秀雙(1988-)，女，碩士生，研究方向：海洋資源微生物及生物工程。E-mail: xiushuangjia@163.com

** 通訊作者： E-mail: liangxg@ouc.edu.cn

TS201.6

A

1672-5174(2015)04-046-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20140083