組織因子途徑抑制物-2抑制人前列腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

劉樹瀚，宣 強(qiáng)，談宜傲，吳本鶴，孫凌峰，喬龍標(biāo)，翟路路，孫友文，周林玉

組織因子途徑抑制物-2抑制人前列腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

劉樹瀚1，宣 強(qiáng)1，談宜傲1，吳本鶴1，孫凌峰1，喬龍標(biāo)1，翟路路2，孫友文1，周林玉1

目的探討組織因子途徑抑制物-2（TFPI-2）對人前列腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。方法將人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3M進(jìn)行培養(yǎng)，并分為3組，分別轉(zhuǎn)染TFPI-2基因真核表達(dá)載體、空載體及不轉(zhuǎn)染，細(xì)胞劃痕實驗和細(xì)胞侵襲小室實驗檢測3組細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力，用轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）處理細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察3組細(xì)胞形態(tài)，Western blot法和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法分別檢測轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空載體組及未轉(zhuǎn)染組上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物-E鈣黏素（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和snail在蛋白和mRNA水平上的表達(dá)量。結(jié)果細(xì)胞劃痕實驗和細(xì)胞侵襲小室實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染TFPI-2基因真核表達(dá)載體的PC3M細(xì)胞遷移率較低（P＜0.05），侵襲細(xì)胞數(shù)較少（P＜0.05）；顯微鏡下觀察顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞大多呈上皮型，轉(zhuǎn)染空載體組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞大多呈間葉型；Western blot法和RT-PCR法檢測結(jié)果顯示，無論在蛋白水平還是mRNA水平，轉(zhuǎn)染組較轉(zhuǎn)染空載體組及未轉(zhuǎn)染組E-cadherin表達(dá)產(chǎn)物較多，vimentin和snail蛋白表達(dá)產(chǎn)物較少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），轉(zhuǎn)染空載體組及未轉(zhuǎn)染組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論TFPI-2可以抑制人前列腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，這是其抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制之一，為基因及生物靶向治療前列腺癌提供新的思路和方向。

組織因子途徑抑制物-2；前列腺癌；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

前列腺癌是世界范圍內(nèi)第二常見的男性惡性腫瘤［1］，在美國其發(fā)病率已經(jīng)躍居第一位［2］。近年來，前列腺癌在我國的發(fā)病率也迅速增長，日益威脅老年男性健康。腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)是前列腺癌患者死亡的重要原因，因此，探索其發(fā)生的潛在機(jī)制并積極尋找有效的治療方法已成為人類醫(yī)學(xué)研究的熱點。近年來研究［3］顯示，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchyml transition，EMT）是促進(jìn)包括前列腺癌在內(nèi)的惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素之一。組織因子途徑抑制物-2（tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2）在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及腫瘤血管生成等一系列生理和病理過程中扮演著重要角色，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為TFPI-2作為一種廣譜蛋白酶抑制劑，是通過抑制纖溶酶、胰蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等多種蛋白酶降解細(xì)胞外間質(zhì)來發(fā)揮作用的，但其是否通過抑制EMT從而抑制前列腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，目前國內(nèi)外并無研究。該研究首次將TFPI-2與前列腺癌細(xì)胞EMT聯(lián)系起來，在形態(tài)學(xué)上及分子水平上觀察TFPI-2對前列腺癌細(xì)胞EMT是否有影響，為明確腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制以及尋找新的治療策略提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 載體與細(xì)胞株 TFPI-2基因真核表達(dá)載體、人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3M購自中科院載體實驗室及細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑與儀器 IMDM、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）（美國Peprotech公司）；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 2000（美國Sigma公司）；PVDF膜、ECL發(fā)光液和Western blot檢測試劑盒（美國Millpore公司）；兔抗人TFPI-2多克隆抗體、兔抗人E-鈣黏素（E-cadherin）單克隆抗體、兔抗人波形蛋白（vimentin）單克隆抗體、兔抗人snail蛋白單克隆抗體、兔抗人β-actin單克隆抗體（美國Cell signaling Technology公司）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（德國Fermentas公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Thermo公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；24孔transwell板（美國Corning公司）；SDS-PAGE電泳儀、PCR儀（美國Rio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) PC3M以DMEM作為培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。選取生長穩(wěn)定的3～8代細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 轉(zhuǎn)染 PC3M細(xì)胞分為3組，以1×106／孔的細(xì)胞密度分別接種在6孔板上，當(dāng)達(dá)到60%～80%融合時，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 2000說明書分別轉(zhuǎn)染TFPI-2基因真核表達(dá)載體（轉(zhuǎn)染組）、空載體（轉(zhuǎn)染空載體組）及不轉(zhuǎn)染（未轉(zhuǎn)染組），G418篩選穩(wěn)定表達(dá)株。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實驗 吸取對數(shù)生長期的3組PC3M細(xì)胞，分別接種于3個6孔板，細(xì)胞密度為2.5 ×105個／孔，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)。待細(xì)胞融合密度達(dá)到70%～80%時，用200 μl的移液器尖頭沿直尺垂直于孔底劃痕，PBS沖洗2～3遍，分別加入2 ml無血清IMDM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)。于劃痕后0 h及48 h進(jìn)行觀察并拍照。以遷移率作為統(tǒng)計學(xué)比較標(biāo)準(zhǔn)，遷移率（%）＝（遷移前兩側(cè)細(xì)胞層距離-遷移后兩側(cè)細(xì)胞層距離）／遷移前兩側(cè)細(xì)胞層距離×100%。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞侵襲小室實驗 取對數(shù)生長期的3組PC3M細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液后，分別接種至3個24孔transwell板，其中上室中注入200 μl細(xì)胞懸液，下室內(nèi)為500 μl含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2恒溫孵育48 h后，用棉簽拭去上室內(nèi)Matrigel膠和細(xì)胞，室底細(xì)胞以0.1%結(jié)晶紫染色5～10 min，顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野（200×）計細(xì)胞數(shù)總和，求其平均值。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞形態(tài)觀察 分別接種3組PC3M細(xì)胞于3個培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)液中加入TGF-β1（5 ng／ml）處理，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.6 Western blot法 經(jīng)PBS液清洗、蛋白裂解液裂解及離心后分別提取經(jīng)TGF-β1處理后的每組細(xì)胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，制備SDSPAGE凝膠、SDS-PAGE電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜緩沖液等相關(guān)緩沖液，各組提取25 μg蛋白質(zhì)樣品，在60 V的恒定電壓下進(jìn)行電泳，電泳分離后，恒壓轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉，分別用兔抗人TFPI-2多克隆抗體（1∶200）、兔抗人E-cadherin單克隆抗體（1∶200）、兔抗人vimentin單克隆抗體（1∶200）、兔抗人snail蛋白單克隆抗體（1∶100）、兔抗人β-actin單克隆抗體（1∶400）作為一抗，孵育、洗膜后，再用HRP標(biāo)記的IgG二抗室溫孵育1～2 h，洗膜后，用ECL發(fā)光液進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光，X線片下顯影。實驗獨立重復(fù)10次，以βactin作為內(nèi)參，利用Quantity One軟件對顯影條帶的灰度值進(jìn)行分析。

1.2.7 RT-PCR法 經(jīng)TRIzol裂解液裂解、離心、洗滌及溶解后分別提取經(jīng)TGF-β1處理后的每組細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA濃度，取1 μl RNA，按照Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒說明，合成cDNA，用Beacon designer v 7.51設(shè)計TFPI-2、E-cadherin、vimentin、snail蛋白和β-actin的引物，引物序列見表1，在PCR儀中通過變性、退火、延伸進(jìn)行PCR反應(yīng)（30個循環(huán)），產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外線光源照射顯示條帶。實驗獨立重復(fù)10次，以β-actin作為內(nèi)參，利用Quantity One軟件對顯影條帶的灰度值進(jìn)行分析。

表1 基因引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以表示，采用單因素方差分析進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 PC3M細(xì)胞轉(zhuǎn)染TFPI-2基因真核表達(dá)載體后遷移能力于48 h時觀察顯示，轉(zhuǎn)染組劃痕寬度較0 h時稍減小，轉(zhuǎn)染空載體組及未轉(zhuǎn)染組較0 h時明顯減小。比較3組48 h時劃痕寬度，轉(zhuǎn)染組劃痕寬度較轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組寬，而轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組劃痕寬度基本相等，3組細(xì)胞遷移率分別為（29.65±8.33）%、（55.45±10.07）%、（54.06±11.29）%，經(jīng)方差分析，3組遷移率不全相等（F＝34.957，P＝0.000），轉(zhuǎn)染組分別與轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明PC3M細(xì)胞轉(zhuǎn)染TFPI-2基因真核表達(dá)載體后遷移能力明顯降低。見圖1。

2.2 PC3M細(xì)胞轉(zhuǎn)染TFPI-2基因真核表達(dá)載體后侵襲能力鏡下觀察顯示轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組比較，侵襲細(xì)胞較少。3組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（90.3±24.3）、（227.1±40.5）、（232.7± 42.7），經(jīng)方差分析，3組侵襲細(xì)胞數(shù)不全相等（F＝74.309，P＝0.000），轉(zhuǎn)染組分別與轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但轉(zhuǎn)染空載體組和未轉(zhuǎn)染組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明PC3M細(xì)胞轉(zhuǎn)染TFPI-2后侵襲能力明顯受到抑制。見圖2。

2.3 各組細(xì)胞形態(tài)變化用倒置相差顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組PC3M細(xì)胞形態(tài)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞大多呈多角形“鋪路石樣”，細(xì)胞之間連接較緊密。轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞大多呈梭形“間葉細(xì)胞樣”，細(xì)胞之間無明顯連接，呈散在生長。見圖3。

2.4 各組細(xì)胞TFPI-2、E-cadherin、vimentin和snail的蛋白表達(dá)經(jīng)Western blot法檢測和統(tǒng)計學(xué)分析，轉(zhuǎn)染組有32、31、27 ku 3種分子量的TFPI-2蛋白表達(dá)，而轉(zhuǎn)染空載體組和未轉(zhuǎn)染組無TFPI-2蛋白表達(dá)；以未轉(zhuǎn)染組作為對照組，轉(zhuǎn)染組E-cadherin表達(dá)較多，為對照組的（1.819±0.105）倍，vimentin和snail蛋白表達(dá)較少，分別為對照組的（0.538± 0.034）、（0.458±0.019）倍，與轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組之間比較，各蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4。

2.5 各組細(xì)胞TFPI-2、E-cadherin、vimentin和snail的mRNA表達(dá)經(jīng)RT-PCR法檢測和統(tǒng)計學(xué)分析，轉(zhuǎn)染組有440 bp的TFPI-2 mRNA表達(dá)，而轉(zhuǎn)染空載體組和未轉(zhuǎn)染組無TFPI-2 mRNA表達(dá)；以未轉(zhuǎn)染組作為對照組，轉(zhuǎn)染組E-cadherin mRNA表達(dá)較多，為對照組的（2.104±0.068）倍，vimentin和snail蛋白的mRNA表達(dá)較少，分別為對照組的（0.515±0.034）、（0.437±0.017）倍，與轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組之間比較，各mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖5。

3 討論

TFPI-2又稱胎盤蛋白-5，人TFPI-2基因位于7q22，全長約7 000 bp，其表達(dá)產(chǎn)物是一種Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制物，在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤血管生成、纖溶、炎癥以及動脈粥樣硬化等一系列生理和病理過程中扮演著重要作用［4］。大量研究［5-6］表明，腫瘤組織中TFPI-2的表達(dá)水平與其惡性程度呈負(fù)相關(guān)性，即腫瘤的惡性程度越高，TFPI-2的表達(dá)水平越低。此外，先前的研究［7-8］也表明了TFPI-2可以抑制包括前列腺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)及體外侵襲能力。本研究中前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3M無論在mRNA還是蛋白水平上，TFPI-2都沒有明顯表達(dá)，通過轉(zhuǎn)染TFPI-2基因真核表達(dá)載體后，TFPI-2在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)明顯增加；而細(xì)胞劃痕實驗和細(xì)胞侵襲小室實驗證明轉(zhuǎn)染TFPI-2基因真核表達(dá)載體組的PC3M，遷移能力和侵襲能力都比對照組明顯下降。本研究結(jié)果結(jié)合先前的研究結(jié)果共同表明了TFPI-2可以抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，也是導(dǎo)致腫瘤患者惡化和復(fù)發(fā)的病理基礎(chǔ)；其過程涉及到多基因參與、多步驟完成、非隨機(jī)動態(tài)變化的多種復(fù)雜因素。EMT是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，致使細(xì)胞極性消失、運動能力增強(qiáng)，是惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素之一［3，9］。本研究將TFPI-2基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入PC3M，并經(jīng)EMT誘導(dǎo)劑TGF-β1處理，分別在形態(tài)學(xué)上及分子水平上觀察，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染空載體組和未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞形態(tài)呈典型的間皮細(xì)胞樣，散在生長，是細(xì)胞發(fā)生EMT的典型形態(tài)特征，而轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞則大多呈上皮細(xì)胞樣，細(xì)胞間連接緊密，說明EMT可能受到了抑制。分子水平上是以與EMT緊密相關(guān)的3種蛋白—E-cadherin、vimentin以及snail作為判斷指標(biāo)。其中E-cadherin是一類鈣離子依賴性跨膜糖蛋白，其胞外免疫球蛋白中的組-丙-纈三肽序列相互識別和形成鏈接，加上胞內(nèi)的α、β連接素與肌動蛋白骨架結(jié)合，從而形成穩(wěn)定的細(xì)胞間接觸，其在細(xì)胞間黏附連接中扮演著重要角色［10］。E-cadherin被認(rèn)為是EMT的關(guān)鍵分子，當(dāng)它表達(dá)下降，腫瘤上皮細(xì)胞則容易發(fā)生EMT，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲能力加強(qiáng)［11］。Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞中最主要的中間纖維，存在于中胚層起源的細(xì)胞中，如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞等，研究［12］表明，其在人類列腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、甲狀腺癌等上皮源性腫瘤中存在異常表達(dá)，是EMT的又一標(biāo)志性分子，與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Hendrix et al［13］將vimentin特定的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染到表達(dá)vimentin的細(xì)胞株，結(jié)果可降低該細(xì)胞株侵襲和遷移能力，強(qiáng)調(diào)了其在細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移中的促進(jìn)作用。本研究顯示轉(zhuǎn)染TFPI-2基因真核表達(dá)載體的PC3M與轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組比較，E-cadherin表達(dá)較多，vimentin表達(dá)較少，說明TFPI-2可能是通過促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)和抑制vimentin的表達(dá)來抑制人前列腺癌細(xì)胞EMT，從而抑制了前列腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

snail蛋白被認(rèn)為是E-cadherin的一種強(qiáng)烈轉(zhuǎn)錄抑制因子［14］。其通過其鋅指結(jié)構(gòu)與E-cadherin的啟動子E-box結(jié)合，抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)了EMT。研究［15］表明snail蛋白的高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的EMT，提高了腫瘤細(xì)胞的運動性和侵襲力。本研究顯示PC3M轉(zhuǎn)染TFPI-2后，與對照組比較，snail蛋白表達(dá)減少，因此TFPI-2通過抑制snail信號途徑來抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄可能也是抑制前列腺癌EMT機(jī)制之一。

綜上所述，TFPI-2抑制了前列腺癌細(xì)胞的EMT，這是其抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制之一，盡管其中許多機(jī)制尚未完全明了，但TFPI-2在前列腺癌演進(jìn)中的生物相關(guān)性是一個值得深入研究的方向，可以為前列腺癌甚至是其他惡性腫瘤的基因及生物靶向治療提供一個新的思路與方法。

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Tissuefactor pathway inhibitor-2 inhibits epithelial-mesenchymal transition in human prostate cancer cells

Liu Shuhan，Xuan Qiang，Tan Yi′ao，et al
（Dept of Urology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

ObjectiveTo investigate the influence of tissue factor pathway inhibitor-2（TFPI-2）on epithelial-mesenchymal transition（EMT）in human prostate cancer cells.MethodsPC3M cells were cultured and divided into three groups，respectively transfected with TFPI-2 gene eukaryotic expression vector，empty carrier and nothing.Wound healing assay and thanswell assay were performed to evaluate motility and invasive capacity of three groups PC3M cells.Then the three groups cells were dealt with by transforming growth factor-β1（TGF-β1），cellular morphology was observed with inverted phase contrast microscope.Protein and mRNA levels of characteristic markers（E-cadherin，vimentin and snail）involved in EMT were respectively detected in cells of three groups by Western blot and reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）.Resultswere statistically analyzed.ResultsWound healing assay and thanswell assay revealed that migration rate of transfected cells was lower（P＜0.05），invasive cells number of that was fewer（P＜0.05）.Transfected cells displayed an epithelial-like morphology，transfected empty-carrier cells and non-transfected cells showed a mesenchymal-like morphology by inverted phase contrast microscope.Western blot and RT-PCR displayed that E-cadherin was more，vimentin and snail were less on protein and mRNA levels in transfected cells compared with transfected empty-carrier cells and non-transfected cells；the difference was statistically significant（P＜0.05），and the difference between transfected empty-carrier cells and non-transfected cells was not statistically significant.ConclusionTFPI-2 can inhibit EMT in human prostate cancer cells.It is one of the possible mechanisms of inhibiting the invasion and metastasis of prostate cancer cell.It will help to provide new train of thought and direction for gene and biologically targeted theropy for prostate cancer.

tissue factor pathway inhibitor-2；prostate cancer；epithelial-mesenchyml transition

R 737.25

A

1000-1492（2015）12-1738-06

時間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.014.html

2015-08-28接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號：1408085MH181）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院1泌尿外科、2膽胰外科，合肥230001

劉樹瀚，男，碩士研究生；周林玉，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zhoulinyu6＠126.com；

宣 強(qiáng)，男，副主任醫(yī)師，責(zé)任作者，E-mail：93873951＠qq.com