ApoE基因敲除高脂血癥小鼠下頜下腺超微結(jié)構(gòu)及上游刺激因子1表達(dá)觀察

李 靜，黃大可，桂 麗，賈雪梅

ApoE基因敲除高脂血癥小鼠下頜下腺超微結(jié)構(gòu)及上游刺激因子1表達(dá)觀察

李 靜1，2，黃大可3，桂 麗3，賈雪梅1

目的觀察載脂蛋白E（ApoE）基因敲除高脂血癥（HLP）對(duì)小鼠下頜下腺超微結(jié)構(gòu)以及上游刺激因子1（USF1）表達(dá)影響。方法10只野生型小鼠予普通飼料喂養(yǎng)作為對(duì)照組，10只ApoE基因敲除子鼠予高脂飼料喂養(yǎng)作為高脂組。造模6個(gè)月后，取眼眶血檢測(cè)血脂；取小鼠下頜下腺組織分別進(jìn)行光鏡、電鏡和免疫組織化學(xué)觀察。結(jié)果與對(duì)照組比較，高脂組膽固醇、三酰甘油和極低密度脂蛋白含量明顯升高（P＜0.05）。HE染色觀察到，高脂組小鼠下頜下腺的腺泡明顯萎縮，細(xì)胞排列紊亂。電鏡下，可見高脂組小鼠導(dǎo)管上皮內(nèi)線粒體嵴斷裂，腺細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊狀擴(kuò)張，結(jié)構(gòu)松散零亂。免疫組化顯示，高脂組USF1表達(dá)下降；平均光密度值與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論HLP可導(dǎo)致小鼠下頜下腺超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病理改變，USF1表達(dá)減少。

高脂血癥；超微結(jié)構(gòu)；上游刺激因子1；下頜下腺；小鼠

高脂血癥（hyperlipidaemia，HLP）是指血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）過高或血清高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）過低的一種全身代謝異常綜合征。研究［1］表明，HLP是動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）、冠心病、高血壓、糖尿病及膽石癥等多種疾病的重要誘發(fā)因素。研究［2］表明，HLP可導(dǎo)致下頜下腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)異常及分泌功能降低。上游刺激因子1（upstream stimulatory factor，USF1）廣泛參與控制和調(diào)節(jié)體內(nèi)糖、脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)。USF1作為家族聯(lián)合性高脂蛋白血癥（familial combined hyperlipidemia，F(xiàn)CHL）中第一個(gè)相關(guān)基因，可以引起患者血液中TC和（或）TG含量上升［3］。目前USF1與家族性混合型HLP以及代謝綜合征的相關(guān)性是大家普遍關(guān)注的問題。盡管USF1在人體中廣泛存在，但HLP時(shí)下頜下腺中USF1的表達(dá)以及超微結(jié)構(gòu)的變化尚未見有關(guān)報(bào)道。載脂蛋白E基因（apolipoprotein E，ApoE）敲除小鼠由于脂質(zhì)代謝障礙，在病變?cè)缙谘杆俪霈F(xiàn)明顯的HLP，是目前建立HLP較理想的典型動(dòng)物模型。該實(shí)驗(yàn)用ApoE基因敲除小鼠給予高脂飲食復(fù)制HLP動(dòng)物模型，對(duì)其下頜下腺進(jìn)行形態(tài)學(xué)USF1表達(dá)變化的觀察，以期為探討HLP對(duì)下頜下腺形態(tài)及分泌功能的影響提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑USF1的抗體和SP免疫組化試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物模型復(fù)制及標(biāo)本制備10只野生型小鼠與10只ApoE基因敲除子鼠購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，清潔級(jí)，分為兩組；10只野生型小鼠予普通飼料喂養(yǎng)作為對(duì)照組；10只ApoE基因敲除小鼠予高脂飼料（膽固醇0.5%、豬油10%、蛋黃粉10%、維持料59.5%、蔗糖20%）喂養(yǎng)作為高脂組；單籠飼養(yǎng)12周，自由攝食飲水。在此期間各組動(dòng)物均不限制飲食和飲水。造模6個(gè)月后，禁食12 h將兩組小鼠分別經(jīng)眼眶采血送檢各組TG、TC、極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）水平。取下頜下腺組織，用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4 μm，進(jìn)行染色處理。

1.3 HE染色切片脫蠟至水，入蘇木精染色20 min，再進(jìn)行鹽酸乙醇分色、藍(lán)化，入伊紅染色1 min，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。

1.4 電鏡處理將下頜下腺組織切成3 mm大小，固定于1%鋨酸，環(huán)氧樹脂Epon-812包埋，超薄切片，醋酸鈾及檸檬酸鉛雙重染色，在日產(chǎn)JEO L-1230透射電鏡下觀察并攝片。

1.5 免疫組織化學(xué)染色采用免疫組織化學(xué)SP法染色。所用抗體及稀釋度如下：一抗為兔抗鼠USF1的抗體，稀釋度分別為1∶80，37℃孵育40 min后，置4℃過夜；二抗為羊抗兔IgG血清，37℃孵育15 min；辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37℃孵育30 min。DAB顯色后脫水、透明和封片。用PBS替代第一抗體作陰性對(duì)照。

1.6 計(jì)算機(jī)圖像分析在光鏡（10×40倍）下，利用Nikon彩色數(shù)碼CCD攝像頭捕獲各組下頜下腺HE切片中腺泡和導(dǎo)管圖像，捕獲各組免疫組化染色切片中USF1的圖像，每張切片隨機(jī)選取8個(gè)視野，再用metamorph生物圖像軟件計(jì)算各組USF1免疫陽性細(xì)胞的平均光密度（average optical density，MOD）值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，分析各組USF1免疫陽性細(xì)胞的MOD值，數(shù)據(jù)以ˉx ±s表示，兩組資料比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血脂結(jié)果與對(duì)照組比較，高脂組TC、TG、 VLDL表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組小鼠TG、TC、VLDL的比較（n＝10，）

與高脂組比較：*P＜0.05

項(xiàng)目對(duì)照組高脂組t值TC（mmol／L）2.97±0.39*33.37±16.384.872 TG（mmol／L）1.10±0.67*5.17±2.703.940 VLDL（mmol／L）0.52±0.169.83±4.115.946

2.2 HE染色結(jié)果對(duì)照組小鼠下頜下腺由分泌部和導(dǎo)管部組成，分泌部為混合性腺泡。腺泡飽滿，結(jié)構(gòu)清晰，腺泡細(xì)胞為錐體形，胞質(zhì)染色較淺，細(xì)胞核圓形且靠近基底部。導(dǎo)管部包括閏管、顆粒曲管（granular convoluted tubule，GCT）、紋狀管和排泄管4部分組成，其中GCT是一段長(zhǎng)而粗的彎曲小管，是嚙齒類動(dòng)物特有的結(jié)構(gòu)。高脂組小鼠下頜下腺的腺泡出現(xiàn)輕度萎縮現(xiàn)象，細(xì)胞排列紊亂，GCT導(dǎo)管上皮細(xì)胞萎縮，細(xì)胞頂部胞質(zhì)中嗜酸性分泌顆粒減少，結(jié)締組織增生（圖1）。

2.3 電鏡結(jié)果正常小鼠下頜下腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體發(fā)達(dá)，線粒體嵴清晰完整；高脂組線粒體出現(xiàn)嵴斷裂、紊亂、消失、基質(zhì)溶解（圖2）。正常小鼠下頜下腺腺細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，網(wǎng)腔均勻且分布規(guī)則，高脂組局部粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈囊狀擴(kuò)張，結(jié)構(gòu)松散零亂（圖3）。

2.4 免疫組化染色結(jié)果陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示為陰性。USF1陽性表達(dá)主要定位于小鼠下頜下腺

的腺泡及導(dǎo)管上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，免疫組化染色以出現(xiàn)棕黃色顆?；螯S色顆粒為陽性著色，對(duì)照組小鼠下頜下腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均出現(xiàn)明顯的棕黃色至棕褐色顆粒，高脂組小鼠下頜下腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核呈現(xiàn)淺黃色顆粒，且細(xì)胞質(zhì)內(nèi)著色顆粒明顯減少（圖4）。

2.5 計(jì)算機(jī)圖像分析結(jié)果對(duì)照組小鼠下頜下腺內(nèi)USF1的MOD值為（0.67±0.12），高脂組為（0.56±0.06），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.657，P＝0.016）。

3 討論

HLP是由于外源性脂質(zhì)攝入過多，或體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂等各種原因?qū)е碌难獫{中TC、TG和（或）LDL過高和（或）HDL過低的一種全身脂代謝異常。臨床研究［4-6］證明，HLP是誘發(fā)AS和心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，對(duì)人體健康的損害主要表現(xiàn)在對(duì)心血管系統(tǒng)的損傷。下頜下腺產(chǎn)生的多種生物活性物質(zhì)主要通過旁分泌方式分泌到細(xì)胞間隙，直接或間接調(diào)節(jié)頜下腺的分泌活動(dòng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體多種生理功能。本實(shí)驗(yàn)中ApoE基因敲除小鼠給予高脂飲食6個(gè)月后，其血中TC、TG明顯升高，提示HLP小鼠動(dòng)物模型造模成功。

本實(shí)驗(yàn)電鏡結(jié)果表明，高脂組小鼠下頜下腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞線粒體嵴斷裂，腺上皮內(nèi)部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊狀擴(kuò)張，提示HLP可以導(dǎo)致下頜下腺超微結(jié)構(gòu)的改變。細(xì)胞生命活動(dòng)所需要能量和蛋白質(zhì)絕大部分由線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提供，兩者形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化均受細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境影響；同時(shí)在細(xì)胞和組織發(fā)生病變或損傷時(shí)，線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均是較敏感的反映指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)觀察到高脂組小鼠下頜下腺線粒體出現(xiàn)嵴斷裂、紊亂，部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈囊狀擴(kuò)張等形態(tài)結(jié)構(gòu)改變勢(shì)必影響其分泌和合成功能。這可能由于HLP時(shí)持續(xù)升高的TG和游離脂肪酸易造成機(jī)體胰島素抵抗，使葡萄糖氧化減少，無氧酵解增加，導(dǎo)致葡萄糖等能量代謝障礙［7-8］。

ApoE基因作為血漿脂蛋白的重要成分，是機(jī)體內(nèi)重要的膽固醇載體，同時(shí)也是HLP、AS等疾病發(fā)生、發(fā)展的重要分子靶標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ApoE基因敲除高脂組小鼠下頜下腺中USF1的表達(dá)明顯下降，可以推測(cè)出ApoE基因敲除和高脂飲食對(duì)小鼠下頜下腺中USF1表達(dá)具有下調(diào)作用。

USF1是真核生物體內(nèi)廣泛分布的一種多功能蛋白質(zhì)，在機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的作用。近年來，大量的細(xì)胞生化分子實(shí)驗(yàn)研究表明：USF廣泛參與控制和調(diào)節(jié)糖、脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)［9］。Putt et al［10］從USF基因的單核苷酸多態(tài)性方面研究，發(fā)現(xiàn)USF基因的某些多態(tài)性的變化會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)個(gè)體患FCHL的幾率上升，同時(shí)在易患個(gè)體中，ApoE的表達(dá)量明顯下降；Lee et al［11］研究荷蘭患FCHL的家庭成員發(fā)現(xiàn)USF的基因多態(tài)性與個(gè)體TG及ApoE的血清水平具有顯著關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂組小鼠下頜下腺中USF1的表達(dá)明顯下降。推測(cè)ApoE基因敲除和高脂飲食對(duì)小鼠下頜下腺中USF1表達(dá)具有下調(diào)作用；而USF1的分泌減少將影響血脂代謝水平。其可能機(jī)制有：①HLP時(shí)大量脂肪細(xì)胞產(chǎn)生，腫瘤壞死因子-α［12］、瘦素［13］等細(xì)胞因子的高表達(dá)在胰島素抵抗發(fā)展過程中起著重要作用，使葡萄糖代謝障礙，導(dǎo)致機(jī)體合成USF1所需能量不足；②HLP時(shí)，血液中血脂濃度長(zhǎng)期處于較高水平，內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)下調(diào)使一氧化氮合成減少，進(jìn)而影響血管舒張功能和血管內(nèi)皮功能導(dǎo)致下頜下腺血供下降［14］，引起組織缺血低氧，導(dǎo)致USF1的合成下降。

下頜下腺是具有內(nèi)、外分泌功能的腺體，其對(duì)機(jī)體各種生理功能的重要調(diào)節(jié)作用日漸受到人們的普遍關(guān)注和重視。本實(shí)驗(yàn)通過建立HLP小鼠模型觀察到HLP可導(dǎo)致下頜下腺超微結(jié)構(gòu)病理改變，USF1表達(dá)減少。但是關(guān)于HLP導(dǎo)致小鼠下頜下腺導(dǎo)管上皮USF1表達(dá)下調(diào)的分子機(jī)制等問題還有待進(jìn)一步研究。

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Observation of submandibular gland ultrastructure and upstream stimulatory factor 1 expression in hyperlipidemic ApoE knockout mice

Li Jing1，2，Huang Dake3，Gui Li3，et al
（1Histology and Embryology Teaching and Research Section，3Comprehensive Laboratory，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Library and Information Center，Anhui Medical College，Hefei 230601）

ObjectiveTo observe the expression of apolipoprotein E（ApoE）gene knocking out hyperlipidemia（HLP）in mice submandibular gland ultrastructure and upstream stimulating factor 1（USF1）.MethodsTake 10 wild mice fed with normal feed as control group，10 ApoE knockout mice fed with high fat as hyperlipidemia group.Six months after the model was set up，blood fat in orbital blood was tested.The submandibular gland tissues of the mice were observed by using light microscopy，electron microscopy and immunohistochemistry staining.ResultsCompared with the control group，the cholesterol，triglycerides and very low-density lipoprotein of high-fat group were significantly higher（P＜0.05）.HE staining was observed，the acini of the submandibular glands in hyperlipidemia group was atrophied obviously，and the cells were in disorder.Under electron microscopy，the submandibular gland cell mitochondria crests of mice in hyperlipidemia group were fractured，and rough endoplasmic reticulum cystically expanded，which was loose and messy.ImmunohistochemicalResultsshowed that the USF1 expression in hyperlipidemia group decreased；the difference in average optical density value and the control group was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionHLP can result in pathological changes in the mouse submandibular gland ultrastructure and reduction in USF1 expression.

hyperlipidemia；ultrastructure；upstream stimulatory factor 1；submandibular gland；mice

R 332

A

1000-1492（2015）12-1725-04

時(shí)間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.008.html

2015-07-01接收

安徽省教育廳自然科學(xué)基金研究項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2012A164）

安徽醫(yī)科大學(xué)1組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室、3綜合實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032

2安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校圖文信息中心，合肥 230601

李 靜，女，館員，碩士研究生；

賈雪梅，女，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：jiaxueme＠126.com