蘋果皮提取物及有效成分C3G對小鼠乳腺惡性腫瘤生長的影響

郭 強(qiáng)，汪心怡，朱其蘋，范楚苓，朱 佩，任海風(fēng)，李菲菲，汪思應(yīng)

◇基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究◇

蘋果皮提取物及有效成分C3G對小鼠乳腺惡性腫瘤生長的影響

郭 強(qiáng)1，汪心怡2，朱其蘋1，范楚苓1，朱 佩1，任海風(fēng)1，李菲菲1，汪思應(yīng)1

目的探討蘋果皮提取物及其有效成分矢車菊-3-葡萄糖苷（C3G）對乳腺惡性腫瘤生長的影響。方法建立E0771小鼠乳腺癌移植瘤模型，觀察飲用蘋果皮汁對小鼠乳腺惡性腫瘤生長的影響。免疫組化法分析飲用蘋果皮汁與飲用普通無菌水組小鼠惡性腫瘤組織中CD31表達(dá)差異。HPLC法分析蘋果皮提取物中的化學(xué)成分。3D Matrigel膠血管形成實(shí)驗(yàn)探討蘋果皮成分C3G對小鼠乳腺惡性腫瘤血管形成的影響。MTT法和Transwell實(shí)驗(yàn)觀察C3G對血管內(nèi)皮細(xì)胞SVEC增殖和遷移能力的影響。結(jié)果飲用含有1%和2%濃度的蘋果皮汁無菌水對乳腺惡性腫瘤生長起到抑制作用。免疫組化法染色顯示飲用蘋果皮汁腫瘤中CD31表達(dá)低于未飲用蘋果皮汁組。HPLC法分析顯示C3G是蘋果皮提取物的有效成分之一。3D Matrige膠實(shí)驗(yàn)顯示C3G抑制小鼠乳腺癌細(xì)胞E0771血管生成。C3G血管形成抑制小鼠內(nèi)皮細(xì)胞SVEC的遷移能力。結(jié)論蘋果皮提取物及其有效成分C3G抑制小鼠乳腺癌生長，該作用可能通過抑制血管生成而實(shí)現(xiàn)。

乳腺癌；蘋果皮；矢車菊-3-葡萄糖苷

蘋果含有豐富的植物纖維、維生素、蛋白質(zhì)和多酚類物質(zhì)。流行病學(xué)調(diào)查［1］顯示，多食用蘋果可以降低一些慢性疾病的發(fā)生率，其中包括惡性腫瘤。對蘋果皮成分進(jìn)行分析顯示，其含有多種強(qiáng)抗氧化的化學(xué)物質(zhì)［2］，其抗氧化物質(zhì)含量約占整個(gè)果實(shí)的1／2［3］。體外實(shí)驗(yàn)［4-5］表明，蘋果皮可以抑制人前列腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。矢車菊-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，C3G）是廣泛存在于瓜果蔬菜中的花青素類，但在不同的水果中其含量也是千差萬別［6］，HPLC分析得出C3G是蘋果皮中的重要成分，具有明顯的抗氧化作用，當(dāng)機(jī)體由于氧化應(yīng)激引起多種疾病時(shí)，C3G可以在其中起到保護(hù)作用［7］，前期研究［8］證實(shí)酒精刺激乳腺癌引起氧化應(yīng)激，C3G可以抑制這一反應(yīng)從而保護(hù)機(jī)體。另外，C3G還被報(bào)道［9］可以抑制胰腺癌、肺癌細(xì)胞的生長，促進(jìn)人胃腺癌細(xì)胞的凋亡。C3G還可以抑制小鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖［10］。在乳腺癌中，C3G也可以抑制腫瘤生長，但其機(jī)制尚不清楚。推測C3G可能與乳腺腫瘤血管生成存在一定關(guān)系。腫瘤的血管生成與血管轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［11］。CD31又稱血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子，是內(nèi)皮細(xì)胞的主要標(biāo)志物，用于識(shí)別良惡性血管源性腫瘤及腫瘤間質(zhì)中血管生成狀況。腫瘤血管中血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管生成的關(guān)鍵步驟，該研究主要觀察蘋果皮汁與乳腺惡性腫瘤之間的關(guān)系及其提取物C3G在乳腺癌中發(fā)揮作用的機(jī)制，為乳腺癌治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料市售成熟紅富士蘋果30 kg。小鼠髓樣乳腺癌細(xì)胞E0771（簡稱為E0771）由C57BL／6小鼠自發(fā)乳腺癌取腫瘤組織原代培養(yǎng)所得。小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞SVEC細(xì)胞購自ATCC。雌性C57BL／6小鼠21只，5周齡，SPF級，平均體重18 g，隨機(jī)分成3組，分別購置飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑與儀器C3G由導(dǎo)師汪思應(yīng)教授從合作實(shí)驗(yàn)室美國肯塔基大學(xué)醫(yī)學(xué)部引進(jìn)；CD31抗體、DMSO（美國Sigma公司，貨號(hào)131M-9）；Matrige膠（美國BD公司）；MTT試劑盒（南京凱基生物技術(shù)有限公司）；倒置顯微鏡TMT2-21（美國奧林巴斯公司）、120C（日本尼康公司）；高速營養(yǎng)機(jī)（Philips HR1861，日本菲利普公司）；HPLC儀（Hypersil BDS，美國Thermo公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（371型，美國Thermo公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

1.3.1 E0771細(xì)胞和SVEC細(xì)胞培養(yǎng) E0771細(xì)胞和SVEC細(xì)胞均為DMEM培養(yǎng)基與胎牛血清FBS按照9∶1配成DMEM完全培養(yǎng)基，加入青霉素-鏈霉素合劑，抗生素終濃度為：青霉素1×105U／L，鏈霉素0.1 g／L，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞80%融合時(shí)，傳代培養(yǎng)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 C3G處理組E0771細(xì)胞的建立 取對數(shù)生長期的細(xì)胞E0771接種于60 mm細(xì)胞皿中，細(xì)胞貼壁后分別用10、20 nmol／L的C3G處理細(xì)胞26 h，對照組加入C3G同一溶劑，全程需避光培養(yǎng)。

1.4 含1%、2%蘋果皮汁無菌水制取普通紅富士蘋果削皮后，棄果肉，取果皮，使用高速營養(yǎng)榨汁機(jī)榨汁，收集蘋果皮汁，用紗布過濾后，再使用0.2 μm濾器過濾成無菌無渣蘋果皮汁。1%、2%蘋果皮汁濃度分別為100 ml無菌水中加1 g、2 g無菌無渣蘋果皮汁。

1.5 小鼠乳腺癌模型建立取指數(shù)生長期的E0771細(xì)胞，常規(guī)消化計(jì)數(shù)，用PBS重懸所需細(xì)胞，將細(xì)胞接種于C57BL／6小鼠第二對右側(cè)乳腺處，接種量為每只3.5×105個(gè)細(xì)胞（100 μl），整個(gè)操作過程中E0771細(xì)胞置于冰上保存。

1.6 HPLC法分析蘋果皮汁成分收集蘋果皮汁1 kg／L為樣品，樣品溶解于含有甲酸的乙腈水中。標(biāo)準(zhǔn)品為50 mmol／L C3G，同樣溶解于含有甲酸的乙腈水中。檢測條件如下：色譜柱：Thermo Hypersil BDS C18（100 mm×3 mm i.d，3 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸溶液（14∶86）；流速：0.5 ml／min；檢測波長：250 nm；時(shí)間：20.5 min。

1.7 3D Matrigel膠血管形成實(shí)驗(yàn)將Matrigel基質(zhì)膠置于4℃冰箱過夜融化，將實(shí)驗(yàn)中所需EP管和移液槍頭，24孔板均提前置于4℃預(yù)冷，取生長對數(shù)期的E0771細(xì)胞和C3G處理后E0771細(xì)胞，PBS清洗，胰酶消化，計(jì)數(shù)，保證10 μl DMEM培養(yǎng)基中含有3 000個(gè)細(xì)胞。取10 μl培養(yǎng)基與200 μl Matrigel膠混合，將混合液接種于24孔板中，置于37℃孵箱20 min，Matrigel膠凝固后，上層加500 μl DMEM培養(yǎng)基防止干燥。約10 d后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.8 免疫組化實(shí)驗(yàn)解剖小鼠，取腫瘤固定后，脫水，制成蠟塊，標(biāo)本蠟塊連續(xù)切片，確保切片厚度≤2 μm，常規(guī)二甲苯脫蠟，使用H2O2去離子水消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗2次，一抗4℃孵育過夜，孵育結(jié)束后使用PBS清洗3次，室溫使用一抗對應(yīng)二抗孵育15～20 min，PBS清洗3次，每次5 min，辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液滴加至標(biāo)本，室溫孵育15 min，PBS清洗3次，每次5 min，DAB顯色，使用蘇木精染色，然后鹽酸乙醇分化，乙醇溶液按梯度脫水，二甲苯透明后封片，至顯微鏡下拍照觀察。

1.9 MTT實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期細(xì)胞E0771、SVEC，消化，計(jì)數(shù)，分3組（對照組和10、20 nmol／L C3G處理組），每組設(shè)立6個(gè)復(fù)孔，每孔接種相同數(shù)目細(xì)胞，接種于96孔板。待細(xì)胞貼壁后，取0 h 96孔板，避光加入MTT，37℃孵育，隨后取出96孔板，棄上清液，每孔加入DMSO溶解結(jié)晶，混勻，490 nm酶標(biāo)儀檢測光密度值（optical density，OD）值。同上收取24 h及48 h的細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.10 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)將Transwell小室置于24孔板中，在其小室的上下均加入適量的純DMEM培養(yǎng)基水化小室，水化后，在小室下層加入含6%血清的DMEM完全培養(yǎng)基。處理細(xì)胞，取對數(shù)生長期細(xì)胞SVEC，消化、離心，取含血清2%的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)加入小室上層。置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約6 h后細(xì)胞可由上層小室穿過。隨后收板棄小室上下層培養(yǎng)基，棉簽擦拭上層小室細(xì)胞，并用PBS清洗2次，將小室置于固定液中固定已遷移過的細(xì)胞，隨后0.1%結(jié)晶紫染色。染色結(jié)束后，清洗多余染色液，室溫干燥，顯微鏡拍照。每孔隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目，取平均值。

1.11 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立E0771小鼠乳腺癌移植瘤模型后，平均分為3組，飲用水分別為普通無菌水、濃度為1%的蘋果皮汁無菌水、濃度為2%的蘋果皮汁無菌水，隔天記錄腫瘤體積，計(jì)算公式為：腫瘤體積（mm3）＝1／2×a×b2（a為腫瘤最長徑mm，b為腫瘤最短徑mm），繪制腫瘤生長曲線，3周后3組小鼠經(jīng)頸椎脫臼處死，解剖取腫瘤組織、肺組織。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)用表示。各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 飲用蘋果皮汁對小鼠乳腺腫瘤生長的影響按動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法，將實(shí)驗(yàn)分為3組，繪制腫瘤生長曲線顯示，飲用1%蘋果皮汁小鼠腫瘤體積低于飲用普通無菌水組，飲用2%蘋果皮汁小鼠腫瘤體積也明顯低于飲用普通無菌水組（P＜0.05）。說明飲用蘋果皮汁可以抑制小鼠乳腺惡性腫瘤的生長。見圖1。

2.2 免疫組化CD31染色結(jié)果通過免疫組化法染色，400倍鏡下觀察顯示，飲用含有1%蘋果皮汁無菌水小鼠腫瘤中其CD31表達(dá)明顯低于飲用普通無菌水組小鼠。說明蘋果皮汁有可能通過抑制腫瘤血管形成來發(fā)揮作用。見圖2。

2.3 HPLC分析結(jié)果HPLC分析顯示C3G是蘋果皮提取物的有效成分。見圖3。

2.4 3D Matrige膠血管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用不同濃度C3G（0、10、20 nmol／L）處理小鼠乳腺癌細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)顯示經(jīng)10、20 nmol／L C3G處理后，隨時(shí)間增加，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明C3G對E0771細(xì)胞增殖無明顯影響，見圖4。當(dāng)使用C3G后，E0771細(xì)胞其血管生成個(gè)數(shù)明顯低于對照組，說明C3G可能通過抑制血管生成影響乳腺腫瘤的生長，見圖5。

2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果為了更進(jìn)一步驗(yàn)證C3G與血管生長之間的關(guān)系，用C3G處理小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞與對照組進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，經(jīng)C3G處理后的細(xì)胞增殖能力與對照組并無明顯差別。見圖6。隨后進(jìn)行體外Transwell試驗(yàn)，在小室中同樣接種1×105個(gè)細(xì)胞，6 h后顯微鏡下觀察，使用C3G處理后的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞其穿過細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組，遷移能力下降，說明C3G可以抑制其遷移能力。見圖7。

3 討論

蘋果是生活經(jīng)常食用水果之一，眾所周知對健康有益，蘋果多酚中的黃酮醇被認(rèn)為在抑制癌癥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［5］。研究［6，12］表明，蘋果皮多酚含量是果肉的3～4倍，比例約占整個(gè)果實(shí)的一半。體外實(shí)驗(yàn)［3-4］顯示，蘋果皮可以抑制人前列腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)患有乳腺癌的小鼠日常無菌水更換為含有1%和2%濃度的蘋果皮汁無菌水后，隨著時(shí)間的增加，其腫瘤體積以及生長速度均低于飲用普通無菌水組。說明日常飲用蘋果皮汁可以減緩乳腺癌的發(fā)展。

研究［3-4］顯示蘋果皮抑制腫瘤生長機(jī)制主要是蘋果皮成分可以抑制腫瘤的增殖并且促進(jìn)凋亡。氧化應(yīng)激與腫瘤有著密切的關(guān)系，研究［13］表明腫瘤患者體內(nèi)氧化應(yīng)激失調(diào)，處于低抗氧化狀態(tài)，氧化應(yīng)激水平增高，蘋果皮中含有大量的黃酮醇，黃酮醇具有強(qiáng)大的抗氧化功能，但因?yàn)檠苌墒悄[瘤發(fā)生發(fā)展的重要步驟之一，所以該研究探討飲用蘋果皮汁對其腫瘤血管形成是否有一定影響，免疫組化結(jié)果顯示，飲用蘋果皮汁其CD31表達(dá)明顯低于對照組。

與此同時(shí)，HPLC法分析蘋果皮成分，結(jié)果顯示C3G是蘋果皮有效成分之一。C3G可以抑制胃癌、肺癌、胰腺癌［14］等腫瘤細(xì)胞的增殖。另有研究［15］表明，C3G與糖尿病小鼠中血管形成也有密切關(guān)系。本課題組前期實(shí)驗(yàn)［10］顯示，C3G同樣具有潛在強(qiáng)大抗氧化功能，并且可以抑制酒精誘導(dǎo)乳腺癌導(dǎo)致的遷移和侵襲［16］。3D Matrige膠血管形成實(shí)驗(yàn)探討C3G對乳腺癌細(xì)胞是否有一定作用，高濃度的3D Matrigel膠適用于體內(nèi)血管生成和腫瘤細(xì)胞遷移及腫瘤模型的建立。3D Matrigel膠血管形成實(shí)驗(yàn)是模擬腫瘤細(xì)胞在三維基質(zhì)內(nèi)生長，以觀察腫瘤細(xì)胞血管形成能力。本研究顯示，經(jīng)過C3G處理的腫瘤細(xì)胞血管形成能力明顯低于對照組，說明C3G不但具有抗氧化作用，還可以抑制腫瘤血管的形成。

通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明低濃度的蘋果皮汁對乳腺癌生長起到抑制作用，其機(jī)制可能是通過抑制血管生成來實(shí)現(xiàn)。提取蘋果皮中的C3G，抑制腫瘤細(xì)胞增殖及血管形成，為乳腺癌的治療可能提供新的研究方向。

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Effect of apple peel extract and its active components C3G on mouse’s malignant breast tumour growth

Guo Qiang1，Wang Xinyi2，Zhu Qiping1，et al
（1Dept of Pathophysiology，School of Basic Medical Sciences，2Dept of Clinical Medicine，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the effect of the apple peel extract and its active ingredients cyanidin-3-glucoside（C3G）on malignant breast tumour growth in vivo.MethodsC57BL／6 mouse breast cancer model was built to observe the effect of drinking apple peel juice on mouse breast tumour growth.IHC was used to analyze the differential expression of CD31 in the apple peel extract treated group and the control group.HPLC was used to analyze the chemical composition of apple peels extract.The effect of apple peel component C3G on blood vessels formation of mouse breast cancer cell line E0771 was investigated through 3D Matrigel.The effect of C3G on proliferation and migration of SVEC were determined via MTT and Transwell.Results1% and 2% concentration of apple peel juice inhibited the tumour growth in mouse breast cancer model.The expression of CD31 in apple peel extract treated group was lower than that of control group indicated by IHC staining.C3G was one of the effective components of the apple peel extract through HPLC analysis.C3G inhibited the blood vessels formation of mouse breast cancer cell line E0771 indicated by 3D Matrigel.The migration of SVEC cells was inhibited by C3G.ConclusionThe apple peel extract and its effective component C3G inhibit the tumour growth of mouse breast cancer，which is possibly achieved by inhibiting its angiogenesis.

breast cancer；apple peel；cyanidin-3-glucoside

R 363.2

A

1000-1492（2015）12-1711-05

時(shí)間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.002.html

2015-09-08接收

國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81302319）；安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1308085MH121）；安徽省留學(xué)回國人員科研項(xiàng)目（編號(hào)：2009-2011）

安徽醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室、2臨床醫(yī)學(xué)院，合肥 230032

郭 強(qiáng)，女，碩士研究生；汪思應(yīng)，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：sywang＠ahmu.edu.cn