人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的展望

楊曄 張躍蓉

顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(temporomandibular disorders，TMD)，是一種多因素互相作用產(chǎn)生的疾病。其中顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病，是TMD的常見類型，患發(fā)病后，出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨的器質(zhì)性改變，造成不可逆的缺損破壞，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降。人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞(hAMSCs)具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性和多向分化潛能以及低免疫原性，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞分化。這就為顳下頜骨關(guān)節(jié)病的治療提供了新的思路。本文就顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病及人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨分化潛能應(yīng)用于顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病治療展望。

1 顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病

馬緒臣［1］認(rèn)為，TMD是一組多種因素相互作用產(chǎn)生的疾病。目前病因尚未完全清楚。其中顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病，常伴有下頜運(yùn)動(dòng)異常、疼痛、彈響和雜音等癥狀［2］。影像學(xué)和關(guān)節(jié)內(nèi)鏡等輔助手段檢查發(fā)現(xiàn)，其關(guān)節(jié)盤、髁突等均發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了退行性改變，X線檢查可見骨質(zhì)吸收、破壞、硬化、囊變等，同時(shí)可見髁突前斜面磨平，骨贅形成等，也可見關(guān)節(jié)盤上下腔穿通和移位［2］。

在顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的治療中，多采用理療、頜墊治療、藥物治療及關(guān)節(jié)內(nèi)注射等保守治療為主的綜合治療［1，3］。由于關(guān)節(jié)軟骨無血管、神經(jīng)，因此當(dāng)各種原因造成軟骨缺損時(shí)，其自身修復(fù)能力有限，而保守治療無效，方可采用外科手術(shù)方法［4］。然而，顳下頜關(guān)節(jié)術(shù)后并發(fā)癥也不容忽視，尤其是隨著時(shí)間的推移［3］，植入顳下頜關(guān)節(jié)內(nèi)的代用品常會(huì)引起關(guān)節(jié)組織退行性變化，最終造成關(guān)節(jié)窩骨質(zhì)穿孔等病癥，帶給患者更大的傷害和痛苦。因此，國內(nèi)外的學(xué)者一直在探究治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病更理想的方法。而隨著干細(xì)胞研究的深入，利用間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能的組織工程為臨床治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病帶來了新的前景［5］。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)的臨床前研究

MSC是干細(xì)胞中的一種，來源于中胚層。1966年Friedenstein等［6-8］首先在骨髓中發(fā)現(xiàn)，進(jìn)而研究發(fā)現(xiàn)羊膜、脂肪等組織中同樣具有MSC。MSC免疫原性低，增殖能力強(qiáng)和多向分化潛能等優(yōu)點(diǎn)［9-11］，在適當(dāng)條件下能向骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)等多種組織分化。

臨床多采用骨髓MSC治療骨和軟骨病，2010年，Matsumoto等［12］在關(guān)節(jié)軟骨病的臨床研究中，應(yīng)用骨髓MSC自體移植治療，證明這種方法是安全，有效的。徐斌等［13，14］利用動(dòng)物模型，建立軟骨與骨髓 MSC共培養(yǎng)系統(tǒng)在體內(nèi)外誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的研究證明，軟骨細(xì)胞微環(huán)境能有效誘導(dǎo)骨髓MSC向軟骨分化。

但骨髓MSC的獲取是有創(chuàng)傷的過程，同時(shí)研究表明隨著年齡的增長，骨髓的質(zhì)量和數(shù)量會(huì)下降［15］。羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(HAMSCs)是間充質(zhì)干細(xì)胞中的一種，相比于骨髓MSC，HAMSCs具有更多優(yōu)勢(shì)，尤其是來源方面，它來源于廢棄的胎盤，而胎盤在孕婦分娩過程中被排出體外，不需要進(jìn)行額外的手術(shù)操作，不存在倫理問題。同時(shí)它具有比骨髓MSC更強(qiáng)的分化能力［9］，并且來源豐富。既往的研究發(fā)現(xiàn)，HAMCs表達(dá)HLA-A，B和C，不表達(dá)HLA-DR，HL A-G呈弱陽性表達(dá)，也有研究發(fā)現(xiàn)，羊膜細(xì)胞能夠抑制激活的外周血單核細(xì)胞(PBMCs)的增殖;HAMSCs應(yīng)用于眼科移植術(shù)的研究，結(jié)果未出現(xiàn)排斥反應(yīng)［10，11］，證明其免疫原性低，認(rèn)為HAMSCs是一種免疫赦免物質(zhì)。藉此表明HAMSCs是治療關(guān)節(jié)軟骨病的理想材料

3 HAMSCs的來源，分離和培養(yǎng)及鑒定

3.1 HAMSCs的來源 羊膜位于胎盤絨毛膜表面，羊膜腔內(nèi)充滿羊水。主要由來源于外胚層的上皮細(xì)胞和來源于中胚層的間充質(zhì)細(xì)胞組成。厚度為0.02～0.05 mm，是人體中最厚的基底膜。有韌性，無血管，神經(jīng)和淋巴管。可分為上皮層，基底膜層，致密層，纖維母細(xì)胞層和海綿層。HAMSCs來源于胎盤羊膜組織，具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。

3.2 HAMSCs的分離和培養(yǎng) HAMSCs分離，多采用機(jī)械法剝離胎盤羊膜組織，兩步酶消化法獲取。即先胰蛋白酶消化并棄除羊膜上皮細(xì)胞，再將剩余羊膜組織充分剪碎，膠原酶消化。這樣對(duì)HAMSCs保護(hù)較好，可大量獲取高活性和均一的細(xì)胞［16］。同時(shí)，有學(xué)者也提出可以用細(xì)胞表面標(biāo)志物CD49d鑒別HAMCs和人羊膜上皮細(xì)胞(HAECs)［17］。比較不同妊月的胎盤羊膜所能獲取的細(xì)胞數(shù)量，以足月胎盤羊膜可以獲得5×108個(gè)HAMCs為最多，但也與處理羊膜過程有關(guān)［18，19］。

HAESCs的體外培養(yǎng)采用DMEM:F12培養(yǎng)基，加入胎牛血清(FBS)、堿性成纖維生長因子(bFGF)，置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h后，根據(jù)細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，胰酶消化傳代［20］。通過記錄生長曲線可以看出，HAMSCs開始時(shí)增殖旺盛，第2天開始就進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，第7天達(dá)到生長高峰，第8天后進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞增殖明顯變緩［21］。

3.3 HAMSCs干細(xì)胞表型特征的鑒定 免疫熒光檢測(cè)顯示，HAMSCs表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記物Oct-4，SSEA-4，而Oct-4，被公認(rèn)為是多能干細(xì)胞自我更新和分化的基因［22］。免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果顯示，所分離的原代HAMSCs表達(dá)波形蛋白，而不表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志CK19，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，原代培養(yǎng)的HAMSCs高表達(dá)CD29和CD44［21］。以上檢測(cè)均證實(shí)HAMSCs具有干細(xì)胞的生物學(xué)特性.

4 HAMSCs的軟骨誘導(dǎo)分化潛能

HAMSCs具有多向分化潛能，其中之一是分化成為中胚層的軟骨組織，在妊娠早期(7～14周)和妊娠晚期(34～40周)羊膜中分離獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞可向軟骨細(xì)胞分化，表達(dá)軟骨特異性的Ⅱ型膠原蛋白［23］。Soncini等［24］和宋秀軍［25］均報(bào)道在體外成功誘導(dǎo)HAMSCs分化成軟骨細(xì)胞。另有研究應(yīng)用共同誘導(dǎo)分化、上清誘導(dǎo)法也獲取了同樣的成功［26，27］。

5 HAMSCs在顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病中的展望

由于HAMSCs所具有取材容易，來源豐富，強(qiáng)增值性，低免疫原性和多向分化能力并且符合倫理的優(yōu)點(diǎn)。因此利用HAMSCs的干細(xì)胞特性治療顳下頜骨關(guān)節(jié)病，是區(qū)別于傳統(tǒng)方法的新途徑。目前，在治療性研究中，楊興華等［28］利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，采用骨髓MSC治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病，效果良好。說明這是治療顳下頜骨關(guān)節(jié)病的可行方法。HAMSCs屬于間充質(zhì)干細(xì)胞家族，并且在取材，來源，增殖性等各方面均強(qiáng)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。尤其是HAMSCs在實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)軟骨的成功，為治療顳下頜骨關(guān)節(jié)病的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。在未來的研究中，HAMSCs誘導(dǎo)為軟骨的分子機(jī)制，及其在臨床應(yīng)用中的安全性，相容性等還需要進(jìn)一步詳細(xì)探索，以使其誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞能更好地接近顳下頜關(guān)節(jié)軟骨，最終實(shí)現(xiàn)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)和再生。

1 馬緒臣主編.顳下頜關(guān)節(jié)病的基礎(chǔ)與臨床.第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2000.102-116，197-201.

2 邱蔚六主編.口腔頜面外科學(xué).第6版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008.324-333.

3 谷志遠(yuǎn)，傅開元，張震康主編.顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病.第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2007.309-325.

4 Maegawa N，Kawamura K，Hirose M，et al.Enhancement of osteoblastic differentiation of mesenchymal stromal cells cultured by selective combination of bone morphogenetic protein-2(BMP-2)and fibroblast growth factor-2(FGF-2).J Tissue Eng Regen Med，2007，1:306-313.

5 Abdallah BM，Kassen M.Human mesenchymal stem cells:from basic biology to clinical applications.Gene Ther，2008，15:109-116.

6 Friedenstein AJ，Piatetzky-ShapiroⅡ，Petrakova KV.Osteogenesis in transplants of bone marrow cells.JEmbryol Exp Morphol，1966，16:381-390.

7 Magatti M，De Munari S，Vertua E，et al.Human amnion mesenchyme harbors cells with allogeneic T-cell Suppression and Stimulation capabilities.Stem Cells，2008，26:182-192.

8 Locke M，Ussher JE，Mistry R，et al.Transduction of human adipose-derived mesenchymal stem cell by recombinant adeno-associated virus vectors.Tissue Engineering Part C:Methods，2011，17:949-959.

9 穆曉紅，徐林，趙子義，等.人胎盤與骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及生物學(xué)特性對(duì)比.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13:3708-3712.

10 王樂，周輝.羊膜的生物學(xué)特性及眼科應(yīng)用進(jìn)展.實(shí)用臨床醫(yī)學(xué)，2006，7:155-157.

11 文道源，袁進(jìn)，陳家祺.羊膜的應(yīng)用與生物學(xué)改良.中華眼科雜志，2006，42:361-364.

12 Matsumoto T，Okabe T，Ikawa T，et al.Articular cartilage repair with autologous bone marrow mesenchymal cells.J Cell Physiol，2010，225:291-295.

13 徐斌，周亮，王英明，等.同種異體脫鈣骨與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞關(guān)節(jié)腔內(nèi)共培養(yǎng):與同腔軟骨性狀的對(duì)比.中國組織工程研究，2014，18:1165-1171.

14 詹興旺，姜艷，王文良.SPIO標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)的研究.中國矯形外科雜志，2011，19:769-773.

15 趙子義，郭希民，王常勇，等.成人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離和純化中華創(chuàng)傷骨科雜志，2004，6:740-743.

16 肖盼，陳劍，王彥平等.不同消化分離方法分離人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞效果比較.中國病理生理雜志，2010，26:1033-1037.

17 Wolbank S，Peterbauer A，F(xiàn)ahrner M，et al.Dose-dependent immunomodulatory effect of human stem cells from amniotic membrane:a comparison with human mesenchymal stem cells from adipose tissue.Tissue Eng，2007，13:1173-1183.

18 Casey ML，MacDonald PC.Interstitial collagen synthesis and processing in human amnion:a property of the mesenchymal cells.Biol Reprod，1996，55:1253-1260.

19 Alviano F，F(xiàn)ossati V，MarchionniC，et al.Term amniotic membrane is a high throughput source for multipotent mesenchymal stem cells with the ability to differentiate into end-othelial cells in vitro.BMC Dev Biol，2007，21，7:11.

20 李海建，張廣靜，江蘭，等.人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)及其干細(xì)胞特性研究.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，2:227-229.

21 方寧，張路，宋秀軍，等.人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，32:234-236.

22 Niwa H，Masui S，Chambers I，et al.Phenotypic complementation establishes requirements for specific POU domain and generic transactivation function of Oct-3/4 in embryonic stem cells.Mol Cell Biol，2002，22:1526-1536.

23 PortmannLanz CB，SchoeberleinA，Huber A，et al.Placental mesenchymal stem cell as potential autologous graft for pre-and perinatal neuroregeneration.Am J Obstet Gynecol，2006，194:664-673.

24 Soncini M，Vertua E，Gibelli L，et al.Isolation and characterization of mesenchymal cells from human fetal membranes.Tissue Eng Regen Med，2007，1:296-305.

25 宋秀軍，陳代雄，方寧，等.人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞具有分化成軟骨及成骨細(xì)胞的潛能.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11:10056-10060.

26 周峰，王英振，張海寧，等.人軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化.中國組織工程研究，2013，17:7034-7039.

27 李麗艷，杜江，黃金中，等.兔軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞成骨的可行性.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13:9713-9714.

28 楊興華，彭琳，劉云生，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病.中國組織工程研究，2013，17:3488-3494.