應(yīng)用小鼠建立特應(yīng)性皮炎模型的研究進(jìn)展

李 輝，高 強(qiáng)，王翼騰，張麗明，陳 虹綜述 李 覃審校

綜 述

應(yīng)用小鼠建立特應(yīng)性皮炎模型的研究進(jìn)展

李 輝1，高 強(qiáng)1，王翼騰2，張麗明2，陳 虹3綜述 李 覃4審校

特應(yīng)性皮炎；小鼠；動(dòng)物模型；研究進(jìn)展

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎性反應(yīng)性皮膚疾病，嬰兒和兒童發(fā)病率在全球處于逐年上升狀態(tài)。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)有藥物治療效果較差，已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。目前，動(dòng)物模型作為最常用的研究對(duì)象，在研究人類(lèi)AD中具有重要價(jià)值。常見(jiàn)動(dòng)物包括家兔、大鼠、小鼠、豚鼠等，其中小鼠以價(jià)格低廉、與人類(lèi)AD相似、模型易建立等優(yōu)勢(shì)而備受青睞。筆者對(duì)近年應(yīng)用小鼠建立AD模型的情況作一綜述，為研究AD提供建立動(dòng)物模型的適當(dāng)方法。

1 蛋白抗原誘導(dǎo)模型

1.1 卵清蛋白OVA 是雞蛋的主要成分，能夠通過(guò)吸入途徑建立動(dòng)物過(guò)敏性哮喘和過(guò)敏性鼻炎模型，如果經(jīng)皮膚致敏，則能誘導(dǎo)AD模型。胡佳等[1]利用6周齡雌性BALB/c小鼠，腹部OVA致敏1周，局部呈現(xiàn)表皮增生、細(xì)胞浸潤(rùn)等炎性反應(yīng)改變，血清總IgE水平明顯升高。同時(shí)，IL-4和IL-5基因表達(dá)顯著增加，IFN-γmRNA水平未見(jiàn)明顯變化，呈現(xiàn)明顯的Th2型免疫偏移狀態(tài)，符合急性期AD的免疫學(xué)特征[2]。

值得一提的是，非皮膚致敏也可能得到良好的AD模型。例如，Yoo等[3]經(jīng)腹腔注射OVA，同時(shí)與局部OVA致敏結(jié)合，可以構(gòu)建出理想的AD炎性反應(yīng)模型：小鼠致敏1 d后出現(xiàn)紅斑、皮膚增厚、變硬等變化，7 d后出現(xiàn)腋窩和腹股溝淋巴結(jié)腫大，組織病理學(xué)檢查顯示皮膚過(guò)度角質(zhì)化、單核細(xì)胞浸潤(rùn)、真皮層增厚、局部性糜爛等，其AD樣癥狀及指標(biāo)均比單一局部致敏有顯著差異。

1.2 塵螨 是常見(jiàn)的致敏原，通過(guò)呼吸道途徑致敏可加重或誘發(fā)哮喘。Oshio等[4]在探討他克莫司對(duì)AD的作用機(jī)制時(shí)，選擇了8周齡雌性Nc/Nga小鼠，用塵螨經(jīng)背部和耳后誘導(dǎo)7周后小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的皮膚炎性反應(yīng)，表現(xiàn)出脫屑、糜爛、出血等癥狀，病理學(xué)檢查可見(jiàn)肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，AD模型建立成功。

2 半抗原誘導(dǎo)模型

1-氟-2,4-二硝基苯(1-fluorine-2,4-dinitrobenzene, DNFB)、1-氯- 2,4-二硝基苯(1- chloro- 2,4- dinitrobenzene, DNCB)等化學(xué)物質(zhì)屬半抗原，能與皮膚組織蛋白結(jié)合成為完全抗原，進(jìn)而激活T淋巴細(xì)胞使之成為致敏細(xì)胞，當(dāng)半抗原再次進(jìn)入機(jī)體，與致敏淋巴細(xì)胞接觸就會(huì)引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)[5]。莫俊鑾等[6]用DNCB經(jīng)背部和耳部致敏雌性BALB/c小鼠，觀察到小鼠皮損處表皮明顯增厚，棘層和顆粒層肥厚、角化過(guò)度，毛囊結(jié)構(gòu)少見(jiàn)。同時(shí)真皮層可見(jiàn)大量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞為主，皮損部血管擴(kuò)張充血、毛囊結(jié)構(gòu)增多，血清IgE水平顯著升高，其癥狀與人類(lèi)AD樣癥狀基本相符。但是，該方法得到的模型癥狀較輕，特征性稍差[6]。Choi等[7]用DNCB同樣能夠誘導(dǎo)建立AD模型，他們選擇了6周齡雌性NC/Nga小鼠作為受試對(duì)象，DNCB致敏64 d后小鼠呈AD樣癥狀，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IL-10下降，總IgE升高，AD特征較前者明顯。由于BALB/c小鼠、NC/Nga小鼠價(jià)格偏高，因此，有研究人員嘗試采用更為廉價(jià)的昆明小鼠建立AD模型。朱金土等[8]用DNFB誘導(dǎo)昆明小鼠，皮膚亦可出現(xiàn)紅斑、灼熱瘙癢、水泡等癥狀，滲出明顯，部分可見(jiàn)糜爛，上覆黃色痂皮，表現(xiàn)出AD急性期或者皮損復(fù)發(fā)加重期的狀態(tài)，組織病理學(xué)檢測(cè)證實(shí)，表皮細(xì)胞間明顯水腫、真皮乳頭水腫、血管擴(kuò)張充血、炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，符合AD的基本特征。

此外，其他一些化學(xué)物質(zhì)也能作為半抗原誘導(dǎo)建立AD模型。例如，Yano等[9]將PiCl涂在NC/Nga小鼠背部和耳部，2周后小鼠開(kāi)始出現(xiàn)AD樣病變，耳部、背部皮膚出現(xiàn)角質(zhì)化，ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IgE、IgG1、IL-4及IFN-γ含量明顯升高。Hatano等[10]通過(guò)局部涂抹惡唑酮成功誘導(dǎo)裸鼠發(fā)生AD，可見(jiàn)表皮增厚，同時(shí)伴有肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)。

3 自發(fā)性模型

NC/Nga小鼠是1957年日本名古屋大學(xué)近藤恭司等利用Nishiki寵物鼠培育成功的小鼠，可自發(fā)形成AD樣皮損[11]。為了得到穩(wěn)定的AD模型，增加建模成功率，研究人員會(huì)應(yīng)用一些特異性抗原、半抗原進(jìn)行誘導(dǎo)，輔助模型的建立，模型鼠會(huì)表現(xiàn)出角化過(guò)度、棘層增厚，并伴有淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等特征，與人類(lèi)AD癥狀非常接近。因此，NC/Nga小鼠被公認(rèn)為最適宜研究AD的動(dòng)物模型之一。1974年，東京中央實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所研究人員采用雄性Ds-Nh(Nh/Nh)×雌性DS(+/+)產(chǎn)生雜合子F1(Nh/+)，16周時(shí)觀察到該小鼠皮膚出現(xiàn)明顯角質(zhì)化、棘層肥厚、大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，伴IgE水平升高、TSLP基因表達(dá)增加，符合AD的基本特征。進(jìn)一步研究顯示，這種可在自然條件下自發(fā)形成AD樣癥狀的DS無(wú)毛型鼠(DS-NH鼠)主要與金黃色葡萄球菌的作用有關(guān)[12]。鱗尾鼠是一種自然突變小鼠，尾部皮膚出現(xiàn)鱗狀改變，該小鼠絲聚合蛋白多肽基因表達(dá)異常，不能合成角質(zhì)層維護(hù)皮膚屏障功能[13]。Nakajima等[14]發(fā)現(xiàn)，鱗尾鼠常規(guī)飼養(yǎng)至第28周，可自發(fā)形成AD樣病變，血清IgE水平進(jìn)行性升高，CD4+T淋巴細(xì)胞大量浸潤(rùn)，Th2型細(xì)胞因子表達(dá)增加，至第32周時(shí)皮損處癥狀更明顯。在另一項(xiàng)研究中，Sasaki等[15]通過(guò)改變鱗尾鼠層狀顆粒分泌系統(tǒng)的Tmem79基因，破壞角質(zhì)層屏障，同樣能導(dǎo)致AD樣癥狀自發(fā)形成。

4 基因修飾模型

轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠是20世紀(jì)中期發(fā)展起來(lái)的新型生物技術(shù)，指遺傳物質(zhì)中攜帶特定的外源基因并在生長(zhǎng)過(guò)程中可以特異性表達(dá)，或者使機(jī)體特定的基因失活或缺失，從而建立的特殊小鼠。由于炎性反應(yīng)因子在AD發(fā)病過(guò)程中的重要作用，研究人員由此入手，通過(guò)調(diào)控特定基因表達(dá)，成功建立了一系列基因修飾的AD模型。例如，Chan等[16]發(fā)現(xiàn)，IL-4過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，可自發(fā)形成人類(lèi)AD樣特點(diǎn)，尤以耳部、頸部最為明顯，其余特征包括瘙癢、干燥癥、結(jié)膜炎、金黃色葡萄球菌感染等，同時(shí)伴有淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，血清IgE水平明顯升高。Oh等[17]利用IL-13轉(zhuǎn)基因小鼠研究發(fā)現(xiàn)，如果用藥物抑制IL-13的表達(dá)，則小鼠AD樣皮膚病變明顯好轉(zhuǎn)，從另一個(gè)角度說(shuō)明AD中IL-13可以加重AD樣病變。此外，在對(duì)AD潛在的致命性全身感染的研究中發(fā)現(xiàn)[18]，IL-10(-/-)基因敲除小鼠可表現(xiàn)出嚴(yán)重的AD癥狀，反向證明IL-10在對(duì)抗AD病變中發(fā)揮重要作用。與上述研究略有不同的是，Dillon等[19]研究顯示，過(guò)度表達(dá)IL-31的轉(zhuǎn)基因小鼠能夠引起嚴(yán)重的AD樣皮膚病變，出現(xiàn)表皮角質(zhì)化、棘層肥厚、炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，但血清IgE水平幾乎不變，表明IL-31主要造成皮膚炎性反應(yīng)。

除了炎性反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子外，還有多種成分能夠參與AD的發(fā)生發(fā)展，其中一個(gè)重要的影響因素就是胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)。TSLP是AD和其他過(guò)敏性疾病的重要產(chǎn)物，Yoo等[20]用四環(huán)素誘導(dǎo)建立TSLP轉(zhuǎn)基因小鼠，其皮膚特異性表達(dá)TSLP，并出現(xiàn)明顯AD樣表現(xiàn)，真皮炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，Th2細(xì)胞顯著增加，血清IgE顯著上升，與人類(lèi)AD樣癥狀類(lèi)似。半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶S(CTSS)能夠引起瘙癢等皮膚癥狀，Kim等[21]發(fā)現(xiàn)，CRSS過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠可自發(fā)形成慢性AD，過(guò)度表達(dá)的CTSS引發(fā)蛋白酶激活受體-2表達(dá)，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分化，從而使Th1型細(xì)胞因子水平顯著增高，參與慢性AD的病程進(jìn)展。由于表皮角質(zhì)層的形成依賴脂質(zhì)平衡，打破脂質(zhì)平衡即可獲得皮膚AD樣病變，據(jù)此Nagelkerken等[22]成功研發(fā)出載脂蛋白C1轉(zhuǎn)基因小鼠(APOC1Tg)，該小鼠模型除了典型的高脂血癥(全身性高游離脂肪酸、三酰甘油和膽固醇等)，還可自發(fā)形成表皮增生、過(guò)度角質(zhì)化、脫屑、皮膚苔蘚樣，以及炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)等AD樣特征。在研究基因修飾的AD小鼠模型時(shí)，人們有可能發(fā)現(xiàn)一些新的致病機(jī)制，為AD研究提供新思路。例如，天冬氨酸蛋白酶組織蛋白酶E(Cat E)敲除小鼠在常規(guī)條件下飼養(yǎng)可自發(fā)形成AD，T淋巴細(xì)胞向Th2型分化偏移，伴有IL-4、IL-5和IgE含量顯著增加，提示Cat E缺乏可能在AD發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。

綜上所述，不同方式或不同種屬建立的小鼠AD模型各有特點(diǎn)。作為科學(xué)研究中最常用的小鼠之一，BALB/c 小鼠起源于小家鼠，由親兄弟姐妹近交遺傳繁殖，具有個(gè)體差異小、遺傳基因純、整體素質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)；昆明小鼠是中國(guó)最常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)用小白鼠品種，來(lái)源廣泛，可適應(yīng)多種實(shí)驗(yàn)環(huán)境，價(jià)格便宜；這兩種小鼠建立的誘導(dǎo)型AD模型對(duì)環(huán)境要求低，易在普通條件下實(shí)現(xiàn)，但模型特征不夠明顯，IgE水平升高程度較其他模型低。自發(fā)性小鼠建立的模型陽(yáng)性率高、重復(fù)性好、特征性強(qiáng)，但是對(duì)飼養(yǎng)條件要求高、價(jià)格昂貴?；蛐揎椥∈竽Ｐ蛯Ｒ恍愿?、目的性強(qiáng)，可以針對(duì)性研究AD，但培育繁瑣、技術(shù)要求高。隨著科技的進(jìn)步和發(fā)展，相信研究人員能夠開(kāi)發(fā)出更優(yōu)越的AD模型，滿足不同研究的需求。

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(2014-07-19收稿 2014-10-03修回)

(責(zé)任編輯 尤偉杰)

本刊“臨床病例討論”欄目征稿通知

為了貫徹“面向部隊(duì)，服務(wù)基層”的辦刊宗旨，加強(qiáng)不同層次醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)踐交流，幫助基層醫(yī)師學(xué)習(xí)和了解先進(jìn)教學(xué)醫(yī)院和知名專家對(duì)疾病的臨床診治思路,提高基層衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的臨床業(yè)務(wù)水平。本刊于2012年開(kāi)辟“臨床病例討論”欄目，報(bào)道武警部隊(duì)各級(jí)醫(yī)院及重點(diǎn)學(xué)科臨床工作中遇到的疑難和典型病例，以及基層衛(wèi)生隊(duì)經(jīng)過(guò)多學(xué)科專家遠(yuǎn)程會(huì)診得以成功治療的典型病例。

1.病例選擇： (1)選擇的病例要具有代表性且不涉及醫(yī)院敏感問(wèn)題，優(yōu)先錄取多學(xué)科交叉病例；(2) 診斷明確，但病情危重、治療棘手的病例；(3) 罕見(jiàn)病例。以上病例須最終獲得明確診斷或成功治療，臨床資料應(yīng)齊全，能提供實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)和病理確診依據(jù)。

2.寫(xiě)作格式： 正文分“病例介紹”和“臨床討論”兩部分。病例介紹：交代清楚患者主訴、病史(包括既往史)，實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)及病理學(xué)檢查結(jié)果、臨床診斷、治療方案、治療結(jié)果等(需要提供影像學(xué)檢查的圖片)。臨床討論：為主體內(nèi)容，首先提出目前病例診斷治療的進(jìn)展和需要解決的問(wèn)題等討論要點(diǎn)；之后由參加會(huì)診的知名專家點(diǎn)評(píng)，寫(xiě)清診斷和治療思路、鑒別診斷要點(diǎn)、治療上應(yīng)注意的問(wèn)題等，為今后的臨床工作提供借鑒和參考。若為罕見(jiàn)病，則介紹目前國(guó)內(nèi)外的最新進(jìn)展。會(huì)診專家需署名(如無(wú)外請(qǐng)專家，也可署本院科主任名)，格式如：張某某醫(yī)師(肝膽科)。具體行文格式參考本欄目已發(fā)表的論文格式。全文字?jǐn)?shù)3800或6500左右。

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武警醫(yī)學(xué)編輯部

2015年1月

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