響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖條件

李 洋，宗希明，袁 寰，史偉國，李 野，王麗紅，杜 娟，周 彤

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江佳木斯154002)

黑木耳(Auricularia auricular)屬于擔(dān)子菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬，是一種藥食同源的真菌類物質(zhì)［1］。黑木耳含有多種成分，多糖為其重要活性成分，研究表明，黑木耳多糖具有抗衰老［2］、抗凝血［3－4］、降血糖［5］、降血脂［6］、抗腫瘤［7］、增加免疫等功能［8－9］。食用菌深層發(fā)酵技術(shù)其特點為生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量大、質(zhì)量高、經(jīng)濟效益突出等，在液體菌種制備、醫(yī)藥及保健、食品行業(yè)以及抑菌防腐等領(lǐng)域具有廣泛用途［10］。筆者將水果皮、中藥材等考察因素加入到培養(yǎng)基中進行試驗，并應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖的條件，應(yīng)用苯酚－硫酸法對黑木耳菌液體發(fā)酵的胞外多糖含量進行測量，對液體發(fā)酵黑木耳菌胞外多糖具有重要意義。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌種。供試黑木耳菌由佳木斯大學(xué)生命科學(xué)院提供。

1．1．2 培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯20%，瓊脂3%，葡萄糖2%，pH自然。液體發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯汁20%，KH2PO40．30%，MgSO4·7H2O 0．15%，VB10．01%，碳源 3%，氮源0．15%，水果皮4%，中藥材10%，pH自然。

1．2 方法

1．2．1 PDA培養(yǎng)。從斜面培養(yǎng)基中取出菌絲塊接種于PDA平板培養(yǎng)基中部，放置到26℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察菌絲體的生長狀況，及時淘汰感染雜菌的培養(yǎng)基。

1．2．2 液體發(fā)酵單因素試驗。根據(jù)單因素試驗對液體培養(yǎng)基進行配制并編號。無菌操作臺上取出1 cm2的菌絲塊接種于已經(jīng)標(biāo)號的無菌液體培養(yǎng)液中，于26℃恒溫培養(yǎng)。分別考察碳源、氮源、水果皮、中藥材對黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的影響。

1．2．3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量為考察指標(biāo)，采用響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖條件碳源、氮源、水果皮、中藥材，從而獲得黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖的最佳條件。采用分析軟件Design-Expert，設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面分析。獲得回歸方程，根據(jù)多元二次回歸方程，以胞外多糖為響應(yīng)值，對各因素水平進行優(yōu)化，得到黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖的最佳發(fā)酵條件。試驗因素水平見表1。

表1 黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖條件響應(yīng)面法試驗因素水平設(shè)計

1．2．4 胞外多糖含量測定。將培養(yǎng)7 d后的黑木耳菌液體發(fā)酵培養(yǎng)液離心，取澄清培養(yǎng)液5 ml，加入15 ml無水乙醇，放置在4℃冰箱12 h，待沉淀析出后進行離心，得沉淀粗多糖。通過苯酚－硫酸法測得多糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2．1 線性關(guān)系的考察 試驗得出，無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為 y=38．314x+0．000 4，R2為 0．997 5。由此可見，無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

2．2 回歸方程的建立 以碳源、氮源、水果皮、中藥材為自變量，以黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量為響應(yīng)值進行響應(yīng)面試驗，試驗結(jié)果見表2。將所得試驗數(shù)據(jù)使用Design-Ex-pert軟件分析，得到黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖的二元多次回歸方程為:Y=0．013+0．003 623A+0．000 739 2B+0．000 285C+0．000 688 3D －0．000 332 5AB －0．000 827 5AC+0．000 382 5AD +0．000 075BC － 0．000 765BD－0．000 102 5CD+0．002 13A2+0．001 518B2+0．001 167C2+0．001 597D2。

2．3 回歸分析 通過回歸模型方差分析可以看出，模型的P值為＜0．000 1，說明該模型回歸顯著，試驗數(shù)據(jù)得到的F值說明模型的擬合性較好，模型的校正決定系數(shù)R2=0．951 9，可以用于黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖的試驗設(shè)計。

根據(jù)回歸方程，獲得碳源、氮源、水果皮與中藥材響應(yīng)面曲面圖。由圖1可見，其中A(碳源)對黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的影響最為明顯，表現(xiàn)為響應(yīng)面曲線較陡，B(氮源)、C(水果皮)和D(中藥材)對黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的影響相對較弱，表現(xiàn)為曲線較平緩。AB(碳源與氮源的交互作用)與AC(碳源與水果皮的交互作用)對黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的影響較大，BD(氮源與中藥材的交互作用)與CD(水果皮與中藥材的交互作用)對黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的影響一般，AD(碳源與中藥材的交互作用)、BC(氮源與水果皮的交互作用)對黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的影響較小。

通過黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的回歸方程，得出黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖的最佳條件為:碳源可溶性淀粉3%、氮源胰蛋白胨0．15%、水果皮莎白瓜皮4%、中藥材紅景天10%。在此條件下胞外多糖的最大預(yù)測值為0．025 575 7 g/ml。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

2．4 驗證試驗 采用響應(yīng)面獲得的最優(yōu)發(fā)酵條件進行黑木耳菌液體發(fā)酵試驗，該條件下實際測得的多糖含量為0．024 51 g/ml，與預(yù)測值相差＜5%?？梢?，回歸方程的預(yù)測值與試驗值之間具有較好的擬合度。故采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖條件準(zhǔn)確可靠，具有實際應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法，可以優(yōu)化黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖條件，也可預(yù)測響應(yīng)值，從而獲得最優(yōu)值。該試驗采用響應(yīng)面優(yōu)化方法，確定黑木耳菌發(fā)酵胞外多糖的最佳發(fā)酵條件為碳源可溶性淀粉3%、氮源胰蛋白胨0．15%、水果皮莎白瓜皮4%、中藥材紅景天10%，在此條件下的黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量為0．024 51 g/ml。

［1］曹雷，陳紅君．黑木耳多糖的研究進展［J］．長春師范學(xué)院學(xué)報，2009，28(2):1 －3，15 －16．

［2］ZHANG H，WANG Z，ZHANGZ，et al．Purified Auricularia auricularjudae polysaccharide(AAP I-a)prevents oxidative stress in an ageing mouse model［J］．Carbohydrate polymers，2011，84(1):638 －648．

［3］王辰龍，張子齊，王曼，等．黑木耳多糖的提取分離及體外抗凝血作用研究［J］．食品工業(yè)科技，2013，34(9):238 －241．

［4］李德海，史錦碩，周聰，等．黑木耳多糖的制備及其抗凝血功能的研究［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(2):283 －285．

［5］韓春然，馬永強，唐娟．黑木耳多糖的提取及降血糖作用［J］．食品與生物技術(shù)學(xué)報，2006，25(5):111 －114．

［6］楊春瑜，姜啟興，夏文水，等．黑木耳超微粉多糖相對分子質(zhì)量分布及降血脂功能研究［J］．中國食品學(xué)報，2008，8(6):23 －32．

［7］BAOX，DUAN J，F(xiàn)ANGX，et al．Chemical modifications of the(1→3)-α-D-glucan from spores of Ganoderma lucidum and investigation of theird physicochemical properties and immunological ctivity［J］．Rbohydrate research，2011，336:127 －140．

［8］WUQ，TANZ，LIUH，et al．Chemical characterization of Auricularia auricula polysaccharides and its pharmacological effect on heart antioxidant enzyme activities and left ventricular function in aged mice［J］．Int J Biol Macromol，2010，46:284 －288．

［9］趙超，曾峰，黃一帆，等．Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)化黑木耳菌質(zhì)多糖提取工藝［J］．生物技術(shù)通報，2013(6):188 －193．

［10］郭尚，王慧娟．食用菌深層發(fā)酵技術(shù)及其應(yīng)用［J］．山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(8):885 －888．