兔源莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定

徐為中，王 芳，胡 波，范志宇，魏后軍，宋艷華，薛家賓，仇汝龍，劉 星

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210014)

多殺性巴氏桿菌屬于革蘭氏陰性菌，是人類(lèi)和多種動(dòng)物病原菌之一，可以引起多種畜禽巴氏桿菌病，如奶牛和水牛出血性敗血癥、綿羊和山羊出血性肺炎、鳥(niǎo)類(lèi)禽霍亂、豬萎縮性鼻炎、兔傳染性鼻炎及人類(lèi)伴侶動(dòng)物貓狗咬抓相關(guān)的疾病［1-2］。家兔普遍存在巴氏桿菌病，臨床主要表現(xiàn)為嚴(yán)重呼吸道病變、中耳炎、敗血癥、局部膿腫等［3］。此病是引起斷奶到成年兔死亡的主要傳染病。

多殺性巴氏桿菌根據(jù)莢膜抗原分為A、B、D、E和F 5個(gè)血清型［4］。兔的巴氏桿菌病大多由A型引起，少數(shù)由D型引起，由F型引起兔巴氏桿菌病也有報(bào)道［5-9］。筆者從近幾年周邊地區(qū)(安徽、上海、江蘇)送檢急性死亡家兔肺臟和肝臟中分離出5株細(xì)菌，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、涂片鏡檢、生化鑒定，并對(duì)多殺性巴氏桿菌的ATP合成酶基因進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)多殺性巴氏桿菌A、B、D、E和F莢膜血清型特異性基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR分型［10］，最終確定分離的5株細(xì)菌均為莢膜血清A性多殺性巴氏桿菌，同時(shí)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，可為在臨床上該病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 病死兔來(lái)源 病死兔來(lái)源于安徽、上海和江蘇，送檢急性死亡家兔，采集肝和肺組織。

1．2 試驗(yàn)動(dòng)物 20 g左右的昆明小鼠12只，由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1．3 酶及其他試劑 Taq DNA聚合酶、DL2000核酸Marker、DNA凝膠回收試劑盒，均購(gòu)自大連寶生物(TaKaRa)有限公司;柱式細(xì)菌DNAout試劑盒，購(gòu)自天恩澤公司;生化鑒定管及藥敏試紙購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司;馬丁肉湯培養(yǎng)基和革蘭氏染色液試劑盒，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1．4 細(xì)菌的分離培養(yǎng)和形態(tài)觀察 剖檢病死兔，采集典型病理變化的肺、肝組織劃線接種于馬丁瓊脂平皿，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，并對(duì)單菌落涂片、染色和鏡檢，挑取單個(gè)典型菌落接種于血平皿，置于37℃條件下培養(yǎng)18～24 h觀察其溶血性。

1．5 生化試驗(yàn) 將分離到的細(xì)菌接種于馬丁肉湯中，37℃條件下培養(yǎng)12 h，按照常規(guī)方法進(jìn)行麥芽糖、甘露醇、半乳糖、鼠李糖、菊糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、山梨醇、水楊酸、乳糖、蔗糖、脲酶試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)生化鑒定。

1．6 PCR鑒定及分型 將分離菌株，接種于馬丁肉湯中37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，所得的菌液用來(lái)提取模板DNA，DNA的提取按照柱式細(xì)菌DNAout試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

PCR鑒定參考實(shí)驗(yàn)室根據(jù)對(duì)多殺性巴氏桿菌ATP合成酶atpB建立的PCR擴(kuò)增方法，引物由上海英濰捷基生物有限公司合成:P1:5′-TTCTGTTCGCTTCATCCT-3′，P2:5′-CTGTTCTGTTCGCTTCATC-3′，預(yù)期擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物片段大小為 1 141 bp［11］。

PCR 反應(yīng)體系:模板 DNA4．0 μl，Taq聚合酶0．4 μl，10 ×Taq Buffer 2．5 μl，P1、P2 引物(20 umol/L)各1．0 μl，dNTPs(2．5 mmol/L)2．0 μl，MgCl2(25 mmol/L)2．5 μl，H2O 11．6 μl。PCR反應(yīng)條件:94℃變性4 min;94℃ 35 s，54℃ 35 s，72℃ 60 s，35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min，將PCR產(chǎn)物于4℃條件下保存。

PCR產(chǎn)物的凝膠電泳鑒定:PCR產(chǎn)物經(jīng)1．2%的瓊脂糖凝膠電泳，回收純化目的片段后送至上海英濰捷基公司測(cè)序。

分型多重PCR鑒定:參考Townsend報(bào)道根據(jù)多殺性巴氏桿菌 A、B、C、D、E莢膜血清型特異性基因 hyaD-hyaC、bcbD、dcb、ecbJ、fcbD 設(shè)計(jì)引物 PmA、PmB、PmD、PmE、PmF 上述引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成［10］。引物序列及擴(kuò)增的大小見(jiàn)表1。

表1 多殺性巴氏桿菌基因擴(kuò)增用引物

多殺性巴氏桿菌分型多重PCR采用與上述PCR鑒定多殺性巴氏桿菌ATP合成酶atpB相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，將PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1．7 小鼠致病性試驗(yàn) 將分離的菌株在含血清馬丁肉湯中培養(yǎng)過(guò)夜，用生理鹽水連續(xù)10倍稀釋計(jì)數(shù)，將昆明小鼠隨機(jī)分為5組，每組2只，腹腔注射0．5 ml稀釋過(guò)的菌液，內(nèi)含8個(gè)細(xì)菌，對(duì)照組注射生理鹽水0．5 ml。

1．8 藥敏試驗(yàn) 無(wú)菌吸取0．2 ml馬丁肉湯細(xì)菌培養(yǎng)液加入到馬丁瓊脂培養(yǎng)皿內(nèi)，用無(wú)菌玻璃棒均勻涂開(kāi)，待培養(yǎng)基表面液體稍干后，將藥敏紙片均勻貼于瓊脂表面，每塊平皿貼4張藥敏紙片，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，測(cè)量藥敏紙片的抑菌直徑。按照不同抗菌藥標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比抑菌圈直徑大小，結(jié)果評(píng)定為高敏、中敏和不敏感。

2 結(jié)果與分析

2．1 形態(tài)及培養(yǎng)特性 在馬丁瓊脂平板培養(yǎng)18～24 h后，呈現(xiàn)圓形、邊緣整齊、光滑、半透明的灰白色菌落，鮮血瓊脂平板上培養(yǎng)不溶血。細(xì)菌涂片染色為兩極濃染的革蘭氏陰性球桿菌。

2．2 生化試驗(yàn)結(jié)果 5株細(xì)菌接種生化管，37℃培養(yǎng)24 h后，不能發(fā)酵鼠李糖、水楊酸、菊糖乳糖;能發(fā)酵麥芽糖、甘露醇、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖和蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;脲酶試驗(yàn)結(jié)果為陰性;MR試驗(yàn)結(jié)果為陰性;VP試驗(yàn)結(jié)果為陰性;接觸酶試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性;硫化氫試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性;吲哚試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。5株分離細(xì)菌的生化特性與多殺性巴氏桿菌相符。

2．3 小白鼠致病性試驗(yàn) 活菌注射的試驗(yàn)組小鼠24 h內(nèi)全部發(fā)病死亡，小白鼠剖檢后可見(jiàn)肺出血、脾腫大淤血、肝臟有散在白色壞死灶，取死亡小鼠肝臟接種于添加加血清血紅素馬丁瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)12～20 h，長(zhǎng)出半透明的小菌落。挑單菌落涂片染色鏡檢，可見(jiàn)兩極濃染的革蘭氏陰性球桿菌，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康存活。

2．4 藥物敏感性試驗(yàn) 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌對(duì)環(huán)丙沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、恩諾沙星和磺胺六甲氧嘧啶敏感，對(duì)強(qiáng)力霉素、四環(huán)素中敏，對(duì)痢特靈、慶大霉素和卡那霉素耐藥。

2．5 PCR鑒定及分型結(jié)果

2．5．1 多殺性巴氏桿菌ATP合成酶atpB的PCR鑒定。對(duì)分離的5個(gè)菌株提取DNA，進(jìn)行多殺性巴氏桿菌ATP合成酶atpB PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1．2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在1 141 bp處均出現(xiàn)特異性目的條帶(圖1)，大小與預(yù)期片段一致，將目的條帶回收測(cè)序的結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上公布的多殺性巴氏桿菌ATP合成酶atpB序列進(jìn)行Blast比對(duì)，同源性達(dá)到99．7%，確定分離的5菌株均為多殺性巴氏桿菌。

2．5．2 多重PCR莢膜的血清分型。對(duì)從分離的5個(gè)菌株提取的DNA經(jīng)多殺性巴氏桿菌分型多重PCR鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳，在1 044 bp處有1個(gè)特異性片段(圖2)，據(jù)此初步鑒定分離的5株細(xì)菌均為莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌。

3 討論

家兔多殺性巴氏桿菌病是引起斷奶到成年兔死亡的最主要傳染病，家兔的巴氏桿菌病多數(shù)為A型引起，少數(shù)為D型引起，然而不同國(guó)家流行的菌株有所不同，在我國(guó)兔群中流行的主要血清型是A型［12］，而關(guān)于家兔巴氏桿菌莢膜血清型F型的報(bào)道非常少［9］。不同血清型多殺性巴氏桿菌之間沒(méi)有或僅有較少的交叉保護(hù)性［13］，因此必須對(duì)本地流行的多殺性巴氏桿菌血清型加以監(jiān)測(cè)，根據(jù)當(dāng)?shù)乇O(jiān)測(cè)結(jié)果才能更好地指導(dǎo)該病的防治。筆者對(duì)送檢急性死亡兔進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)與鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離到的5株多殺性巴氏桿菌全部為A型，我國(guó)家兔巴氏桿菌商品疫苗也都是A型菌株制備的滅活疫苗，因此疫苗的免疫預(yù)防該病是首選方案。

在多殺性巴氏桿菌分離鑒定中采用了生化試驗(yàn)與PCR方法相結(jié)合，二者的符合率達(dá)到100%，二者結(jié)合使用，可以對(duì)分離的多殺性巴氏桿菌進(jìn)行快速鑒定分型，提高診斷效率和準(zhǔn)確性，在臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查具有較好的借鑒參考價(jià)值。

在此次分離巴氏桿菌動(dòng)物致病性試驗(yàn)中，8個(gè)細(xì)菌注射劑量試驗(yàn)組小鼠24 h內(nèi)全部發(fā)病死亡，說(shuō)明分離的菌株對(duì)動(dòng)物具有強(qiáng)致病性，應(yīng)當(dāng)重視對(duì)A型家兔多殺性巴氏桿菌病的預(yù)防，可以減少家兔的死亡，提高家兔養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離的5株巴氏桿菌對(duì)環(huán)丙沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考和磺胺六甲氧嘧啶等藥物敏感素，臨床上可首選這些藥物進(jìn)行治療。

［1］HUNT M L，ADLER B，TOWNSEND K M，et al．The molecular biology of Pasteurella multocida［J］．Vet Microbiol，2000，72:3-25．

［2］SHIVACHANDRA S B，VISWASK N，KUMAR A A，et al．A review of haemorrhagic septicaemiain cattle and buffalo［J］．Anim Health Res Rev，2011，12:67-82．

［3］CONFER A W，NUTT SH，DABOSM，et al．Antibody responses of cattle to outer membrane proteins of Pasteurella multocida A:3［J］．Am J Vet Res，1996，10:1453-1457．

［4］KUMAR A A，SHIVACHANDRA S B，BISWAS A，et al．Prevalent serotypes of Pasteurella multocida isolated from different animal and avianspecies in India［J］．Vet Res Commun，2004，28:657-667．

［5］KAWAMOTO E，SAWADA T，SUZUKI K，et al．Serotypes of Pasteurella multocida isolates from rabbits and their environment in Japan［J］．Jpn J Vet Sci，1990，52(6):1277-1279．

［6］VANDYCK S，DEHERDT P，HAESEBROUCK F，et al．Pasteurellosis in rabbits:A review［J］．Vlaams Diergen Tijds，1995，64:152-156．

［7］DABO SM，CONFER A W，MONTELONGO M，et al．Characterization of rabbit Pasteurella multocida isolates by use of whole-cell，outer-membrane，and polymerase chain reaction typing［J］．Lab Anim Sci，1999，49(5):551-559．

［8］JAGLICZ，KUCEROVA Z，NEDBALCOVA K，et al．Identifiction of Pasteurella multocida Seogroup F isolates in rabbits［J］．J Vet Med B Infect Vet Public Health，2004，51(10):467-469．

［9］張娜，李書(shū)光，陳金龍，等．兔F型多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及其致病性［J］．中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2012，42(7):685-689．

［10］TOWNSENDK M，BOYCE JD，CHUNGJY，et al．Geneticorganization of Pasteurella multocida cap and development of a multiplex capsular PCR typing system［J］．J Clin Microbiol，2001，39(3):924-929．

［11］范志宇，魏后軍，胡波，等．兔多殺性巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌復(fù)合PCR方法的建立及臨床應(yīng)用［J］．江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，31(2):376-381．

［12］陸承平．獸醫(yī)微生物學(xué)［M］．3版．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001．

［13］吳范庚．我國(guó)多殺性巴氏桿菌血清學(xué)鑒定及交互免疫試驗(yàn)［J］．中國(guó)獸醫(yī)雜志，1997，23(8):14-15．