紅肉桃花色素苷合成與積累分子機制研究進展

焦 云，舒巧云，劉珠琴，章建紅

(寧波市農業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，浙江寧波315040)

桃樹［Prunus persica(L．)Batsch］原產于中國，是我國第三大落葉果樹，已有4 000年的栽培歷史［1］。我國最早記載桃樹品種是在公元前10世紀的《爾雅·釋草篇》:“旄，冬桃”［2］。中國、意大利、西班牙、美國、希臘是世界五大桃生產國［3］。目前在生產上，桃主要有白肉和黃肉2種類型，而異肉色品種如紅肉品種栽培較少。隨著人們對果品類型需求的多樣化，紅肉桃逐漸受到人們的關注。紅色果實色澤來源主要是花色素苷，它是花色素與各種單糖通過糖苷鍵結合形成糖基化衍生物的總稱，是一類重要的類黃酮化合物［4］。植物果實中同時存在糖代謝和類黃酮代謝，二者在很大程度上決定果實的內部和外部品質。筆者綜述了紅肉桃花色素苷積累規(guī)律及其生物合成途徑相關調控基因分子調控機制的研究進展。

1 紅肉桃花色素苷積累規(guī)律與遺傳定位

近年來，國內外學者對紅肉桃的相關研究主要集中在果實發(fā)育過程中糖和花色素苷含量變化等方面［5-7］。許建蘭等［8-9］以紅肉、黃肉、白肉等3種果肉顏色的桃為試材，分析了紅肉桃、黃肉桃及白肉桃盛花后35 d至果實成熟期間相關色素含量的變化，結果發(fā)現(xiàn)在接近果實成熟時，黃肉桃中類胡蘿卜素起主要作用，紅肉桃中花色素苷起決定作用。沈志軍等［10］以75份桃資源為試材，測定并比較分析果皮、果肉和全果的總酚、花色素苷、三價鐵還原能力(FRAP)、相對抗自由基能力(RAC)以及色澤參數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)紅肉桃果實抗氧化組分和抗氧化能力顯著高于白肉和黃肉桃，從抗氧化的角度來說紅肉桃資源具有較高的開發(fā)利用價值，桃果實總酚對抗氧化能力的貢獻高于花色素苷，篩選出北京一線紅、紅桃等抗氧化能力高的紅肉桃品種。Cevallos-Casals等［11］對8個紅肉桃與14個紅肉李品系的主要抗氧化組分(總酚和花色素苷)以及抗氧化能力進行了鑒定評價，發(fā)現(xiàn)紅肉桃品種總酚含量為100～449 mg CGA/100 g，花色素苷含量為6～37 mg/100 g，總酚含量與其在藍莓中的評價結果(292～672 mg CGA/100 g)具有可比性。

Chaparro等［12］報道稱 Harrow Blood(晚熟)在盛花期后45～50 d果肉中花色素苷開始積累，這一紅色在早期顯現(xiàn)的性狀不同于野生類型在果實發(fā)育后期花色素苷積累，進而建議以“花色素苷在果肉中的早期積累”作為區(qū)別紅肉與非紅肉的標準。Harrow Blood的紅肉性狀與葉背的紅色中脈性狀連鎖。Werner等［13］利用數(shù)個以Harrow Blood為直接或者間接親本配制的雜交組合后代，發(fā)現(xiàn)紅肉性狀是由一個隱性單基因bf控制，還發(fā)現(xiàn)紅肉性狀與較弱的樹勢相連鎖。同時指出，在美國農業(yè)部桃種質Byron資源圃中，Red English和Indian Blood表現(xiàn)出與Harrow Blood類似的性狀，但是Indian Cling表現(xiàn)為在果實發(fā)育晚期花色素苷迅速積累，這種性狀不與較弱的樹勢連鎖，也不與紅色中脈性狀連鎖，呈顯性遺傳DBF(Dominant blood-flesh)。

在后續(xù)的研究中，Gillen等［14］利用RAPD、RFLP等標記，將呈現(xiàn)隱性遺傳(bf)的桃紅肉性狀定位于第4連鎖群的頂部。另外，Shen等［15］利用102個SSR標記將呈顯性遺傳(DBF)的桃紅肉性狀定位于第5連鎖群的頂部(圖1)。呈隱性遺傳的紅肉基因型桃在法國已有300多年的栽培歷史，到現(xiàn)在仍然存在少量種植，主要用于制作水果蛋糕、雞尾酒等。我國桃種質資源比較豐富，在長期的育種實踐中也發(fā)現(xiàn)了一些類似的種質資源，如大紅袍、黑油桃等。但是，由于果實經濟性狀差，在人為選擇過程中總是被忽略［1］。

2 紅肉桃花色素苷合成途徑中調控基因及相關調控機理

近年來，借助基因工程、遺傳學和分子生物學手段，花色素苷合成調控的研究取得重大突破。目前已知的花色素苷的合成過程受兩類基因的控制，一類是編碼各步反應相關酶的結構基因(PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS 和 UFGT)，另一類是調節(jié)這些結構基因進行特定時空表達的基因(MYB、bHLH、WD40等)。該合成途徑是一個復雜的、多因素協(xié)同作用的過程，同時也是植物中研究較為透徹的次級代謝途徑之一［16-18］(圖 2)。

目前已分離并分析了大量與花色素苷途徑相關的結構基因和調控基因，但是對于在紅肉桃花色素苷合成中起關鍵作用的基因，相關研究結論不一致。Tsuda等［19］通過研究比較白肉桃、紅肉桃和紅肉油桃中花色素苷合成基因的表達得出，6種花色素苷合成基因均在紅肉桃和紅肉油桃成熟期表達，尤其是CHS基因和DFR基因在紅肉桃成熟期的表達迅速增加，同時花色素苷的含量也增加;相反，在白肉桃中CHS基因和DFR基因在果實成熟期并沒有明顯增加，盡管這些基因在其果皮中得到表達，但比另外2種紅肉果實少得多，這證明CHS基因和DFR基因是紅肉桃和紅肉油桃中調節(jié)花色素苷合成的關鍵基因。趙秀林等［20］研究紅肉桃品種天仙紅在發(fā)育階段果皮和果肉中各種色素含量變化及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性變化，結果發(fā)現(xiàn)在整個生長發(fā)育過程中，PAL活性不斷波動，有逐漸減小的趨勢。通過相關性分析得出紅肉桃中花色素苷含量與葉綠素含量變化呈負相關，紅肉桃在成熟期時果肉中PAL活性與花色素苷含量呈顯著正相關。由此可見，紅肉桃中葉綠素含量下降引起花色素苷的合成，PAL是紅肉桃成熟期果肉中促使花色素苷合成的關鍵酶，同時指出紅肉桃果肉顏色的深淺是由果肉中花色素苷含量和酸含量的多少決定的，即紅肉桃果肉內花色素苷含量越高或可滴定酸含量越高，果肉顏色越紅。然而，根據(jù)前期對白肉桃、紅肉桃和黃肉桃在果實發(fā)育中花色素苷合成相關基因的表達分析發(fā)現(xiàn)，ANS基因的表達與紅肉桃花色素苷的積累呈正相關，在紅肉桃接近成熟期的表達水平迅速上調，可能是調節(jié)花色素苷合成的關鍵基因。筆者所在課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)［21］，2種紅肉桃基因型(DBF、bf)果實發(fā)育期花色素苷合成與PpCHS表達水平密切相關，同時PpPAL在白肉桃品種果實發(fā)育期的表達水平低于紅肉桃品種，推測這2種基因可能是限制白肉桃品種果實中花色素苷合成的因素之一。至于為何會出現(xiàn)與以上不同的結論，還有待于進一步探索。

另外，在花色素苷合成途徑中，bHLH(basic helix-loophelix，堿性螺旋-環(huán)-螺旋)轉錄因子，是一類能與真核生物基因啟動子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的DNA結合蛋白，通過它們之間及其他相關蛋白之間的相互作用、激活或抑制轉錄，從而調控各種誘導性基因的表達以及調節(jié)花色素苷的合成。轉錄因子對花色素苷合成的調控網絡目前尚不清晰，但是普遍認為轉錄因子調控復合物起始轉錄，其調控機制較為復雜。大多數(shù)植物花色素苷的合成是通過MYB-bHLH復合物或者3類轉錄因子相互作用形成MYB-bHLH-WD40復合物(MBW 復合物)進行調節(jié)的［22］。在薔薇科(Rosaceae)植物中，蘋果(Malus domestica)花色素苷生物合成調控的研究近年取得了較大進展，2個bHLH蛋白Md bHLH3和Md bHLH33參與了花色素苷合成的調節(jié)，它們是Md MYB10(R2R3-MYB)有效誘導花色素苷合成所必需的，與Md MYB10相互作用后可誘導蘋果果皮、果肉和葉子合成紅色花色素苷［23］，而與Md MYB10來自同一基因位點的Md-MYB1和Md MYBA只能誘導果皮紅色花色素苷的合成［24-25］。此外，蘋果中參與花色素苷合成的 WD40蛋白Md TTG1得到鑒定，但它是否能與蘋果MYB和bHLH蛋白相互作用還有待研究［26］。同時，對于蘋果Md MYB10直系同源的MYB蛋白在其他薔薇科物種中也得到鑒定，如桃中的Ppr MYB10、梨(Pyrus pyrifolia)中的 Py MYB10［27］、山竹(Garcinia mangostana)中的Gm MYB10以及楊梅(Myrica rubra)中的Mr MYB1，這些MYB蛋白均與果實成熟過程中花色素苷的積累有關，且它們與bHLH蛋白共同表達可激活花色素苷合成基因的表達［28-29］。至于MYB蛋白與bHLH如何在紅肉桃中參與花色素苷的合成與調控還需要今后進一步深入研究。

3 植物生長素對紅肉桃果實花色素苷合成的影響

植物激素是通過影響植物體內的代謝過程和植物基因的表達來影響果實成熟和著色。據(jù)Saure［30］報道，生長素可以促進果實花色素苷的合成，然而不能確定是直接效應還是提前成熟的結果。也就是說，外用生長素處理對果實的成熟具有雙重作用，利用低濃度生長素時，可抑制果實成熟，減少花色素苷的合成，這與其影響到組織對乙烯的敏感性有關。在葡萄上的研究表明，外施NAA抑制了類黃酮途徑相關基因的表達［31］。安哥諾李果實發(fā)育過程中，果皮中的IAA釋放量與花色素苷含量呈負相關［32］。一般情況下在果實發(fā)育期外源 2，4-D、GA3等抑制花色素苷合成［33］，離體培養(yǎng)條件下，低濃度的生長素有利于花青苷的合成。桃中果皮在NAA含量高的培養(yǎng)基上花色素苷合成較多［34］。低濃度的2，4-D抑制草莓細胞懸浮培養(yǎng)細胞生長和數(shù)量增加，促進細胞內花色素苷的合成［35］。至于在紅肉桃果實中生長素含量是如何變化的，與花色素苷合成有何種的關系，與白肉桃有哪些差別，還需要進一步深入研究。

近年來，主要以擬南芥為材料，對生長素受體的分離鑒定和作用機理方面的研究取得了較大進展。目前發(fā)現(xiàn)的生長素受體有運輸抑制劑響應蛋白 (Transport inhibitor response prontein l，TIR1)和生長素結合蛋白(Auxin-binding protein l，ABP1)。ABP1首次發(fā)現(xiàn)是在玉米胚芽鞘的膜上，ABP1的作用機理雖尚不清楚，但從各種植物中分離的ABP1的結構是類似的。Harnden等［36］證實玉米黃化苗不同部位的ABP1含量不同，生長迅速部位的ABP1含量高。ABP1可能通過具有生長素受體的功能而調節(jié)植物生長發(fā)育過程［37］，其豐度與植物的生長部位密切相關［38］。張魏等［39］以擬南芥ABP1的氨基酸序列為探針，通過Blastp程序檢索桃基因組，確定桃生長素結合蛋白ABP1的序列ppa011911m。PpABP1在桃果實中果皮和種子不同發(fā)育時期均有表達，花后52 d PpABP1表達量均達到最大值;外施NAA對桃果實發(fā)育過程中PpABP1表達量的影響與發(fā)育時期相關，在桃果實硬核期，外施NAA會降低PpABP1在果皮中的表達。該研究初步證實了在桃果實發(fā)育過程中存在有ABPl介導的信號轉導途徑。筆者所在課題組前期對于紅肉桃的研究［40］，發(fā)現(xiàn)2種紅肉桃基因型(DBF、bf)的PpABP1和PpARF6在桃果肉不同發(fā)育時期均有表達，其中北京一線紅和雪白桃(白肉)分別在盛花期后72 d和74 d表達量達到最大值，而黑油桃中表達量一直保持較低水平?；虮磉_組織差異性分析發(fā)現(xiàn)PpABP1和PpARF6在花瓣中表達量相對較高;另外，在黑油桃果皮、幼果、新梢和葉片中的表達水平均低于其他品種。鑒于紅肉桃bf基因型樹勢一般比較偏弱，這是否與植物生長素調控有關，并且與DBF基因型之間是否存在著差異等問題將進一步深入探索。隨著試驗方法的不斷改進，對于ABP1的功能研究將進一步深入，研究范圍將更加廣泛。總之，ABP1與生長素的結合僅僅是生長素信號傳導的第1步，ABP1是如何通過與其他蛋白互作來完成生長素信號的傳遞是當前面臨的重要問題。

4 研究展望

紅肉桃具有悠久的栽培歷史，也是近年來桃產業(yè)及理論研究的熱點。然而，由于紅肉桃花色素苷合成途徑中相關調控基因大部分為家族基因，家族成員眾多，具體調控機制十分復雜，目前還有很多相關基因的功能不清楚。再者，紅肉桃中花色素苷合成分子機制及對生長素的響應機制研究尚處于起步階段。今后需要重點開展以下幾方面研究:①深入研究果實花色素苷合成途徑中相關調控基因的具體作用機制;②利用大群體和多群體，分別完成bf和DBF的精細定位，并對關鍵基因進行功能解析;③探索紅肉桃樹體中生長素的具體作用方式和ABP1與ARF的調控機制。

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