利用生物信息學研究Tgfβ信號通路在人類結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用＊

胡海星，張仕超，朱 旋，范雄偉*

(1．長沙環(huán)境保護職業(yè)技術學院，湖南 長沙410004;2．湖南師范大學 蛋白質化學及魚類發(fā)育生物學教育部重點實驗室 心臟發(fā)育研究中心，湖南 長沙410081)

我國結直腸癌死亡率位于惡性腫瘤死亡率的第四位，且發(fā)病率一直呈上升趨勢，嚴重危害人類健康。結直腸癌的發(fā)生與飲食、環(huán)境、遺傳等因素密切相關，其發(fā)病機理一直以來是腫瘤研究領域的研究熱點之一，Tgfβ信號通路在結直腸癌中發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用以被人所熟知，但在人類結直腸癌發(fā)生中具體分子機制和貢獻大小還遠未闡明。

轉化生長因子β(Transforming growth factor)超家族是一類包含了相似結構、功能的多肽生長因子，其中包括TGF－βs、生長分化因子(Growth and differentiation factor，GDFs)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)等30多個成員［1，2］。這些配體分子總是先結合并激活膜上的二型受體(TgfβRⅡ，BmpRⅡ)，二型受體招募一型受體(TgfβRI，BmpRI)二聚化而磷酸化下游的R－Smads(Smad1，2，3，5，8)，進而與co－Smad(Smad4)結合，以異源多聚體的形式，共同入核調節(jié)下游如P27、P21、BIM等靶基因，對細胞的增殖、凋亡、遷移、免疫和炎癥發(fā)揮重要作用。而I－Smads(Smad6、Smad7)通過競爭結合一型受體而抑制R－Smads的活化，由于多數(shù)CKI與抑癌基因均為Tgfβ下游靶點。所以Tgfβ信號被廣泛的認為是抗癌信號。誠然，體內外實驗證明，腸的組織或者細胞中 缺 失Smad4［3－6］、Smad3［7］、BMPR1［8］、TgfβRI［9］由于逃避了Tgfβ信號的控制，均能發(fā)展為癌，而TgfβRII［10－12］與GDF15［13，14］缺失的小鼠，雖然不能直接發(fā)展成癌，但對結直腸癌的肝轉移與耐藥方面產生重要貢獻。在以往的報道中，幾乎所有的經(jīng)典Tgfβ信號超家族的成員均無一例外的呈現(xiàn)出其抑癌作用，并且，具有抑制經(jīng)典信號的Smad7在結直腸癌發(fā)生恰好表現(xiàn)為促癌作用。盡管這樣，這并不能證明在人類結直腸癌發(fā)生就是源自于Tgfβ信號喪失。Abadie C［15］等表明，TgfβRI與直腸癌發(fā)生風險并無關系，F(xiàn)ukushima T［16］等在人類直腸癌突變分析中也沒有發(fā)現(xiàn)Smad2，Smad3，Smad6，Smad7的改變。此外，在腸癌的發(fā)生當中Tgfβ信號成員也并不是表現(xiàn)為一致性的下調，比如Tgfβ1、Tgfβ2在腸癌中就呈現(xiàn)上調趨勢，且表達水平與惡性程度相關。顯而易見，基于基因敲除或者轉基因技術，雖然可以逐一的分揀出Tgfβ信號通路各個成員對腫瘤發(fā)生的功能。但是反向遺傳學的手段卻人為的改變的發(fā)病的始動因素，無法真實吻合發(fā)病的分子事件。所以并不能解決腫瘤的發(fā)病機制從而也很難尋找到干預疾病的真實方法。除此以外，同一信號通路中的各個成員，在發(fā)揮功能的同時存在上下游的相互依存關系。當某些下游的分子發(fā)生改變時，上游的信號轉導將極有可能重新建立新的傳導通路。在Tgfβ信號通路中，有報道經(jīng)典的信號通道在受體環(huán)節(jié)受阻將激活非經(jīng)典信號通道，其間涉及到RAS、MAPK、AKT等，而這些信號恰好與經(jīng)典的Tgfβ信號通路相反，他們經(jīng)常作為癌基因和促癌因子被報道。所以真實病理情況下，Tgfβ信號在腸癌的發(fā)生發(fā)展中作用比人想象的要復雜的多。為了了解Tgfβ信號在腸癌的發(fā)生中的真實作用，需要有一種系統(tǒng)的方法，首先在腸癌的發(fā)生早期病理標本中，全面檢測所有Tgfβ信號成員的變化，然后依據(jù)各自不同功能，才可能推測Tgfβ信號通路在腸癌的發(fā)生中真實的作用機制。

本文通過生物信息學的方法，獲取已經(jīng)報道的腸癌早期芯片結果，在轉錄水平上檢測了27個Tgfβ經(jīng)典信號成員的表達變化關系。發(fā)現(xiàn)在腸癌的發(fā)生早期，Smad2 Smad4的下調阻斷經(jīng)典的Tgfβ信號的抗腫瘤作用，同時配體分子GDF2 GDF3和受體分子Tgfbr2、Tgfbr3的廣泛上調可能刺激旁路分子的激活導致腫瘤的發(fā)生。

1 材料與方法

1．1 材料

所有結直腸癌有關的全基因組表達芯片數(shù)據(jù)均來源于GEO數(shù)據(jù)庫(http://www．ncbi．nlm．gov/geo/)。本研究中設定搜索關鍵詞為“colorectal cancer”，限制研究類型為“expression profiling by array”

1．2 方法

1．2．1 文獻納入標準 符合以下標準的數(shù)據(jù)集將納入研究對象①數(shù)據(jù)集必須是有文獻支持的全基因組mRNA表達芯片數(shù)據(jù);②每套數(shù)據(jù)均有腸癌疾病組織和正常組織對照;③本次均考慮原始或者經(jīng)標準化數(shù)據(jù)集;④每套數(shù)據(jù)集必須包括3個以上樣本;⑤數(shù)據(jù)集采用的樣本必須是人體活檢腸癌組織。根據(jù)篩選標準，總共篩選到12組符合標準的基因芯片數(shù)據(jù)。

1．2．2 數(shù)據(jù)處理 在GEO的supplementary file中下載基因芯片的CEL數(shù)據(jù)壓縮包，并解壓至一個文件夾中待用，同時下載TXT格式的樣本原始數(shù)據(jù);若下載數(shù)據(jù)處沒有顯示CEL數(shù)據(jù)壓縮包，則在scope、format、amount中分別選擇samples、soft、full下載該樣本TXT格式的原始數(shù)據(jù)，通過UltralEdit軟件處理的soft文件顯示基因的名稱，每套樣本數(shù)據(jù)的基本信息記錄在提供的excel里。采用每一個數(shù)據(jù)組跟正常組平均值進行比較對樣本進行標準化處理。

1．2．3 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)KEGG中Tgfβ信號通路成員的信息，在24組基因芯片結果中篩選出共同研究基因，使用T－TEST函數(shù)計算每一個基因表達差異的顯著性，P＜0．05，則表示差異具有顯著性意義。最后根據(jù)標準化后的平均數(shù)值統(tǒng)計其上下調基因。

2 結果

2．1 利用生物信息學在芯片中獲取待測Tgfβ信號通路成員的表達數(shù)據(jù)

根據(jù)納入標準，最終篩選出12組基因芯片結果。利用KEGG選擇Tgfβ信號通路共27經(jīng)典通路的成員，在12組釣取所有成員基因芯片結果數(shù)據(jù)，與12個正常組芯片的平均值，獲得每一組芯片該成員分子相對表達量信息，羅列于表1。

表1 Tgfβ信號通路分子在早期結直腸癌芯片中表達變化Tab．1 The changes of Tgfβsignaling pathway factor in the microarray of early colorectal cancer

2．2 Tgfβ信號通路中成員在人類早期結直腸癌的表達差異分析

對篩選27個基因進行差異性分析，發(fā)現(xiàn)與對照組相比在心臟疾病中，顯著性上調基因包括TGFβR2、TGFβR3、GDF3(P＜0．05)，GDF2也有上調的趨勢(P=0．051)顯著性下調基因有Smad2、GDF15(P＜0．05)，Smad4也有下調的趨勢(P=0．057)，其他成員均有下調或者上調現(xiàn)象但均未達到顯著性意義，(圖1)

圖1 統(tǒng)計分析基因的表達水平(*P＜0．05#P＜0．06)Fig．1 Statistical Analysis determined the levels of gene expression

3 討論

Tgfβ信號通路的經(jīng)典成員具有抑制結腸癌的功能，但在人類結腸癌的發(fā)生過程當中Tgfβ信號通路是否真正參與其中，這需要系統(tǒng)性對整個信號通路成員在結腸癌的發(fā)生早期病理標本中，檢測所有各成員的表達變化關系，才能找到Tgfβ信號通路調節(jié)結腸癌發(fā)生的線索為臨床早期診斷、干預帶來積極效應。廣泛的收集人類早期結腸癌標本，并通過常規(guī)的分子生物學檢測所有成員的表達變化并不是一件容易的事。但是生物信息學的發(fā)展，使我們能在數(shù)據(jù)庫中直接看到一個標本在全轉錄本中的表達變化，而這些已發(fā)表的芯片數(shù)據(jù)結果其一致性和可靠性已經(jīng)過了同行的審驗與認可，但是提供芯片數(shù)據(jù)的作者往往只關注其自身的科學問題，而芯片內含的其他方面數(shù)據(jù)價值卻被擱置。所以從以往的數(shù)據(jù)中提出新問題，得到新結論，是一種值得去做的工作。且從別人的數(shù)據(jù)中得到支持自己的證據(jù)，由于排除了主觀的傾向性，二度利用的數(shù)據(jù)比首次利用更為客觀?；诖?，我們找到12組符合納入標準的早期結腸癌芯片，并發(fā)現(xiàn)結腸癌早期Tgfβ信號通路的經(jīng)典成員的Smad2 Smad4表達下降，而Tgfbr 2 Tgfbr 3 GDF3 GDF2上調。研究表明，Smad4存在明顯的抗癌作用［3］，缺失了Smad4的小鼠，導致嚴重的腸癌［4］，結腸癌細胞中喪失了Smad4將容易發(fā)生肝臟轉移［5］。當Smad4表達下降時，有可能導致經(jīng)典的Tgfβ信號喪失效應，而與此同時Tgfbr 2 Tgfbr 3 GDF3 GDF2上調也有可能不再轉導經(jīng)典的信號，而激活旁路。研究發(fā)現(xiàn)，當Smad4缺失時，BMP信號將會激活Rho AKT信號［17－19］，而促進腫瘤形成。由此根據(jù)我們結果，我們推測在結腸癌早期，一方面，Smad2 Smad4的下調阻斷經(jīng)典的Tgfβ信號的抗腫瘤作用，另一方面，配體分子GDF2 GDF3和受體分子Tgfbr2、Tgfbr3的廣泛上調可能刺激旁路分子的激活從在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用(圖2)。提示旁路的抑制與經(jīng)典通路的重新激活的聯(lián)合策略有可能在干預早期結腸癌帶來貢獻。

圖2 Tgfβ信號通路在結腸癌發(fā)生中的作用機制Fig．2 The roles of Tgfβsignaling pathway in the occurrence of colorectal cancer

［1］ MASSAGUéJ．Tgf－beta signal transduction［J］．Annu Rev Biochem，1998，67:753－791．

［2］ LAMPROPOULOS P，ZIZI－SERMPETZOGLOU A，RIZOS S，et al．Tgf－beta signaling in colon carcinogenesis［J］．Cancer Lett，2012，314(1):1－7．

［3］ ITATANI Y，KAWADA K，F(xiàn)UJISHITA T，et al．Loss of SMAD4 from colorectal cancer cells promotes CCL15 expression to recruit CCR1+ myeloid cells and facilitate liver metastasis［J］．Gastroenterology，2013，145(5):1064－1075．

［4］ ZHANG B，HALDER SK，KASHIKAR N D，et al．Antimetastatic role of Smad4 signaling in colorectal cancer［J］．Gastroenterology，2010，138(3):969－980．

［5］ HALDER SK，RACHAKONDA G，DEANE N G，et al．Smad7 induces hepatic metastasis in colorectal cancer［J］．Br J Cancer，2008，99(6):957－965．

［6］ TAKAKU K，OSHIMA M，MIYOSHI H，et al．Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4(Smad4)and Apc genes［J］．Cell，1998，92(5):645－656．

［7］ ZHU Y，RICHARDSON JA，PARADA L F，et al．Smad3 mutant mice develop metastatic colorectal cancer［J］．Cell，1998，94(6):703－714．

［8］ LORENTE－TRIGOSA，VARNAT F，MELOTTIA，et al．BMP signaling promotes the growth of primary human colon carcinomasin vivo［J］．JMol Cell Biol，2010，2(6):318－332．

［9］ WANG J，HAN W，ZBOROWSKA E，et al．Reduced expression of transforming growth factor beta type Ireceptor contributes to the malignancy of human colon carcinoma cells［J］．J Biol Chem，1996，271(29):17366－17371．

［10］ MORRISSM，CARTERK T，BAEK JY，et al．TGF－βsignaling alters the pattern of liver tumorigenesis induced by Pten inactivation［J］．Oncogene，2014 Aug 18，［Epub ahead of print］．

［11］ SIMMS N A，RAJPUT A，SHARRATT E A，et al．Transforming growth factor－βsuppresses metastasis in a subset of human colon carcinoma cells［J］．BMC Cancer，2012，12:221．

［12］ FU Y，LIU X，ZHOU N，et al．MicroRNA－200b stimulates tumour growth in TGFBR2－null colorectal cancers by negatively regulating p27/kip1［J］．JCell Physiol，2014，229(6):772－782．

［13］ ZIMMERS T A，GUTIERREZ J C，KONIARIS L G．Loss of GDF－15 abolishes sulindac chemoprevention in the ApcMin/+mouse model of intestinal cancer［J］．J Cancer Res Clin Oncol，2010，136(4):571－576．

［14］ ZIMMERST A，GUTIERREZ J C，KONIARIS L G．NAG－1/GDF－15:no evidence for an inhibitory role in colon cancer［J］．Gastroenterology，2007，132(3):1204－1205．

［15］ ABADIE C，KILLIAN A，TINAT J，et al．Allelic imbalance of the TGFβR1 is not a major contributor to the genetic predisposition to colorectal cancer［J］．Br J Cancer，2011，104(9):1517－1518，author reply 1519－1520．

［16］ BEVAN S，WOODFORD－RICHENS K，ROZEN P，et al．Screening SMAD1，SMAD2，SMAD3，and SMAD5 for germline mutations in juvenile polyposis syndrome［J］．Gut，1999，45(3):406－408．

［17］ VOORNEVELD P W，KODACH L L，JACOBS R J，et al．Loss of SMAD4 alters BMPsignaling to promote colorectal cancer cell metastasis via activation of Rho and ROCK［J］．Gastroenterology，2014，147(1):196－208．

［18］ KANG M H，KANGH N，KIM JL，et al．Inhibition of PI3 kinase/Akt pathway isrequired for BMP2－induced EMTand invasion［J］．Oncol Rep，2009，22(3):525－534．

［19］ KODACH L L，WIERCINSKA E，DE MIRANDA N F，et al．The bone morphogenetic protein pathway is inactivated in the majority of sporadic colorectal cancers［J］．Gastroenterology，2008，134(5):1332－1341．