幾種先進(jìn)的光學(xué)納米探針在光學(xué)生物診療中的應(yīng)用

詹求強(qiáng)，張　欣，李　心，何賽靈

（1.華南師范大學(xué)，光及電磁波研究中心，廣東廣州510006；2.浙江中控太陽(yáng)能技術(shù)有限公司，浙江杭州310053）

·專題論述·

幾種先進(jìn)的光學(xué)納米探針在光學(xué)生物診療中的應(yīng)用

詹求強(qiáng)1，張欣1，李心2，何賽靈1

（1.華南師范大學(xué)，光及電磁波研究中心，廣東廣州510006；2.浙江中控太陽(yáng)能技術(shù)有限公司，浙江杭州310053）

先進(jìn)的光學(xué)納米探針對(duì)于生物組織的光學(xué)成像、疾病的診斷和治療具有巨大的促進(jìn)作用，尤其是對(duì)于生物體分子水平活動(dòng)的動(dòng)態(tài)信息的深入了解。新型的光學(xué)探針如納米金棒、上轉(zhuǎn)換納米顆粒和氧化石墨烯等，能克服傳統(tǒng)探針的一些不足，具有較高的對(duì)比度、穩(wěn)定性和生物兼容性，而且還擁有深層組織成像和實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像的能力。本文對(duì)這些納米光學(xué)探針的光學(xué)性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行了簡(jiǎn)要的介紹，并通過(guò)綜述作者及其他研究者在過(guò)去幾年的研究成果，總結(jié)這些先進(jìn)的納米探針在生物成像和醫(yī)學(xué)診斷、治療方面的應(yīng)用，并展望其應(yīng)用前景。

光學(xué)探針；納米顆粒；生物光學(xué)成像

在過(guò)去的幾十年里，生物醫(yī)學(xué)成像技術(shù)經(jīng)歷了一輪快速的革新。X射線成像、計(jì)算機(jī)輔助層析、超聲成像、核磁共振成像、正電子發(fā)射斷層掃描已成功運(yùn)用到臨床醫(yī)學(xué)中，成為了重要的診斷和治療工具［1］。然而，這些生物醫(yī)學(xué)成像技術(shù)尚存一些缺陷［2］，在某些方面已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展。光學(xué)成像以光-物質(zhì)相互作用（如吸收、反射、散射和熒光）為機(jī)理，通過(guò)獲取空間、時(shí)間、光譜等信息實(shí)現(xiàn)成像，能克服傳統(tǒng)成像技術(shù)所遇到的一些問(wèn)題［2］。細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程和組織的化學(xué)信息可以通過(guò)光譜和動(dòng)態(tài)成像得到，光學(xué)成像還能選擇性的對(duì)一些分子活動(dòng)進(jìn)行探測(cè)。目前，光學(xué)成像技術(shù)經(jīng)過(guò)發(fā)展和革新，已經(jīng)形成了透射成像、熒光成像、暗場(chǎng)散射成像、激光共聚焦掃描成像［3］、多光子熒光成像［4］、光學(xué)相干層析［5］、漫射光層析［6］、全內(nèi)反射熒光成像［7］、近場(chǎng)光學(xué)成像［8］、熒光壽命成像［9］和光聲成像［10］等不同的方法。其中，光學(xué)相干層析、熒光成像等技術(shù)已成功運(yùn)用到臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用中。

隨著生命科學(xué)研究的深入，研究者們迫切需要從單細(xì)胞和單分子尺度上活體、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地了解各生命物質(zhì)之間的相互作用及生命活動(dòng)的細(xì)微過(guò)程。現(xiàn)代光學(xué)生物成像與診療技術(shù)，很多需要依靠光學(xué)探針（Optical probe）標(biāo)記以觀察生物細(xì)胞的各種生物化學(xué)成分，光學(xué)探針在光學(xué)成像中扮演著重要的角色。作為一種光學(xué)成像的工具，光學(xué)探針能將所要成像的生物樣本部分與背景區(qū)分開來(lái)，極大的提高了成像對(duì)比度，為科學(xué)研究提供許多有用信息。理想的光學(xué)探針應(yīng)具有以下特征：信號(hào)較強(qiáng)，探測(cè)效率高；穩(wěn)定性好，不易發(fā)生物理或化學(xué)變化；體積較小，細(xì)胞毒性小，生物兼容性好。目前，有機(jī)熒光染料是一種普遍使用的光學(xué)探針，但其光穩(wěn)定性差，光致漂白和光致分解是限制它們?cè)趩畏肿訖z測(cè)中的應(yīng)用的重要因素。近年來(lái)，合成簡(jiǎn)易且高度可控的納米顆粒因具有優(yōu)異的光學(xué)性能，在光學(xué)生物成像和臨床診斷領(lǐng)域引起了人們的廣泛關(guān)注，利用這些納米粒子作為生物光學(xué)探針能夠較好地解決有機(jī)熒光染料探針存在的一些問(wèn)題。納米顆粒，如量子點(diǎn)、納米金顆粒和上轉(zhuǎn)換納米顆粒等，具有許多特殊的物理和化學(xué)性質(zhì)，非常適合作為光學(xué)成像的探針［11］。這些納米顆粒水溶性、穩(wěn)定性和生物兼容性較好，同時(shí)具有一些特殊的性質(zhì)，而且還可以進(jìn)行表面修飾實(shí)現(xiàn)其功能化，以便在生物醫(yī)學(xué)中的得到應(yīng)用［12-15］。不僅如此，這些光學(xué)探針還可能在光的刺激下產(chǎn)生一些效應(yīng)（如熱效應(yīng)），有望實(shí)現(xiàn)可視化的治療。隨著這些納米尺度的光學(xué)探針的不斷出現(xiàn)，非侵入式的實(shí)時(shí)觀測(cè)細(xì)胞、組織或生物活體的光學(xué)成像與診療技術(shù)迅速發(fā)展。

本文將簡(jiǎn)要地介紹一些納米顆粒的性質(zhì)和構(gòu)造，如納米金棒（Gold nanorods，GNRs）、上轉(zhuǎn)換納米顆粒（Upconversion nanoparticles，UCNPs）和氧化石墨烯（Graphene oxide，GO），并展示這些納米顆粒在光學(xué)生物成像、診斷和治療方面的一些應(yīng)用。

1　納米金棒

在過(guò)去的一些年，許多關(guān)于GNRs的研究集中在其獨(dú)特的光學(xué)和化學(xué)性質(zhì)。由于GNRs表面存在大量自由電子，在激發(fā)光作用下能引起自由電子集體振蕩而產(chǎn)生電磁表面波，GNRs具有顯著的局域表面等離子共振（Localized surface p lasmon resonance，LSPR）特性，廣泛應(yīng)用于生物成像和治療中［16-20］。GNRs有兩種不同的LSPR模式，即長(zhǎng)軸LSPR和短軸LSPR模式，分別對(duì)應(yīng)于沿其長(zhǎng)軸和短軸消光（光的吸收和散射）。短軸LSPR消光峰位于520 nm附近，相對(duì)較弱；長(zhǎng)軸LSPR消光峰相對(duì)較強(qiáng)，其峰值位置和GNRs的大小、形狀等因素密切相關(guān)，通過(guò)改變GNRs的長(zhǎng)度和直徑的比值，可以將峰值在可見光到近紅外光范圍（600-1 200 nm）內(nèi)調(diào)節(jié)［21-23］。這對(duì)于GNRs的生物和光學(xué)應(yīng)用是非常重要的，因?yàn)?00-900 nm是人體組織的一個(gè)光學(xué)透明窗口，光吸收和散射相對(duì)較弱，這樣就增加了光穿透組織的能力［24］。GNRs的長(zhǎng)軸LSPR模式導(dǎo)致強(qiáng)烈地光吸收和散射，使它本身能夠應(yīng)用于單光子成像、雙光子成像和暗場(chǎng)散射成像；GNRs的等離子共振性質(zhì)使它具有強(qiáng)大地匯聚光的能力，因而在它的周圍會(huì)形成一個(gè)極強(qiáng)的局域光場(chǎng)，能夠?qū)σ恍┕鈱W(xué)過(guò)程進(jìn)行調(diào)制，如熒光信號(hào)增強(qiáng)［25，26］、拉曼散射增強(qiáng)［27］和光動(dòng)力療效增強(qiáng)［28］；GNRs吸收截面大，具有很高的光熱轉(zhuǎn)換效率，使其成為一種很好的納米光熱劑用于光熱治療；GNRs本身在特定波長(zhǎng)激發(fā)下能夠產(chǎn)生活性氧，因此成為一種優(yōu)良的光敏劑，有望取代常用的有機(jī)光敏劑用于光動(dòng)力治療；GNRs的長(zhǎng)軸LSPR消光峰的一些特性（如強(qiáng)度、峰值位置等）對(duì)顆粒尺寸、形狀、環(huán)境和顆粒間距非常敏感，有望成為優(yōu)良的生物傳感器。

1.1生物成像應(yīng)用

暗場(chǎng)成像技術(shù)具有靈敏度高、成本低廉等優(yōu)勢(shì)，GNRs對(duì)光的散射作用使其能夠應(yīng)用于暗場(chǎng)散射成像，修飾了的生物分子的GNRs可以用來(lái)進(jìn)行癌細(xì)胞的特異性標(biāo)記暗場(chǎng)散射成像。Li等人將牛血清蛋白和生物素連接到經(jīng)修飾的GNRs上并固定在玻璃載玻片上，清晰的觀測(cè)到發(fā)出紅色散射光的GNRs［29］。利用連接有anti-CEA 8（carcinoembryonic antibody）抗體的GNRs作為探針標(biāo)記在HeLa細(xì)胞上進(jìn)行暗場(chǎng)顯微成像，發(fā)現(xiàn)只有anti-CEA 8抗體修飾的介孔二氧化硅包覆的GNRs，才能有效地連接在HeLa細(xì)胞表面，暗場(chǎng)成像圖中才能顯示紅色散射光［30］。Zhan等人將HER2抗體連接的介孔二氧化硅包覆的GNRs用于MCF-7癌細(xì)胞的特異性暗場(chǎng)成像，發(fā)現(xiàn)只有含an- ti-HER 2抗體連接的介孔二氧化硅包覆的GNRs的癌細(xì)胞中有顯著的紅色散射光，這種散射光與納米金棒本身的暗場(chǎng)散射圖非常一致。

有報(bào)道表明，GNRs在紫外光激發(fā)下能夠發(fā)出可見的熒光［31］，而紫外光激發(fā)不利于生物應(yīng)用。Huang等報(bào)道了GNRs能夠在單光子激發(fā)下發(fā)出熒光用于標(biāo)記細(xì)胞，并且其熒光光譜和激發(fā)光的波長(zhǎng)息息相關(guān)［32］。激發(fā)光波長(zhǎng)越長(zhǎng)，熒光波長(zhǎng)也越長(zhǎng)。因此，改變激發(fā)光波長(zhǎng)，我們能探測(cè)到不同波長(zhǎng)的熒光，這使得利用GNRs實(shí)現(xiàn)多色多通道成像成為可能，如圖1所示。GNRs具有非常大的雙光子吸收截面，使它非常適合用于雙光子熒光成像和治療［33］。Xu等人將生物修飾后的GNRs導(dǎo)入進(jìn)癌細(xì)胞中，在飛秒激光激發(fā)下得到清晰的細(xì)胞成像圖［34，35］。

圖1?。╝）GNRs的吸收光譜（實(shí)線）和活性氧的激發(fā)光譜（虛線）；（b）不同波長(zhǎng)光激發(fā)下GNRs的發(fā)光光譜；（c）HeLa細(xì)胞內(nèi)吞GNRs后分別在488、533和600 nm光激發(fā)下的共聚焦熒光成像圖［32］Fig.1 （a）The absorption spectra（solid lines）of GNRsand the excitation spectra（dashed lines）of sin-glet oxygen phosphorescence；（b）Excitation wavelength dependent em ission spectra of GNRs；（c）Confo-cal fluorescence images for Au NRs in HeLa cells by 488，533 and 600 nm light［32］

1.2局域等離子共振增強(qiáng)光信號(hào)的應(yīng)用

GNRs的LSPR效應(yīng)可以對(duì)其表面附近的熒光劑進(jìn)行熒光增強(qiáng)，熒光劑與納米金棒間的距離則決定了其熒光被增強(qiáng)效果［36］。Li等人將GNRs和SiO2包覆的GNRs分別與量子點(diǎn)（Quantum dots，QDs）相連接，并修飾anti-CEA 8抗體，研究了這些復(fù)合納米顆粒在雙光子熒光壽命成像中的應(yīng)用［30］。當(dāng)QDs與GNRs距離大于10 nm時(shí)，GNRs的熒光增強(qiáng)效應(yīng)占主導(dǎo)，并在距離15 nm左右達(dá)到最大值。與GNRs-QDs相比，通過(guò)包覆SiO2殼層控制GNRs與QDs間距在15 nm左右，SiO2-GNRs-QDs的熒光在單光子和雙光子激發(fā)下都很強(qiáng)，QDs的熒光因GNRs的LSPR增強(qiáng)作用而產(chǎn)生了熒光增強(qiáng)；在雙光子熒光成像中，GNRs自身可以發(fā)出強(qiáng)烈的雙光子輻射光，用于細(xì)胞成像。雖然QDs和GNRs的雙光子輻射光譜出現(xiàn)重合現(xiàn)象，難以通過(guò)熒光光譜區(qū)分，但由于GNRs的雙光子熒光壽命極短，因此可以在熒光壽命成像中清晰地將其與QDs的雙光子熒光及細(xì)胞自發(fā)熒光等熒光區(qū)分開來(lái)，具有很高的熒光壽命特異性和良好的信噪比。

金屬的LSPR效應(yīng)可以對(duì)其吸附表面或附近的分子的拉曼信號(hào)進(jìn)行增強(qiáng)，進(jìn)而催生了表面增強(qiáng)拉曼散射這一研究領(lǐng)域［37］。其中，GNRs由于具有極大地局域場(chǎng)增強(qiáng)效應(yīng)，是一種優(yōu)良的增強(qiáng)拉曼信號(hào)的金屬納米顆粒。Zhang等人合成了DTTC-SiO2@ GNRs，具有Fluorescence-SERS雙模式成像功能，如圖2所示［38］。首先，將染料分子DTTC（熒光峰在780 nm附近）摻雜在包覆介孔二氧化硅的GNRs中，然后利用帶有1，2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺（1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DSPE）的PEG進(jìn)一步修飾它，這種復(fù)合材料在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、動(dòng)物血清以及活體環(huán)境中，結(jié)構(gòu)以及光學(xué)穩(wěn)定性均非常好。染料1和染料2與GNRs的間距不同，染料1具有高效的SERS成像能力，染料2具有高效的熒光成像能力，可以通過(guò)控制SiO2的厚度來(lái)實(shí)現(xiàn)熒光成像和SERS成像通道的切換。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)靜脈注射進(jìn)入患瘤小鼠體內(nèi)的這種復(fù)合納米顆?？梢园邢蛐缘鼐奂谀[瘤內(nèi)部，從而實(shí)現(xiàn)SERS-熒光相配合的腫瘤檢測(cè)。這種多功能化的GNRs在多模式腫瘤探測(cè)方面有巨大的前景。

圖2?。╝）Fluorescence-SERS雙模式成像的GNRs合成過(guò)程；（b）-（d）：不同厚度二氧化硅包覆的納米金棒的TEM圖；（e）：患腫瘤的老鼠照片（綠色圓圈）與3個(gè)不同部位熒光成像圖（紅色箭頭）；（g）三個(gè)不同部位熒光光譜圖；（h）三個(gè)不同部位熒光光譜與SERS光譜中508 cm-1處光強(qiáng)［38］Fig.2 （a）The synthetic process of this functional GNRs（Fluorescence-SERS）；（b）-（d）TEM images of this functional GNRs；（e）The photo of themouse bearing a tumor（green circle）；（g）Fluorescence image with three locations（red arrows）；（h）The fluorescence spectra and the SERS intensities（508 cm-1）from the three locations［38］

GNRs的LSPR效應(yīng)導(dǎo)致的局域光場(chǎng)能極大地增強(qiáng)附近光敏劑的吸收截面，從而增強(qiáng)其釋放活性氧的效率，達(dá)到增強(qiáng)光動(dòng)力治療的效果［39］。Xu等人將光敏劑（T-790）連接到SiO2包覆的GNRs（吸收峰為820 nm）上，研究這種復(fù)合納米顆粒釋放活性氧和殺死癌細(xì)胞的效率［40］。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)控SiO2的厚度，在雙光子（800 nm）激發(fā)下，這種復(fù)合納米顆粒的活性氧釋放效率要遠(yuǎn)高于在單光子（420 nm）的效率。無(wú)論是單光子還是雙光子激發(fā)下，復(fù)合納米顆粒的活性氧釋放效率均高于純光敏劑的釋放效率。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，在上述三種條件下，HepG2細(xì)胞的存活率也有相同的規(guī)律，這表明GNRs能有效地增強(qiáng)光動(dòng)力療效，特別是在雙光子激發(fā)下。Li等人設(shè)計(jì)了ICG摻到介孔硅包覆的GNRs里的納米治療平臺(tái)，在單光子的近紅外光激發(fā)下實(shí)現(xiàn)了對(duì)ICG光動(dòng)力治療效果的增強(qiáng)，如圖3所示［28］。GNRs的LSPR峰（810 nm）與ICG的吸收峰（780 nm）良好的光譜重疊使激發(fā)光強(qiáng)度被極大地增強(qiáng)，這直接增強(qiáng)了活性氧的釋放效率，使這種納米平臺(tái)在殺死乳腺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中比單純的ICG具有更佳的表現(xiàn)。

圖3　GNRs近紅外單光子增強(qiáng)ICG光動(dòng)力療效的納米治療平臺(tái)的設(shè)計(jì)示意圖［28］Fig.3 Design of enhanced photodynam ic therapy by utilizing the GNR to simultaneously increase the ab-sorption and reduce photo-induced degradation of the photosensitizers ICG［28］

1.3光動(dòng)力治療應(yīng)用

GNRs在光動(dòng)力治療領(lǐng)域的應(yīng)用不僅僅局限于增強(qiáng)光敏劑的活性氧釋放效率，其本身在特定波長(zhǎng)的光激發(fā)下也能產(chǎn)生活性氧，因而單獨(dú)的GNRs也能用于光動(dòng)力治療［41］。GNRs極大地光吸收截面和可調(diào)的吸收峰使增加了激發(fā)光穿透深度，使其在活體光動(dòng)力治療上優(yōu)于傳統(tǒng)的有機(jī)光敏劑。Hwang等人研究表明，GNRs在長(zhǎng)軸LSPR峰激發(fā)下能產(chǎn)生活性氧，而短軸LSPR峰激發(fā)下無(wú)活性氧產(chǎn)生。而且，不同共振峰的GNRs的活性氧激發(fā)光譜非常類似，且均與它們的吸收譜存在一定程度的不匹配［42］。Xu等人發(fā)現(xiàn)在近紅外的雙光子激發(fā)下，三種不同吸收峰的GNRs的活性氧釋放效率遠(yuǎn)高于一些常用的有機(jī)光敏劑［34］。Huang等人報(bào)道了吸收峰為808 nm的GNRs在875-1 100 nm的光激發(fā)下能產(chǎn)生活性氧，并能夠很好地應(yīng)用于光動(dòng)力治療，如圖4所示。離體的癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，相較于GNRs的光熱治療，活性氧導(dǎo)致的光動(dòng)力治療能更高效地殺死癌細(xì)胞；活體的小鼠腫瘤實(shí)驗(yàn)表明，相比光熱治療和化療，GNRs的導(dǎo)致的光動(dòng)力治療不僅效率高，而且腫瘤不會(huì)再?gòu)?fù)發(fā)［43］。

1.4生物傳感應(yīng)用

生物傳感主要借助生物分子間的特異性識(shí)別過(guò)程，當(dāng)待測(cè)的生物分子與識(shí)別分子探針特異性結(jié)合時(shí)，識(shí)別分子性質(zhì)或周圍環(huán)境的物理、化學(xué)等性質(zhì)會(huì)發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的改變，通過(guò)對(duì)識(shí)別分子進(jìn)行激勵(lì)，將這些狀態(tài)的改變轉(zhuǎn)化為某種信號(hào)并檢測(cè)此信號(hào)，從而定性或定量地判斷生物分子識(shí)別過(guò)程的發(fā)生［44］。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試（ELISA）是一種通過(guò)生物分子間的相互作用而改變顏色實(shí)現(xiàn)傳感的應(yīng)用，而這種方法要求被測(cè)分子的濃度較高。最近，Rica等人報(bào)道了一種等離子ELISA方法裸眼精確探測(cè)病毒，利用反應(yīng)溶液中合成的金納米顆粒的聚集或不聚集的顏色變化，探測(cè)濃度低至10-18g/mL［45］。GNRs比納米金顆粒對(duì)環(huán)境變化更敏感，因而更適合用于生物傳感。

圖4　GNRs光熱和光動(dòng)力治療的機(jī)制示意圖（a）活體光治療摧毀腫瘤；（b）離體殺死癌細(xì)胞［43］Fig.4 Schematic of photothermal and photodynamic therapy effects by GNRs（a）in vivo photo-destruc-tion ofmalignant tumors；（b）in vitro PDT and PTT-induced cellular deaths［43］

GNRs長(zhǎng)軸消光峰對(duì)表面微環(huán)境折射率的改變非常敏感，其峰值強(qiáng)度或波長(zhǎng)位置會(huì)隨顆粒聚集或者折射率改變而發(fā)生變化，這種特性使得GNRs成為非常靈敏的生物傳感器。Li等人利用包覆了聚（3，4-亞乙二氧基噻吩）-聚（苯乙烯磺酸）（poly（3，4-ethylenedioxythiophene）-poly（styrenesulfonate），PSS）和聚二烯丙基二甲基氯化銨（polydiallyldimethylam-monium chioride，PDADMAC）的GNRs來(lái)進(jìn)行生物素（biotin）與鏈霉親和素（streptavidin）分子之間的識(shí)別傳感，生物素和鏈霉親和素之間的選擇性分子識(shí)別確保了對(duì)鏈霉親和素傳感探測(cè)的特異性［29］。在鏈霉親和素的作用下，每四個(gè)納米金棒會(huì)相互靠近。縮小納米金棒的距離，由近場(chǎng)耦合效應(yīng)而會(huì)在納米金棒表面產(chǎn)生耦合的表面等離子體波，并使納米金棒的LSPR消光峰產(chǎn)生紅移、展寬等變化。通過(guò)高精度的光譜測(cè)量以及溶液顏色觀察，發(fā)現(xiàn)其吸收光譜隨加入的不同濃度的鏈霉親和素而有不同的變化，納米金棒峰漂移以及展寬的程度也很有規(guī)律，溶液的顏色及清澈度等狀態(tài)也相應(yīng)發(fā)生變化。這種直觀的顏色變化使我們對(duì)鏈霉親和素的定性傳感探測(cè)更加快捷、方便。

GNRs不僅能增強(qiáng)其周圍分子的熒光，在一定條件下也能使其焠滅，其熒光猝滅能力對(duì)熒光劑與顆粒間空間距離十分敏感。Li等人利用GNRs對(duì)QDs的熒光猝滅效應(yīng)進(jìn)行寡核苷酸序列傳感，實(shí)現(xiàn)了對(duì)未經(jīng)標(biāo)記的單鏈DNA的傳感檢測(cè)［46］。未經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸ssDNA可以直接通過(guò)靜電力吸附作用連接于表面強(qiáng)正電性的CTAB作為表面活性劑的納米金棒表面，當(dāng)GNRs上的寡核苷酸ssDNA序列中含有與QDs標(biāo)記的ssDNA互補(bǔ)的堿基片段時(shí)，發(fā)生DNA分子雜交反應(yīng)，連有ssDNA的QDs因DNA的雜交與GNRs相互靠近，QDs受激發(fā)出的熒光被GNRs猝滅；反之，DNA分子不會(huì)雜交反應(yīng)，其熒光不會(huì)出現(xiàn)明顯猝滅。這種傳感探測(cè)的方法可以特異地探測(cè)未知單鏈DNA序列中是否含有某一特定的堿基片段，而不用事先將未知的單鏈DNA進(jìn)行標(biāo)記或修飾，這種傳感方法具有非常高的特異性和光學(xué)靈敏度，高效快捷。

2　上轉(zhuǎn)換納米顆粒

2.1光學(xué)性質(zhì)與優(yōu)勢(shì)

上轉(zhuǎn)換納米顆粒是一種在納米晶體中摻雜不同稀土離子（如Er3+，Tm3+，Ho3+和Yb3+等）的復(fù)合型納米材料。在一般情況下，Yb3+往往充當(dāng)敏化離子（sensitizer）角色，而其他的稀土離子充當(dāng)活化離子（activator）角色。整個(gè)上轉(zhuǎn)換發(fā)光過(guò)程包含了敏化離子的光吸收過(guò)程、敏化離子與活化離子之間的能量傳遞和活化離子的發(fā)光過(guò)程，如圖5所示［47］。這些能量轉(zhuǎn)移過(guò)程中會(huì)有雙光子和三光子過(guò)程，在近紅外光激發(fā)下分別發(fā)出綠光、紅光和藍(lán)光，上轉(zhuǎn)換的發(fā)光波長(zhǎng)幾乎涵蓋了從紫外光到近紅外光區(qū)域［48，49］。與傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記物不同，UCNPs可以用近紅外光激發(fā)，明顯的減小了生物樣品的光熱損傷，同時(shí)極大增加了激發(fā)光的穿透深度。上轉(zhuǎn)換激發(fā)所采用的反斯托克斯機(jī)制可以消除生物體的自發(fā)熒光干擾，從而使生物光學(xué)成像具有非常好的信噪比。同時(shí)，上轉(zhuǎn)換過(guò)程存在真實(shí)的實(shí)能級(jí)，具有比普通的雙光子過(guò)程更高效率，低功率密度照射下也能產(chǎn)生適用于生物研究的穩(wěn)定適中的光強(qiáng)。UCNPs在連續(xù)照射下不會(huì)產(chǎn)生閃爍、光漂白和光化學(xué)降解［50-52］，其發(fā)射峰（半高線寬，F(xiàn)WHM＜12 nm）窄而清晰的，熒光壽命較長(zhǎng)（μs～ms）［53，54］，以上這些優(yōu)勢(shì)都使UC-NPs在生物光子學(xué)領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用可能。

圖5　敏化離子Yb3+與活化離子Er3+，Tm3+，Ho3+的能級(jí)結(jié)構(gòu)以及他們之間通過(guò)能量轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)上轉(zhuǎn)換發(fā)光過(guò)程的能級(jí)躍遷機(jī)制［47］Fig.5 Energy level structure and proposed UC mechanisms of the Yb3+，Er3+/Tm3+/Ho3+co-doped UCNPs［47］

2.2上轉(zhuǎn)換納米顆粒的光學(xué)優(yōu)化及生物成像應(yīng)用

盡管它具有無(wú)自發(fā)熒光、無(wú)漂白、無(wú)閃爍及超高的時(shí)空分辨率等明顯的優(yōu)勢(shì)，相對(duì)較低的量子產(chǎn)率、掃描時(shí)間長(zhǎng)和組織對(duì)激發(fā)光強(qiáng)烈的吸收始終是限制UCNPs在生物醫(yī)學(xué)及光學(xué)成像中更廣泛應(yīng)用的癥結(jié)所在［55-60］。UCNPs發(fā)光效率優(yōu)化主要可以從材料合成優(yōu)化、表面等離子增強(qiáng)優(yōu)化、激發(fā)光波長(zhǎng)優(yōu)化和成像技術(shù)的優(yōu)化［60，61］。

UCNPs的發(fā)光效率與納米顆粒晶體的大小成反比關(guān)系，還與納米顆粒的晶型有關(guān)，六角相晶體UC-NPs比立方相的具有更高的發(fā)光效率。因此，效率較高的上轉(zhuǎn)換納米顆粒尺寸相對(duì)更大，而顆粒尺寸太大卻不利于其生物應(yīng)用［62］。通過(guò)摻雜Gd3+元素可以實(shí)現(xiàn)NaYF4納米顆粒的大小、晶型以及發(fā)光特性的控制［63］，該方法能夠簡(jiǎn)單有效地制備六角相上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米棒、小尺寸六角相UCNPs等。

UCNPs一般選擇波長(zhǎng)為980 nm的激光作為激發(fā)光，因?yàn)閅b3+在980 nm附近具有很大的吸收率。然而，水（在生物組織中含量很大）在930-1 030 nm波段具有很強(qiáng)的吸收，特別是在980 nm附近具有一個(gè)很大的吸收峰［59］。因此，使用980 nm的光激發(fā)UCNPs具有兩個(gè)明顯的弊端［64］：（1）明顯的熱效應(yīng)可能會(huì)損傷生物細(xì)胞或組織，（2）強(qiáng)烈的光吸收會(huì)限制成像深度。UCNPs溶液的吸收光譜顯示，在900-1 000 nm范圍內(nèi)雖然最大吸收峰出現(xiàn)在980 nm附近，但920 nm附近也有一個(gè)明顯的吸收峰，且附近水的吸收系數(shù)很小。Zhan等人在國(guó)際上首次提出了利用915 nm光作為上轉(zhuǎn)換材料的新激發(fā)光源波長(zhǎng)，并證實(shí)這是一種更具有優(yōu)勢(shì)的激發(fā)方式［59］。分別用980 nm和915 nm的激光照射老鼠背部，約5 min后，前者最大溫度達(dá)到49.2℃且明顯出現(xiàn)疤痕，而后者只有31.5℃且無(wú)明顯疤痕；對(duì)細(xì)胞顯微成像中PBS溶液中的光場(chǎng)和溫度模擬計(jì)算顯示，980 nm的激光照射5分鐘后，溶液溫度達(dá)到44℃，而915 nm的激光照射相同時(shí)間，溫度只有38.1℃，而且915 nm的光可以滲透到更大的深度（模式人工組織實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1.85 cm深度時(shí)依然可以激發(fā)上轉(zhuǎn)換發(fā)光）。通過(guò)模擬計(jì)算和實(shí)驗(yàn)，比較980 nm和915 nm在細(xì)胞和組織中的熱分布和成像深度，均表明915 nm的激發(fā)光在生物（細(xì)胞、組織和動(dòng)物活體）成像中具有更深的成像深度和更低的熱損傷，如圖6所示。

圖6?。╝）915 nm和980 nm的激光照射老鼠活體表皮在1分鐘和3分鐘時(shí)的溫度空間分布情況，插圖為上轉(zhuǎn)換信號(hào)強(qiáng)度隨深度衰減圖；（b）915 nm激光激發(fā)下注射NaYbF4：Yb3+/Tm3+后老鼠活體成像圖（上），分別用anti-CEA8-PAH-MSA-NaYbF4：Yb3+/Ho3+，anti-CEA8-PAH-MSA-NaYbF4：Yb3+/ Er3+處理的癌細(xì)胞的成像圖（下）［59］Fig.6 （a）Temperature distributions after different ir-radiation times for 915 nm laser irradiated mouse skin and 980 nm laser irradiated mouse skin，the inset shows the intensity of the UC signal as a function of the depth of the UCNP inclusion；（b）in vivo whole body image of a NaYbF4：Yb3+/Tm3+injected nude mouse using 915 nm laserexcited（upper），in vitro cancer cell imaging of anti-CEA8-PAH-MSA-NaYbF4：Yb3+/ Ho3+，anti-CEA8-PAH-MSA-NaYbF4：Yb3+/Er3+u-sing 915 nm laser excited，respectively（bottom）［59］

大多數(shù)基于UCNPs的光學(xué)成像技術(shù)都采用激光共聚焦掃描模式，但掃描成像耗時(shí)長(zhǎng)，時(shí)間分辨率很低［57，58］。上轉(zhuǎn)換納米顆粒發(fā)光壽命長(zhǎng)（100μs～ms），單位時(shí)間內(nèi)單個(gè)稀土離子發(fā)出的光子數(shù)較少，從而導(dǎo)致在激光掃描成像過(guò)程需要較長(zhǎng)的掃描時(shí)間，難以做到快速成像和高效時(shí)間分辨跟蹤［58］。普通寬場(chǎng)成像在借助高靈敏的CCD的情況下可以實(shí)現(xiàn)較快速的成像，但縱向上的雜散光很明顯，嚴(yán)重影響成像的對(duì)比度和空間分辨率，明顯沒(méi)有掃描顯微鏡的成像效果好［56］。Zhan等人提出一種新穎的倏逝波（Evanescentwave，EW）激勵(lì)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針的模式，用于快速成像和UCNPs示蹤［60］。全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)（Total internal reflection microscopy，TIRM）是一種典型的基于倏逝波的熒光成像工具?；谫渴艌?chǎng)迅速衰減的特性，只有標(biāo)記在系統(tǒng)表面的熒光材料才會(huì)被強(qiáng)電磁場(chǎng)激發(fā)，而遠(yuǎn)處的熒光劑由于處在一個(gè)較弱的電磁環(huán)境，其光學(xué)特性并不能有效地表現(xiàn)出來(lái)，這不僅提高了樣品表面成像的縱向分辨率，還大大降低了空間雜散光。利用倏逝波激發(fā)，UCNPs的非線性發(fā)光特性與TIRM的結(jié)合可以得到非常好的縱向、橫向分辨率，不會(huì)對(duì)樣品造成損傷，非常適合應(yīng)用于單分子或細(xì)胞膜成像。實(shí)驗(yàn)證明，這種成像方法可以在大范圍內(nèi)以350幀每秒的速度同時(shí)追蹤數(shù)個(gè)粒子，實(shí)現(xiàn)超快速的成像、粒子追蹤和細(xì)胞成像，如圖7所示。

圖7　水溶液中快速粒子示蹤：（a）粒子的快速運(yùn)動(dòng)；（b）高成像速率記錄下的納米顆粒蹤跡圖［60］Fig.7 Rapid particle tracking inwater solution（a）the fastmovingof nanoparticles；（b）tracks of nano-particles in water solution with a very high imaging rate［60］

低的量子效率極大地阻礙的UCNPs的應(yīng)用，特別是在低功率激發(fā)下［65］。提高激發(fā)光功率在一定程度上能提高其量子效率［66］，但也帶來(lái)了更高的熱效應(yīng)等副作用。Liu等人采用高峰值功率的毫秒脈沖激光，增加了UCNPs的量子效率，即達(dá)到了理想的成像深度，又將數(shù)據(jù)采集速度提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，且有效地避免了高的熱效應(yīng)［67］。這種激發(fā)技術(shù)拓展了UCNPs在光學(xué)成像和治療領(lǐng)域的應(yīng)用。

3　氧化石墨烯

3.1光學(xué)性質(zhì)與優(yōu)勢(shì)

石墨烯自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其獨(dú)特的電子學(xué)、光學(xué)和力學(xué)等特性一直被廣大研究者所關(guān)注［68，69］。然而，石墨烯不能很好地分散在水溶劑中，限制了其在生物光子學(xué)中的研究。GO，作為石墨烯的一種衍生物，逐漸受到研究者的關(guān)注。GO主要由碳元素組成，表面帶有羧基、羥基等含氧基團(tuán)，從而表現(xiàn)為親水性，能夠很好的分散在水溶液中，為生物應(yīng)用提供了必不可少的條件。無(wú)細(xì)胞毒性，有較好的生物兼容性，此外由于羧基、羥基等基團(tuán)的存在，使得GO易于表面修飾、功能化等，大的比表面積使其具有較高的藥物和生物分子運(yùn)載能力，在藥物運(yùn)輸、生物治療等方面的具有一定的應(yīng)用潛力［70，71］。更值得一提的是，相比石墨烯本身，GO不同的是表面存在一些缺陷和含氧基團(tuán)，在量子限域效應(yīng)下使得GO產(chǎn)生了帶隙，因此GO材料能夠產(chǎn)生熒光現(xiàn)象用于生物成像研究，同時(shí)它還具有類似貴金屬納米顆粒的光熱效應(yīng)［70，72］。因此，GO作為一種光學(xué)探針被廣泛應(yīng)用于生物成像，作為一種運(yùn)載工具應(yīng)用于藥物運(yùn)輸，作為一種光熱轉(zhuǎn)換器應(yīng)用于光熱治療［73］。

3.2生物成像和光熱治療應(yīng)用

Li等人研究了雙光子激發(fā)下的轉(zhuǎn)鐵蛋白和PEG修飾的GO在細(xì)胞成像、人工組織成像和光熱治療中應(yīng)用［74］。GO的雙光子熒光激發(fā)帶較寬，降低了對(duì)激光器的要求。研究發(fā)現(xiàn)，在雙光子激發(fā)下，GO所需的功率僅僅是7 mW，低于細(xì)胞自發(fā)熒光和熒光素異硫氰酸所需功率（分別為35 mW和30 mW）。在此功率激發(fā)下，GO的成像深度達(dá)到0.1 mm，高于30 mW激發(fā)下的異硫氰酸成像深度（0.03 mm）。GO在雙光子激發(fā)下能用于光熱治療，僅需4 mW的激發(fā)功率就足矣產(chǎn)生明顯的療效，而沒(méi)有GO的細(xì)胞在35 mW激光激發(fā)下沒(méi)有明顯的細(xì)胞死亡。因此，GO有望成為一種適用于低功率的兼具深度成像和光熱治療的納米顆粒。

Qian等人利用飛秒激光激勵(lì)系統(tǒng)研究了GO的雙光子、三光子等非線性光學(xué)特性，并利用它作為熒光探針進(jìn)行了活體雙光子深層成像［75］。多光子熒光成像技術(shù)能減小光致漂白、提高成像分辨率和提高成像深度。飛秒脈沖激光具有較低的平均功率、巨大的峰值功率和相對(duì)較短的重復(fù)周期，在產(chǎn)生非線性效應(yīng)的同時(shí)最大限度地降低熱效應(yīng)，是一種理想的激發(fā)光源。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GO的雙光子、三光子熒光光譜與單光子激發(fā)具有相似的熒光峰，但長(zhǎng)波長(zhǎng)多光子激發(fā)能有效減小組織的吸收和散射，能實(shí)現(xiàn)較深層的成像。利用PEG修飾GO，使其能夠在生物環(huán)境中穩(wěn)定存在，合成的PEG-GO分別被運(yùn)用于細(xì)胞、老鼠血管和大腦的活體成像。離體細(xì)胞雙光子成像觀察到了其在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，實(shí)現(xiàn)了非特異性的癌細(xì)胞成像?；铙w老鼠雙光子熒光成像可追蹤到其在血管中的流動(dòng)、分布和外排等動(dòng)態(tài)信息（如圖8所示），并觀察到其在鼠腦中深達(dá)300微米的分布情況并3D重構(gòu)其分布圖。這些實(shí)驗(yàn)研究為于人們認(rèn)識(shí)GO的光學(xué)特性及其進(jìn)一步在生物光子學(xué)中應(yīng)用提供了非常有意義的參考依據(jù)。

圖8　靜脈注射GO納米顆粒后，老鼠耳血管區(qū)域雙光子掃描和單光子共聚焦熒光成像圖［75］Fig.8 In vivo two-photon scanning and one-photon confocal lum inescence imaging of intravenously injec-ted GO nanoparticles in a blood vessel of amice ear at various time points after samp le treatment［75］

4　總結(jié)與展望

納米金棒的LSPR光學(xué)特性使其廣泛應(yīng)用于生物傳感、暗場(chǎng)散射成像、熒光成像和表面增強(qiáng)拉曼散射、光動(dòng)力治療和生物傳感等技術(shù)中；上轉(zhuǎn)換納米顆粒具有無(wú)自發(fā)熒光、無(wú)漂白、無(wú)閃爍及超高的時(shí)空分辨率等明顯的優(yōu)勢(shì)，并且從材料合成、激發(fā)波長(zhǎng)和激勵(lì)方式選擇等方面優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了深度更大、損傷更小、時(shí)空分辨率更高、量子效率更大的光學(xué)生物成像；氧化石墨烯具有無(wú)細(xì)胞毒性、大的比表面積、光致發(fā)光等特性，應(yīng)用于生物雙光子、三光子熒光成像和活體雙光子深層成像。

盡管這些作為光學(xué)探針的納米顆粒具有許多優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用領(lǐng)域，但要應(yīng)用到實(shí)際的臨床診斷和治療上仍有許多困難需要一一克服：（1）納米顆粒的毒性，（2）光穩(wěn)定性和生物穩(wěn)定性較低，（3）對(duì)健康組織的損傷，（4）靶向標(biāo)記效率和探測(cè)能力不夠，（5）深層成像和探測(cè)能力不夠。制備不同結(jié)構(gòu)的納米顆?？梢愿淖兤涔鈱W(xué)性質(zhì)，表面修飾聚合物電解質(zhì)可以緩解其毒性、增加穩(wěn)定性和生物兼容性，表面修飾可以實(shí)現(xiàn)其靶向成像和治療，采用不同的激發(fā)方式可以減小對(duì)樣品的損傷和得到更好的成像效果。隨著納米科技、探測(cè)技術(shù)和生物技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的多功能化納米顆粒將成為光學(xué)探針，應(yīng)用到光學(xué)生物成像、臨床疾病的診斷和治療中。

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Using Som e Nanoparticles as Optical Probes for Optical Bioim aging

ZHAN Qiuqiang1，ZHANG Xin1，Li Xin2，HE Sailing1
（1.Centre for Optical and Electromagnetic Research，South China Normal University，Guangzhou 510006，Guangdong，China；2.Zhejiang Central Solar Technology Co.，Ltd.Hangzhou 310053，Zhejiang，China））

The employment of nanometric optical probes is powerful for bioimaging，disease diagnosis and therapy，es-pecially for the deep understanding of some dynamic biological processes at themolecular level.Optical probes such as gold nanorods（GNRs），upconversion nanoparticles（UCNPs）and graphene oxide（GO）can overcome many draw-backs of conventional optical agents.These nanoparticles possess high imaging contrast，stability and biocompatibility. Furthermor，they provide optical approaches for deep-tissue imaging and real-time dynam ic imaging.In this review pa-per，the optical properties and advantages of these nanoparticles are briefly introduced，and some of their applications in optical bioimaging，diagnosis and therapy are summarized based on some of the research progressmade by the authors and others.The prospects of their application are also discussed.

optical probes；nanoparticles；bioimaging

Q631

A

1007-7146（2015）03-0207-13

10.3969/j.issn.1007-7146.2015.03.001

2015-03-02；

2015-04-18

國(guó)家自然科學(xué)基金（61405062）；廣東省自然科學(xué)基金（S2013040014211，2014A030313445）；中國(guó)博士后科學(xué)基金（2013M530368，2014T70818）；廣東高校學(xué)科建設(shè)專項(xiàng)基金科研項(xiàng)目（2013LYM_0017）；華南師范大學(xué)青年教師培育基金（2012KJ017）；共青團(tuán)華南師范大學(xué)2013-2014年度學(xué)生課外科研重點(diǎn)課題科研項(xiàng)目（13GDKC02）

詹求強(qiáng)（1984-），男，博士，講師，研究方向?yàn)樯锕庾訉W(xué)。（電子郵箱）qiuqiang.zhan@coer-scnu.org