ILK介導(dǎo)TGF－β/Smad通路誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞－間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的研究＊

林 琳，鄭 晶，朱偉平

（中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東珠海519000）

腎臟纖維化是各種腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同病理特征，以大量基質(zhì)蛋白積聚和成纖維細(xì)胞增殖為主要的病理表現(xiàn)［1］。已有大量研究顯示，腎小管上皮細(xì)胞－間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT）在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［2］。TGF－β1通過TGF－β/Smad信號途徑上調(diào)整合素連接激酶（ILK），通過ILK調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、生存、分化和凋亡，從而引起細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的積聚是促進(jìn)腎臟纖維化的機(jī)制。已有研究報道，血管內(nèi)皮細(xì)胞－間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EndMT）在心臟和腫瘤相關(guān)的器官纖維化中起重要作用［3］，并且可能在腎臟纖維化發(fā)病機(jī)制中有重要作用。ILK作為TGF－β/Smad通路的下游效應(yīng)因子可能參與介導(dǎo)EndMT，但是對于ILK介導(dǎo)TGF－β/Smad信號通路誘導(dǎo)EndMT在腎臟纖維化中的作用卻鮮有報道。本文研究ILK在EndMT及其信號傳導(dǎo)通路中的作用，將進(jìn)一步闡明腎臟纖維化的發(fā)生機(jī)制，并為腎臟纖維化的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 原代人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞（HGEnC），購自美國Scien Cell公司。

1.2 儀器與試劑 胎牛血清、內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（美國Scien Cell公司），TGF－β1（美國Peprotech公司）；TGF－β1Ⅰ型 受 體 抑 制 劑 LY364749、ILK 抑 制 劑 QLT－0267（德國Merk公司），蛋白酶抑制劑（美國Roche公司），小鼠抗人E－cadherin、小鼠抗人α－SMA單克隆抗體、小鼠抗人成纖維細(xì)胞特異蛋白－1（FSP－1）單克隆抗體及小鼠抗人內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（CD31）單克隆抗體（美國Sigma公司），兔抗人磷酸化Smad 2/3（p－Smad2/3）多克隆抗體、兔抗人ILK 單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記羊抗鼠IgG（丹麥DAKO公司），總RNA提取試劑盒、Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Invitrogen公司），P－Smad2/3、ILK 及內(nèi)參GAPDH引物（上海鼎安生科科技有限公司）。引物及產(chǎn)物長度見表1。CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國SHELAB公司），EXL808全自動酶標(biāo)儀（美國 BIO－TEK公司），SYBR Green PCR Reagents、ABI 7500Real Time PCR System（美 國 ABI公司）。

表1 引物序列及產(chǎn)物長度

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 原代細(xì)胞按常規(guī)方法復(fù)蘇后，加入含有5%胎牛血清、內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，選取第2～4代細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞張至70%～80%融合，用無血清培養(yǎng)基靜止24h進(jìn)行同步化后進(jìn)行試驗(yàn)。將同步化后的細(xì)胞按照105個/mL濃度接種入6孔板中，每孔2mL。將HGEnC分為6組。A組（空白對照）、B組（TGF－β112.5ng/mL）、C組（TGF－β125.0ng/mL）、D 組（TGF－β1 50.0ng/mL）、E 組（TGF－β1 50.0ng/mL＋LY364749 5.0μmol/mL）、F 組（TGF－β1 50.0 ng/mL＋QLT－0267 5.0μmol/mL），每組設(shè)12個復(fù)孔。

圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的結(jié)果

1.3.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 各組細(xì)胞分別培養(yǎng)48、72h采用倒置相關(guān)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3.3 RT－PCR 以 RT－PCR 測定 P－Smad2/3、ILK mRNA表達(dá)水平。按照說明書提取試劑盒制備總RNA。取RNA樣品，用核酸分析儀進(jìn)行定量，測定260和280nm的吸光度（A）值，控制A260/A280在1.9～2.1。然后應(yīng)用ABI 7500Real Time PCR System進(jìn)行擴(kuò)增。使用基于內(nèi)參物GAPDH的相對定量分析，以2－△△Ct計(jì)算目的基因mRNA表達(dá)量。

1.3.4 Western－blot 以 Western－blot測定 P－Smad2/3、ILK及E－cadherin、CD31、α－SMA 和 FSP－1蛋白的表達(dá)。用 Trizol提取細(xì)胞總蛋白后BCA法測定蛋白濃度。采用凝膠電泳分離不同相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉1h，一抗4℃孵育過夜。漂洗3次后加入二抗室溫孵育2h。ECL化學(xué)發(fā)光、顯影和定影。用美國UVP公司LabWorks 4.5軟件對條帶進(jìn)行定量分析，以GAPDH為內(nèi)參，用目的蛋白吸光值與內(nèi)參吸光度值的比值代表目的蛋白的相對表達(dá)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TGF－β1在EndMT過程中的作用

2.1.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的結(jié)果 A組細(xì)胞多呈圓形和卵圓形。B組培養(yǎng)48h后已有部分轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，B組培養(yǎng)72h后更多內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，見圖1。

2.1.2 PCR結(jié)果 HGEnC與不同濃度 TGF－β1共同培養(yǎng)后P－Smad2/3和ILK mRNA水平顯著升高（P＜0.01），并且具有劑量依賴性（P＜0.01），見表2，圖2。

2.1.3 Western blots結(jié)果 HGEnC與不同濃度 TGF－β1共同培養(yǎng)后P－Smad2/3、ILK、α－SMA和 FSP－1蛋白水平顯著升高（P＜0.01），而 E－cadherin和 CD31水平顯著降低（P＜0.01），并且具有劑量依賴性（P＜0.01），見表3、圖3。

表2 各組細(xì)胞P－Smad2/3和ILK mRNA水平的比較（±s，n＝6）

表2 各組細(xì)胞P－Smad2/3和ILK mRNA水平的比較（±s，n＝6）

a：P＜0.01，與A組比較；b：P＜0.01，與B組比較；c：P＜0.01，與C組比較。

0.47±0.05 0.05±0.03 B組 0.63±0.06a 0.15±0.05a C組 0.84±0.08ab 0.26±0.04ab D組 1.30±0.09abc 0.48±0.06 ILK A組組別 P－Smad2/3 abc

圖2 PCR結(jié)果

2.2 ILK在 TGF－β1介導(dǎo)EndMT中的作用

2.2.1 PCR結(jié)果 TGF－β1Ⅰ型受體抑制劑LY364749均可顯著抑制 TGF－β1導(dǎo)致的P－Smad2/3和ILK mRNA水平的升高（P＜0.01）；ILK 抑制劑 QLT－0267均可顯著抑制 TGF－β1導(dǎo)致的ILK mRNA水平的升高（P＜0.01），但是對P－Smad2/3 mRNA無顯著影響（P＞0.05），見表4、圖4。

表3 各組細(xì)胞P－Smad2/3、ILK及E－cadherin、CD31、α－SMA和FSP－1蛋白水平的比較（±s，n＝6）

表3 各組細(xì)胞P－Smad2/3、ILK及E－cadherin、CD31、α－SMA和FSP－1蛋白水平的比較（±s，n＝6）

a：P＜0.01，與A組比較；b：P＜0.01，與B組比較；c：P＜0.01，與C組比較。

4±0.03 0.26±0.05 B組 1.23±0.10a 0.24±0.05a 0.52±0.05a 0.65±0.09a 0.32±0.05a 0.57±0.06a C組 1.57±0.16ab 0.46±0.08ab 0.42±0.03ab 0.54±0.07ab 0.39±0.04ab 0.86±0.09ab D組 2.54±0.21abc 0.86±0.11abc 0.32±0.05abc 0.43±0.06abc 0.73±0.06abc 1.76±0.12－SMA FSP－1 A組 0.98±0.08 0.12±0.03 0.68±0.04 0.84±0.09 0.2組別 P－Smad2/3 ILK E－cadherin CD31 α abc

圖3 Western blots結(jié)果

2.2.2 West blots結(jié)果 TGF－β1Ⅰ型受體抑制劑 LY364749均 可 顯 著 抑 制 TGF－β1 導(dǎo) 致 的 P－Smad2/3、ILK、α－SMA 和FSP－1蛋白水平的升高（P＜0.01），并且顯著抑制 E－cadherin和CD31蛋白水平的降低（P＜0.01）；ILK抑制劑 QLT－0267可顯著抑制TGF－β1導(dǎo)致的ILK、α－SMA和FSP－1蛋白水平的升高（P＜0.01），并且顯著抑制E－cadherin和CD31蛋白水平的降低（P＜0.01），但是對P－Smad2/3蛋白的抑制作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表5、圖5。

表4 3組細(xì)胞P－Smad2/3和ILK mRNA水平的比較（±s，n＝6）

表4 3組細(xì)胞P－Smad2/3和ILK mRNA水平的比較（±s，n＝6）

a：P＜0.01，與D組比較。

1.32±0.16 0.52±0.07 E組 0.84±0.09a 0.27±0.05a F組 1.29±0.07 0.31±0.06 ILK D組組別 P－Smad2/3 a

圖4 PCR結(jié)果

表5 3組細(xì)胞P－Smad2/3、ILK及E－cadherin、CD31、α－SMA和FSP－1蛋白水平的比較（±s，n＝6）

表5 3組細(xì)胞P－Smad2/3、ILK及E－cadherin、CD31、α－SMA和FSP－1蛋白水平的比較（±s，n＝6）

a：P＜0.01，與D組比較。

5±0.07 1.73±0.15 E 組 1.72±0.19a 0.48±0.09a 0.51±0.05a 0.61±0.06a 0.40±0.06a 0.94±0.11a F組 2.52±0.22 0.53±0.08a 0.44±0.04a 0.54±0.04a 0.44±0.06a 0.90±0.12－SMA FSP－1 D組 2.56±0.23 0.95±0.13 0.30±0.06 0.40±0.05 0.7組別 P－Smad2/3 ILK E－cadherin CD31 α a

圖5 Western blots結(jié)果

3 討 論

腎臟纖維化是多種腎臟疾病走向腎衰竭的共同途徑，是多種慢性腎病的共同病理基礎(chǔ)。既往認(rèn)為腎臟組織中肌成纖維細(xì)胞主要來源于局部固有成纖維細(xì)胞、骨髓源性細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞和EMT。2007年Zeiberg等［4］首次發(fā)現(xiàn)血管End－MT在心臟和腫瘤相關(guān)的器官纖維化中起重要作用。EndMT參與成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的堆積，提示EndMT可能是腎早期纖維化的主要原因［5］。EndMT可以被許多細(xì)胞和細(xì)胞因子所誘導(dǎo)，TGF－β被認(rèn)為是最重要的因子，在各種進(jìn)行性腎臟疾病發(fā)展為腎臟纖維化過程中發(fā)揮了重要作用，是引起腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化的主要介質(zhì)。ILK是一種絲氨酸－蘇氨酸蛋白激酶，近年來研究發(fā)現(xiàn)ILK與腎臟間質(zhì)纖維化具有密切的關(guān)系［6］。目前認(rèn)為ILK通過整合素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和TGF－β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。但是對于ILK介導(dǎo)TGF－β/Smad信號通路誘導(dǎo)EndMT的作用卻鮮有報道，因此本文對該過程中ILK介導(dǎo)TGF－β/Smad信號通路誘導(dǎo)的作用進(jìn)行研究。

在本研究中，TGF－β1與HGEnC共同培養(yǎng)后部分內(nèi)皮細(xì)胞已轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，因此初步提示 TGF－β1促進(jìn)了HGEnC的EndMT過程。近年來發(fā)現(xiàn)TGF－β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)從細(xì)胞膜傳入細(xì)胞核與基因表達(dá)偶聯(lián)依賴于Smad家族蛋白的調(diào)節(jié)，而P－Smad2/3是 TGF－β1/Smad信號通路中的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其mRNA和蛋白表達(dá)量則是TGF－β1/Smad信號通路激活程度的標(biāo)志［7］。TGF－β1與HGEnC共同培養(yǎng)后 PSmad2/3的mRNA和蛋白水平表達(dá)顯著升高，提示TGF－β1激活了HGEnC的TGF－β1/Smad信號通路。ILK是一種存在于細(xì)胞胞質(zhì)中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是參與細(xì)胞內(nèi)外信號傳導(dǎo)通路形成的重要介質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、生存、分化和凋亡［8］。本研究中TGF－β1與HGEnC共同培養(yǎng)后ILK的 mRNA和蛋白水平表達(dá)顯著升高，提示ILK參與HGEnC的End－MT過程。腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT會出現(xiàn)E－cadherin的丟失，以及表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞特異性的成纖維細(xì)胞特異性蛋白FSP－1、α－SMA等，從而轉(zhuǎn)分化為間質(zhì)成纖維細(xì)胞［9］，在本研究我們也觀察到HGEnC的EndMT過程出現(xiàn)類似現(xiàn)象。

綜上所述，TGF－β1可促進(jìn)腎小球內(nèi)皮－間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，TGF－β/Smad信號通路參與了該過程，ILK是其重要的下游效應(yīng)因子，可能在腎臟纖維化過程發(fā)揮重要作用。

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