不同動(dòng)物源性維氏氣單胞菌生物學(xué)特性比較研究

單曉楓 ，康元環(huán)，夏京津，龍繼兵，陳 龍，王 惠，曹 亮，孟慶峰，錢愛(ài)東

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林 長(zhǎng)春 130062）

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii，AV）是一種人-獸-魚(yú)共患病原菌，其廣泛存在于水體及土壤之中，是動(dòng)物腸道和自然生態(tài)系統(tǒng)的正常菌群之一[1]。該菌有致病性菌株與非致病性菌株之分，近年來(lái)，有關(guān)致病性菌株所引發(fā)的人、哺乳動(dòng)物、水生動(dòng)物疾病的報(bào)道逐漸增多，嚴(yán)重威脅了人類的健康，并給養(yǎng)殖業(yè)尤其是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的損失[2-6]。但是，有關(guān)維氏氣單胞菌的研究在國(guó)內(nèi)尚處于起步階段，尤其缺少系統(tǒng)性與深入性的研究。鑒于此，本試驗(yàn)選取8 株不同動(dòng)物源性的維氏氣單胞菌，并對(duì)其染色特性、理化特性、培養(yǎng)特性、耐藥性、不同pH值、溫度、滲透壓對(duì)其生長(zhǎng)的影響以及16SrRNA序列的相似性等生物學(xué)特性進(jìn)行比較研究，研究結(jié)果，將為維氏氣單胞菌的檢驗(yàn)檢疫、疾病預(yù)防奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為該菌的深入研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種 維氏氣單胞菌WL161 株（烏鱧源）、NJ4112-4株（鯽魚(yú)源）、NC4122-3株（草魚(yú)源）、NN725株（鯰魚(yú)源）、CY0806 株（鯉魚(yú)源），由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離并保存；CVCC3700 株（狐源），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；QXF0711B株（青蝦源）由浙江省淡水水產(chǎn)研究所潘曉藝副研究員惠贈(zèng)；標(biāo)準(zhǔn)株ATCC35624（人源）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、DL-2 000 DNAMarker，購(gòu)自TaKaRa 公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；RS鑒別培養(yǎng)基，購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；HE 培養(yǎng)基、S.S.培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基、BS培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管、抗菌藥物藥敏試紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 菌種的復(fù)蘇 將實(shí)驗(yàn)室保存的8株維氏氣單胞菌凍干粉，接種于TSB培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)18～24 h，將菌株復(fù)蘇，取該復(fù)蘇菌液劃線接種于RS鑒別培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)18～24 h 后挑取特征性菌落再次接種于TSB培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)18～24 h，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 菌體形態(tài)特征觀察 將復(fù)蘇并純化的8 株維氏氣單胞菌接種于TSB培養(yǎng)基中，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及老齡期時(shí)，進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡觀察其菌體形態(tài)。

1.5 理化特性 將復(fù)蘇的維氏氣單胞菌分別接種于微量生化反應(yīng)管中，其中CVCC3700株、ATCC35624標(biāo)準(zhǔn)株于37 ℃培養(yǎng)，其余菌株30 ℃培養(yǎng)，具體操作參見(jiàn)微量生化反應(yīng)管說(shuō)明書(shū)。

1.6 培養(yǎng)特性觀察 取復(fù)蘇的細(xì)菌分別劃線接種于HE 培養(yǎng)基、S.S.培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基、BS培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、RS培養(yǎng)基、TCBS培養(yǎng)基等8種不同瓊脂平板上，CVCC3700株、ATCC35624標(biāo)準(zhǔn)株于37 ℃培養(yǎng)24 h，其余菌株30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄菌落形態(tài)。

1.7 不同pH 值、溫度、滲透壓對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響將復(fù)蘇的菌液稀釋至一定濃度，接種于TSB培養(yǎng)基中，觀察不同pH 值、培養(yǎng)溫度、滲透壓等對(duì)不同源性維氏氣單胞菌生長(zhǎng)的影響，具體操作參照參考文獻(xiàn)[7]。

1.8 藥敏試驗(yàn) 選取22 種抗生素的藥敏紙片，分析不同源性維氏氣單胞菌對(duì)抗生素的耐藥性，具體操作按藥敏紙片說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.9 16SrRNA序列的測(cè)定與遺傳演化分析 以不同菌株的基因組DNA為模板，引物為細(xì)菌16SrRNA的通用引物（27F、1492R），進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLAST 進(jìn)行比對(duì)，并使用Mega4.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 菌體形態(tài)特征觀察 經(jīng)革蘭染色、鏡檢，8 株不同源性的維氏氣單胞菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體形態(tài)差異不大，均為革蘭陰性短桿菌、單在或成對(duì)、略有彎曲，部分菌株（CVCC3700 株、WL161 株）在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即呈現(xiàn)多形性、長(zhǎng)絲狀與短桿狀并存；在老齡培養(yǎng)物中均出現(xiàn)多形性現(xiàn)象，但長(zhǎng)絲狀菌體形態(tài)所占比例的多少、不同菌株存在一定差異。

2.2 理化特性 8 株不同維氏氣單胞菌菌株的理化特性基本一致，酒石酸鹽、明膠液化、D-甘露醇、賴氨酸脫羥酶、D-半乳糖、精氨酸雙水解酶、鳥(niǎo)氨酸脫羥酸、DNA酶、D-葡萄糖產(chǎn)酸、蔗糖、麥芽糖、ONPG、吲哚、V-P 試驗(yàn)、硝酸鹽還原、氧化酶等均為陽(yáng)性反應(yīng)；硫化氫、尿素水解、苯丙胺酸脫氨酶、乳糖、L-阿拉伯糖、甘油、肌醇、衛(wèi)茅醇等為陰性反應(yīng)；但枸櫞酸鹽利用、水楊素、七葉苷、M.R.等因菌株不同而存在差異。

2.3 培養(yǎng)特性觀察 8 株不同源性維氏氣單胞菌經(jīng)不同培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，分別呈現(xiàn)不同的菌落特征、且不同菌株在同一培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)基本一致（表1），但在RS鑒別培養(yǎng)基上：ATCC35624株菌落呈現(xiàn)暗綠色、CY0806 株菌落呈現(xiàn)黃色、其余呈現(xiàn)淡黃色菌落。

2.4 不同溫度對(duì)維氏氣單胞菌生長(zhǎng)的影響 將8株維氏氣單胞菌復(fù)蘇、稀釋至一定濃度、接種于TSB培養(yǎng)基中，分別于25 ℃、28 ℃、30 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，4 ℃培養(yǎng)7 d。結(jié)果如下：在25 ℃～40 ℃范圍內(nèi)，除ATCC35624 株、CY0806 株每毫升的活菌含量略有下降外，大多數(shù)菌株生長(zhǎng)良好；在42 ℃，所有菌株的生長(zhǎng)都略受到抑制，但仍可生長(zhǎng)繁殖；在4 ℃培養(yǎng)7 d，所有菌株均可生長(zhǎng)繁殖。

表1 維氏氣單胞菌在不同培養(yǎng)基的生長(zhǎng)特征

2.5 不同pH 值對(duì)維氏氣單胞菌生長(zhǎng)的影響 將復(fù)蘇的8 株維氏氣單胞菌接種于不同pH 值的TSB培養(yǎng)基中、30 ℃培養(yǎng)24 h，得到如下結(jié)果：所有菌株均可在pH 值6～9 范圍內(nèi)存活并生長(zhǎng)，少數(shù)菌株（WL161、CY0806）可以耐受pH 值為4、5 或10 的酸堿。

2.6 不同滲透壓對(duì)維氏氣單胞菌生長(zhǎng)的影響以氯化鈉添加量為滲透壓的試驗(yàn)量、接種復(fù)蘇的維氏氣單胞菌，結(jié)果顯示，所有菌株均可在氯化鈉含量為0%～4%的TSB中生長(zhǎng)良好、在6%氯化鈉中不能存活；部分菌株（ATCC35634、WL161、NN725、CY0806）可以耐受5%的氯化鈉含量。

2.7 藥敏試驗(yàn) 8 株維氏氣單胞菌均對(duì)青霉素G、克林霉素、萬(wàn)古霉素、多粘菌素B、氨芐西林、新生霉素等表現(xiàn)出耐藥性；對(duì)頭孢克肟、洛美沙星、頭孢曲松、奧復(fù)星、單環(huán)菌素等比較敏感；對(duì)其余的抗生素則因菌株差異、耐藥性也不盡相同；其中菌株NN725對(duì)多種抗生素表現(xiàn)出耐藥性（表2）。

2.8 不同動(dòng)物源維氏氣單胞菌16SrRNA基因遺傳演化分析 利用MEGA5.1 軟件對(duì)不同動(dòng)物源維氏氣單胞菌16SrRNA基因的遺傳演化進(jìn)行分析：ATCC35624、NC4122-3、WL161 親緣關(guān)系較近處于同一大分支；其余5 株聚成一簇、處于一大分支。

圖1 不同宿主來(lái)源維氏氣單胞菌16SrRNA基因進(jìn)化分析

3 討論

作為一種較新型的人-獸-魚(yú)共患病原菌，維氏氣單胞菌引發(fā)多種動(dòng)物疾病的報(bào)道日益增多[1-6]，但有關(guān)其生物學(xué)特性的報(bào)道并不多見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)室曾對(duì)一株鯉源維氏氣單胞菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步探討[7]，但不同源性維氏氣單胞菌的生物學(xué)特性是否相似，則尚未見(jiàn)研究報(bào)道。因此，本研究針對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的8 種不同動(dòng)物源性的維氏氣單胞菌生物學(xué)特性進(jìn)行研究，旨在為深入研究該菌提供一些數(shù)據(jù)支持。

表2 8株維氏氣單胞菌的耐藥性

本研究首先對(duì)其菌體形態(tài)進(jìn)行了初步觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，維氏氣單胞菌在老齡培養(yǎng)物中，多數(shù)菌株呈現(xiàn)多形性-即短桿狀與長(zhǎng)絲狀并存，其中CVCC3700株、WL161 株尤為明顯，其在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期就表現(xiàn)出了多形性。本實(shí)驗(yàn)室曾對(duì)環(huán)境中分離的維氏氣單胞菌菌體形態(tài)進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的多形性是一種比較常見(jiàn)的狀態(tài)，這種情況在其他氣單胞菌尚未發(fā)現(xiàn)，是否可以作為檢測(cè)維氏氣單胞菌的一個(gè)條件，仍需進(jìn)一步大量菌株進(jìn)行論證。

對(duì)維氏氣單胞菌的培養(yǎng)特性進(jìn)行了研究，從結(jié)果中可以看出，該菌可以在多種鑒別培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，這與本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)的研究結(jié)果相符[7]，但值得注意的是，不同源性的維氏氣單胞菌在RS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)與顏色并不一致，這提醒我們?cè)诜蛛x維氏氣單胞菌時(shí)，選用的鑒別培養(yǎng)基應(yīng)該慎重。

從不同培養(yǎng)溫度、pH值以及滲透壓對(duì)維氏氣單胞菌生長(zhǎng)影響的結(jié)果可以看出，維氏氣單胞菌可以在較為廣泛的溫度、鹽度較高或者無(wú)鹽的環(huán)境中存活并生長(zhǎng)；個(gè)別菌株還可以耐受較強(qiáng)的酸堿環(huán)境；尤其應(yīng)當(dāng)引起注意的是，維氏氣單胞菌可以在4 ℃條件下緩慢生長(zhǎng)，這與González-Rodríguez 與Castro-Escarpulli 的研究結(jié)果相符[8-9]。綜合維氏氣單胞菌耐受能力測(cè)定結(jié)果說(shuō)明，該菌的生存空間廣泛，不同環(huán)境中的動(dòng)物、人均有可能接觸、甚至患病，因此研究結(jié)果具有一定的公共衛(wèi)生意義。

8 株維氏氣單胞菌對(duì)抗生素的耐藥性結(jié)果不盡相同，可能與菌株來(lái)源不同有著直接關(guān)系。其中，鲇魚(yú)源NN725 株的耐藥種類較多，說(shuō)明抗生素的濫用會(huì)導(dǎo)致多重耐藥菌株的出現(xiàn)，這應(yīng)當(dāng)引起人們的足夠重視。

雖然8 株維氏氣單胞菌16SrRNA基因序列有著較高相似性，但仍然存在著一定差異，不過(guò)這種差異有著一定的隨機(jī)性，與動(dòng)物源性或者地域差異并不相關(guān)。

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