S.aureus 誘導(dǎo)的小鼠亞臨床型乳房炎乳腺病理變化試驗

敬曉棋，劉健鵬，馮 平，閆海龍，屈 雷

（1.榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，陜西 榆林719000 ；2.榆林市動物疫病預(yù)防控制中心，陜西 榆林 719000）

奶牛、奶山羊乳房炎的發(fā)生與飼養(yǎng)環(huán)境、營養(yǎng)水平、經(jīng)營管理、動物的遺傳、泌乳性能、胎次、傳染性微生物以及非傳染性環(huán)境微生物等多種因素有關(guān)的疾病，但微生物是導(dǎo)致動物乳房炎發(fā)生的最主要原因。奶山羊、奶牛乳房炎的乳腺內(nèi)感染，以典型的乳腺炎癥反應(yīng)和病理學(xué)變化為特征，常導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降和奶品質(zhì)的降低。此外，持續(xù)較長時間的急性炎癥常常造成泌乳性腺泡細胞損傷和組織的壞死，甚至永久性的產(chǎn)奶量下降。乳用動物乳房炎不僅嚴重影響奶產(chǎn)業(yè)發(fā)展，而且對人類的健康和食品安全造成巨大最威脅。

S.aureus是自然界廣泛存在的一種能夠引起人和動物多種疾病的病原微生物，是奶牛、奶山羊等乳用動物臨床和亞臨床型乳房炎最主要的病原菌之一[1]。由于S.aureus較弱的抗原性、耐藥菌株的不斷出現(xiàn)以及與乳腺之間復(fù)雜的相互作用等[2]，使S.aureus乳房炎的防控和研究工作進展較為緩慢。通過動物模型進行S.aureus乳房炎發(fā)生、發(fā)展過程及乳腺免疫機制的研究，可為乳房炎的預(yù)防、治療提供新的視角和有益的參考。

盡管奶牛、奶山羊是研究乳房炎和乳腺免疫機制的最佳模型動物，然而奶牛、奶山羊高昂的成本以及試驗對生產(chǎn)管理的影響，使其難以在乳房炎免疫機制研究中大量的用作模型動物，因此小鼠成為此類研究合適的選擇[2]。

本試驗擬以亞臨床乳房炎主要病原-S.aureus建立亞臨床小鼠乳房炎模型，并通過病理組織切片進行鑒定，為將來進行乳腺免疫等的相關(guān)研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小鼠 6 周齡的C57BL/6 小鼠，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，于西北農(nóng)林科技大學(xué)動醫(yī)學(xué)院動物中心飼養(yǎng)。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境恒溫（22°C）、恒濕，每天光照12 h，自由飲水和采食。小鼠適應(yīng)新環(huán)境1 周后，雌雄合籠交配。分娩后1 周時，仔鼠不少于5 只的母鼠用于S.aureus乳房炎模型建立。

1.2 菌株 本試驗所用金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是從陜西關(guān)中地區(qū)患慢性乳房炎的關(guān)中奶山羊乳汁分離，經(jīng)中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定為金黃色葡萄球菌，并由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物免疫學(xué)實驗室保存。

1.3S.aureus乳腺內(nèi)注射 33 只泌乳7～12 日齡C57BL/6 的小鼠用于本次試驗，其中30 只為試驗組，其余3 只為生理鹽水對照。參考Brouillette and Malouin[3]的實驗方法進行小鼠乳腺內(nèi)S.aureus注射，具體如下。乳腺內(nèi)注射前2 h 將小鼠與仔鼠分離，小鼠按150～200 mg/kg 的劑量腹腔注射氯胺酮，待小鼠麻醉后進行乳腺內(nèi)注射。將小鼠用紙膠帶仰面固定于泡沫板上，對其腹部第4 對和第5 對乳腺用70%酒精消毒，用32G 針頭通過乳導(dǎo)管將1×107CFU 的S.aureus緩慢注入乳腺，每個乳頭50 μL。對照組注射等量的無菌生理鹽水。小鼠放回籠子，自然蘇醒。

1.4 感染小鼠狀態(tài)觀察 分別于感染后2，4，8，12，18，24，36，48，60，72 h 觀察小鼠精神狀態(tài)、采食、飲水、眼睛有無分泌物及腹部有無腫脹等。

1.5 組織切片制作與觀察 制作好的組織切片在生物顯微鏡下觀察，并通過Nikon DS-U2/L2 Controler成像系統(tǒng)和NIS-Elements F 3.22 成像軟件（Nikon）拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染小鼠狀態(tài)觀察S.aureus感染乳腺組織后24 h 內(nèi)，小鼠精神狀態(tài)未見異常，采食、飲水表現(xiàn)正常；36 h 和48 h 時，小鼠精神略顯沉郁，有正常的采食和飲水行為，腹部略有腫脹；60 h 時小鼠精神狀態(tài)、飲水、采食均與正常小鼠無異，腹部中腫脹消失；72 h 時小鼠表現(xiàn)與60 h 相似，但腹部明顯扁平。48 h 時剖檢小鼠，乳腺呈淡粉紅色，切開乳腺組織后有少量乳汁滲出。

2.2 乳腺組織形態(tài)觀察 組織切片顯示，對照組小鼠乳腺結(jié)構(gòu)完整，連接緊密，腺泡腔充滿乳汁，除了乳腺上皮細胞外，乳腺組織內(nèi)無其他細胞存在（圖1）。乳腺感染S.aureus的小鼠，在感染后2 h 時乳腺組織結(jié)構(gòu)與對照相似，腺泡結(jié)構(gòu)完整，連接緊密，腺泡腔內(nèi)乳汁中可見個別淋巴細胞浸潤（圖2）；4 h 時腺泡腔淋巴細胞增多，腺泡壁可見向乳汁遷移的淋巴細胞（圖3）；8 h 時大量淋巴細胞向腺泡腔內(nèi)遷移，乳汁中出現(xiàn)較多淋巴細胞（圖4）；12 h（圖5）、18 h（圖6）時，乳腺形態(tài)與8 h相似，但出現(xiàn)大量淋巴細胞向腺泡腔內(nèi)遷移，乳汁中出現(xiàn)大量淋巴細胞；24 h（圖7）、36 h（圖8）時腺泡腔出現(xiàn)大量的淋巴細胞，但少數(shù)細胞形態(tài)不完整，可能是衰老或死亡的細胞；48 h 時乳腺質(zhì)存在大量免疫細胞浸潤（圖9）；60 h 時乳腺質(zhì)存在大量免疫細胞浸潤，部分乳腺上皮被脂肪組織所替代（圖10）；72 h 時，乳腺組織加劇退化，腺泡萎縮、裂解，較多上皮被脂肪組織替代（圖11）。

3 討論

3.1 小鼠乳房炎模型 盡管反芻動物和嚙齒動物類在乳腺上存在一些差異，但小鼠仍然是研究乳腺免疫和病理反應(yīng)的最理想的模型動物，也是最為經(jīng)濟的研究模型。目前，小鼠模型已逐漸應(yīng)用于多種不同病原菌或菌體成分誘導(dǎo)的乳房炎的乳腺病理、免疫反應(yīng)機制及乳房炎控制等方面的研究，特別是S.aureus和E.coli等病原性乳房炎的研究[3-4]。Chandler[5]首次成功的建立了小鼠S.aureus乳房炎模型，并進行了病理組織學(xué)等鑒定和研究。此后，小鼠乳房炎模型開始逐漸應(yīng)用于S.aureus乳腺內(nèi)感染的病理組織學(xué)[6]、細菌毒力因子作用[7]、乳房炎疫苗免疫保護[8]及抗生素治療[9]等研究。

S.aureus主要引起奶牛和奶山羊的慢性、亞臨床型乳房炎，而以小鼠為模型的乳房炎研究多是建立急性型模型，檢測時間也基本上在24 h 以內(nèi)。Tuchscherr，Buzzola，Alvarez，Caccuri，Lee and Sordelli[10]等建立了慢性的小鼠乳房炎模型，試驗在感染后持續(xù)進行了12 d 的指標檢測，但他們所用的菌株為缺失CP5 和CP8 嚢膜多糖的S.aureus株，并不能完全反映乳腺對S.aureus正常的免疫應(yīng)答。本試驗所用菌株為陜西省關(guān)中地區(qū)奶山羊亞臨床型乳房炎乳汁分離所得，經(jīng)鑒為正常的S.aureus，并成功建立亞臨床型的小鼠乳房炎模型。

圖1 對照組小鼠乳腺結(jié)構(gòu)完整，上皮細胞連接緊密，腺泡內(nèi)充滿乳汁

圖2 S.aureus感染后2 h,腺泡結(jié)構(gòu)完整，乳汁中可見個別免疫細胞

圖3 S.aureus感染后4 h，腺泡腔內(nèi)存在少量淋巴細胞，腺泡壁上看見遷移的免疫細胞

圖4 S.aureus感染后8 h，腺泡腔有較多淋巴細胞浸潤，腺泡壁大量遷移免疫細胞

圖5 S.aureus感染后12 h，腺泡腔有大量淋巴細胞浸潤，腺泡壁存在大量遷移免疫細胞

圖6 S.aureus感染后18 h，腺泡腔有較多淋巴細胞浸潤，腺泡壁大量遷免疫細胞

圖7 S.aureus感染后24 h，腺泡腔出現(xiàn)大量的免疫細胞

圖8 S.aureus感染后36 h，腺泡腔出現(xiàn)大量的免疫細胞

圖9 S.aureus感染后48 h，腺泡間質(zhì)出現(xiàn)大量的免疫細胞浸潤

圖10 S.aureus感染后60 h，腺泡間質(zhì)有免疫細胞浸潤，腺泡腔存在免疫細胞

圖11 S.aureus感染后72 h，乳腺組織萎縮、退化，部分乳腺上皮被脂肪組織所替代

3.2 金黃色葡萄球菌性乳房炎 引起奶牛、奶山羊乳房炎的微生物包括革蘭陰性腸桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、諾卡菌屬、克萊伯菌屬及支原體等137 種[11]，但大腸桿菌、金黃色葡萄球菌是臨床中最為常見病原。乳房炎病原調(diào)查顯示，乳腺內(nèi)感染大腸桿菌時一般表現(xiàn)為急性的臨床型乳房炎，具有典型的乳房腫脹、發(fā)熱、疼痛、乳汁黏稠、變黃等局部炎癥反應(yīng)，嚴重的還表現(xiàn)全身性癥狀[12]。而S.aureus的乳腺內(nèi)感染既可以引起急性的、臨床型乳房炎，但大多數(shù)情況下為慢性的、亞臨床型的隱性乳房炎。亞臨床型乳房炎除乳中體細胞數(shù)增多、乳品質(zhì)改變外，一般無明顯的乳腺局部或全身性炎癥反應(yīng)，只有通過實驗室檢測才能夠確診。臨床中以S.aureus性隱性乳房炎多見，且由于其無明顯的臨床和病理學(xué)變化以及長期的抗生素治療，而導(dǎo)致養(yǎng)殖場巨大的經(jīng)濟損失，并對人的食品安全和健康構(gòu)成巨大的威脅。

本試驗以S.aureus為乳腺感染病原，利用C57BL/6 小鼠建立了小鼠S.aureus性亞臨床乳房炎模型。小鼠乳腺內(nèi)注射S.aureus后24 h 內(nèi)，小鼠精神狀態(tài)未見異常，采食、飲水表現(xiàn)正常；36 h和48 h 時，小鼠精神略顯沉郁，有正常的采食和飲水行為，腹部略有腫脹；60 h 時小鼠精神狀態(tài)、飲水、采食均與正常小鼠無異，腹部中腫脹消失；72 h 時小鼠表現(xiàn)與60 h 相似，但腹部明顯扁平。整個試驗期間，小鼠未出現(xiàn)腹部明顯腫脹、發(fā)紅、精神沉郁等臨床乳房炎的局部和全身癥狀，在一定程度上表明我們成功的建立了小鼠S.aureus性亞臨床乳房炎模型。

病理組織切片結(jié)果顯示，對照組小鼠乳腺結(jié)構(gòu)完整，連接緊密，腺泡腔充滿乳汁，除乳腺上皮細胞外，乳腺內(nèi)未見其他細胞存在（圖3）。感染后2 h 無對照小鼠乳腺組織結(jié)構(gòu)完整，但乳汁中以可見個別免疫細胞（圖4），表明S.aureus感染乳腺2 h 即有免疫細胞趨化進入組織。乳腺內(nèi)注射S.aureus后4 h、8 h、12 h 和18 h 可見腺泡腔內(nèi)免疫細胞逐漸增多，且有大量的細胞突出于腺泡壁內(nèi)（圖5，6，7，8），可能是正在遷移的免疫細胞，表明感染S.aureus18 h 內(nèi)，乳腺的天然免疫防御啟動并逐漸加強。感染S.aureus后24 h、36 h 腺泡腔內(nèi)可見到大量的免疫細胞（圖9，10），48 h、60 h 乳腺間質(zhì)出現(xiàn)明顯的免疫細胞浸潤，部分乳腺組織開始萎縮（圖11，12），這可能是細菌感染后天然免疫反應(yīng)完全啟動，免疫細胞清除侵入的病原微生物和死亡細胞。S.aureus乳腺內(nèi)注射后72 h，乳腺組織繼續(xù)退化、萎縮，此時不能夠從組織切片區(qū)分出上皮細胞和免疫細胞（圖1）。

本試驗中，S.aureus感染乳腺組織后72 h 內(nèi)，小鼠外觀無明顯改變，僅有輕微的局部癥狀，也無全身癥狀出現(xiàn)，組織切片顯示2 h 即開始有免疫細胞進入乳腺，并隨時間浸潤細胞逐漸增多，表明我們成功建立起S.aureus性小鼠亞臨床型乳房炎，可用于乳房炎早期天然免疫和其后適應(yīng)性免疫及其他的相關(guān)研究。

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