多肽疫苗對(duì)豬圓環(huán)病毒2 型的免疫保護(hù)效果研究

劉博奇 ，陳善真，李中圣，羅 均，陳克宏，王貴平，李其昌

（1.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣東 廣州511400 ；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東 廣州 510642）

豬圓環(huán)病毒2 型（Porcine Circovirustype 2，PCV-2）是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原，其感染后破壞動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致其嚴(yán)重的免疫抑制，進(jìn)而誘發(fā)多種混合感染和繼發(fā)感染，嚴(yán)重影響疾病的診斷和治療，已成為世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。大量的行業(yè)養(yǎng)殖現(xiàn)狀和試驗(yàn)研究表明，疫苗注射是控制圓環(huán)病毒2 型感染的有效手段，因此國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)該病的疫苗研制展開(kāi)了大量研究，并取得了顯著成果。目前市售的PCV-2 商品化疫苗主要為滅活疫苗及亞單位疫苗，這兩種疫苗的上市對(duì)我國(guó)防控PCV-2 感染發(fā)揮了重大作用，其優(yōu)點(diǎn)是性能穩(wěn)定、使用安全、易保存等，但同時(shí)也存在疫苗生產(chǎn)成本高、病毒難以培養(yǎng)等困難。由于PCV-2 疫苗在傳統(tǒng)制備方法上尚存在缺陷，因此開(kāi)發(fā)高效低廉的新型疫苗也逐漸被關(guān)注。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者將注意力轉(zhuǎn)移至亞單位和多肽疫苗的研究，多肽抗原作為完整病毒蛋白的一部分，其不具備傳染疾病的危險(xiǎn)性，并且可以大量合成生產(chǎn)，因此已成為疫苗研究開(kāi)發(fā)的重要內(nèi)容之一。

本試驗(yàn)根據(jù)已研發(fā)的非蛋白多糖多聚體定位耦聯(lián)PCV-2 B、T 細(xì)胞免疫活性表位多肽作為抗原，免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取得了較好的免疫保護(hù)效果。同時(shí)該技術(shù)也可為其他獸用抗病毒生物制品的研發(fā)提供思路和借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及動(dòng)物 體液病毒核酸少量提取試劑盒為美國(guó)愛(ài)思進(jìn)產(chǎn)品；多肽由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成；市售圓環(huán)病毒2 型疫苗為德國(guó)勃林格產(chǎn)品；免疫佐劑為廣州鼎國(guó)生物制劑產(chǎn)品；豬圓環(huán)病毒2 型抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自武漢科前動(dòng)物生物制品公司；35 日齡仔豬20 頭，購(gòu)自廣東某豬場(chǎng)育種管理中心；豬圓環(huán)病毒2 型由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院張桂紅教授饋贈(zèng)。

1.2 耦聯(lián)多肽疫苗的制備與鑒定 通過(guò)化學(xué)合成技術(shù)制備幾段含有抗原表位的多肽，序列及出處分別為：PSWAVDMMRFNINDFLPPGGGSN（Cap 65-87）、QGDRGVGSTAVILDDNFVTKANALTYDPY VNYSS（Cap113-146）、SRYFTPKPVLDRTIDYFQPN NKRNQL（Cap158-183）、DHVGLGTAFENSKY（Cap 194-207）。用本項(xiàng)目組發(fā)明的非蛋白多聚體定位耦聯(lián)B、T 細(xì)胞免疫活性表位多肽技術(shù)，制備圓環(huán)病毒2 型多肽疫苗。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物分組及免疫程序 試驗(yàn)分為4 個(gè)組，分別為耦聯(lián)多肽疫苗免疫組、市售疫苗免疫對(duì)照組、免疫佐劑對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組5 頭仔豬。耦聯(lián)多肽疫苗組和免疫佐劑對(duì)照組的免疫劑量為2.0 mL/頭，市售疫苗組的免疫劑量為1.0 mL/頭，空白對(duì)照組不免疫。肌肉注射，分3 次免疫，首免（d1），二免（d8）和末次免疫（d23）。

1.4 血清特異性抗體檢測(cè) 分別于首次免疫前（d0）、免疫后每周（d8、d15、d22、d29、d36）抽取血液1 次，用ELISA方法進(jìn)行抗體檢測(cè)，觀察抗體產(chǎn)生情況，當(dāng)抗體滴度趨于平穩(wěn)時(shí)進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。

1.5 攻毒試驗(yàn) 于攻毒前3 天（d38）對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行免疫刺激。方法：每頭豬兩側(cè)腋下及臀部肌肉注射1 mL經(jīng)弗氏不完全佐劑乳化的KLH（0.5 mg/mL）、腹腔注射巰基乙酸培養(yǎng)基1.0 mL/頭。攻毒（d41）：圓環(huán)病毒培養(yǎng)液（106TCDI50）滴鼻1.0 mL/頭并肌肉注射2.0 mL/頭。攻毒后第4 天（d44）同d38 天方法進(jìn)行免疫刺激處理。在攻毒后第11 天（d51）和第19天（d59），所有豬腹腔注射巰基乙酸培養(yǎng)基1.0 mL/頭。若攻毒后出現(xiàn)瀕死或死亡的豬，及時(shí)剖檢觀察其肺、腹股溝及腸系膜淋巴結(jié)變化，并分離肺臟及淋巴結(jié)，分別冰凍保存和4%中性福爾馬林固定液進(jìn)行組織固定；存活的豬則在攻毒后第32 天（d72）進(jìn)行處死，并留取所需組織。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及數(shù)據(jù)處理

1.6.1 臨床癥狀觀察 每天觀察并記錄其食欲、被毛、皮膚、排便、行動(dòng)及其他異常等情況，直至動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.6.2 體征檢測(cè) 分別于免疫當(dāng)日（d1）、攻毒當(dāng)日（d41）和宰殺當(dāng)日（d72）稱量所有豬的體重，計(jì)算各組在不同試驗(yàn)階段的增重情況。于攻毒當(dāng)日開(kāi)始記錄體溫，每天上午10 點(diǎn)鐘測(cè)定，直至體溫未見(jiàn)明顯升高，恢復(fù)平穩(wěn)為止。

1.6.3 Real-time RCR 檢測(cè) 分別于攻毒前3 d（d38）、攻毒后每周（d48、d55、d62、d69、）抽血一次，用Real-time RCR 方法檢測(cè)攻毒后不同階段血液內(nèi)的病毒含量。于動(dòng)物宰殺時(shí)（d72）取新鮮肺及淋巴結(jié)組織，檢測(cè)組織中病毒含量。

1.6.4 組織病理學(xué)檢查 對(duì)福爾馬林固定的肺及淋巴結(jié)進(jìn)行常規(guī)石蠟切片及H.E.染色，并進(jìn)行讀片觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性抗體檢測(cè)結(jié)果 免疫前（d0）抽血檢測(cè)所有樣本豬圓環(huán)病毒2 型抗體均為陰性，首次免疫后1 周（d8），耦聯(lián)多肽疫苗免疫組和市售疫苗免疫對(duì)照組大部分樣本檢測(cè)到抗體，二免后，抗體水平呈上升趨勢(shì)，經(jīng)過(guò)加強(qiáng)免疫后，第4 周（d29）抗體滴度水平達(dá)到最高，第5 周（d36）檢測(cè)抗體水平趨于平穩(wěn)（見(jiàn)圖1）。

圖1 不同免疫階段特異性抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2 臨床癥狀 4個(gè)試驗(yàn)動(dòng)物組在免疫前及攻毒前，動(dòng)物的食欲、被毛、皮膚、行動(dòng)及精神狀態(tài)等觀察均正常。攻毒后，耦聯(lián)多肽疫苗和市售疫苗兩個(gè)免疫組臨床觀察未見(jiàn)明顯異常；免疫佐劑對(duì)照組和空白對(duì)照組分別在攻毒后第9天和第7天出現(xiàn)精神委靡、被毛雜亂等，過(guò)2～3 d 開(kāi)始嘔吐、水便、投食前臥地不起，空白對(duì)照組在攻毒后第11 天、第12 天早上各有1 例動(dòng)物便血，中午發(fā)現(xiàn)死亡。

2.3 攻毒前后體征變化 免疫后至攻毒前，各個(gè)組的整體增重較平均，組間未見(jiàn)明顯差異。攻毒后至宰殺前，耦聯(lián)多肽疫苗組及市售疫苗組兩組的增重略有下降，但與攻毒前差別不大；而對(duì)照兩組的增重則明顯下降（見(jiàn)圖2）。

圖2 不同試驗(yàn)階段各組平均增重

攻毒第2 天，各組體溫均有升高，但免疫佐劑對(duì)照組及空白對(duì)照組體溫升高明顯。至攻毒后第10 天，多肽疫苗及市售疫苗組體溫趨于平穩(wěn)，恢復(fù)至攻毒前水平；對(duì)照兩組的體溫較攻毒前仍略偏高（見(jiàn)圖3）。

圖3 攻毒后各組動(dòng)物的平均體溫變化趨勢(shì)

2.4 Real-time PCR 檢測(cè)結(jié)果 4 個(gè)組在攻毒前及攻毒后1 周、2 周的血液內(nèi)均未檢測(cè)出病毒，攻毒后3 周和4 周在空白對(duì)照組和免疫佐劑對(duì)照組分別檢測(cè)出較高含量的病毒，而疫苗免疫兩組未檢測(cè)出。攻毒試驗(yàn)結(jié)束后，佐劑及空白對(duì)照組均在肺及淋巴結(jié)組織中檢測(cè)到較高含量的病毒，而疫苗免疫兩組亦未在組織中檢測(cè)到病毒。

2.5 組織病理學(xué)檢查結(jié)果 耦聯(lián)多肽疫苗及市售疫苗免疫兩組的易感組織：肺臟和淋巴結(jié)大體觀察未見(jiàn)明顯異常；組織學(xué)觀察未見(jiàn)明顯病變（見(jiàn)中插彩版圖4A-D）。免疫佐劑及空白對(duì)照兩組：大體觀察見(jiàn)肺臟腫脹、呈灰褐色彌漫性病灶、質(zhì)硬，淋巴結(jié)腫大、切面質(zhì)硬；組織學(xué)觀察見(jiàn)肺組織細(xì)胞及巨噬細(xì)胞增生、彌散性肺泡壁增厚、局灶性肉芽腫性間質(zhì)肺炎（見(jiàn)中插彩版圖7E、G）；淋巴結(jié)皮質(zhì)區(qū)淋巴小結(jié)排列疏松、淋巴細(xì)胞減少，副皮質(zhì)區(qū)可見(jiàn)上皮樣細(xì)胞，胞漿內(nèi)見(jiàn)嗜酸性包涵體（見(jiàn)中插彩版圖7F、H）。具體病理組織圖片見(jiàn)圖4。

3 討論

本研究所用的多肽疫苗是根據(jù)PCV-2 病原體抗原基因中已知和預(yù)測(cè)的某段抗原表位的氨基酸多肽序列，耦聯(lián)到大分子多糖載體上所得到的多肽。大分子量載體作用是增強(qiáng)其免疫效果，傳統(tǒng)方法是應(yīng)用戊二醛等連接分子法將有效抗原肽接到載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）、人血清白蛋白（HSA）、卵清蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）及破傷風(fēng)類毒素（TT）上，但是此類抗原肽-載體復(fù)合疫苗中的載體蛋白通常為異體蛋白，因此在免疫接種時(shí)容易引起炎癥或過(guò)敏反應(yīng)，還會(huì)影響抗原肽的特異性，因此選擇一種無(wú)過(guò)敏反應(yīng)的載體尤為關(guān)鍵。本研究所采用的載體是優(yōu)選的具有可耦聯(lián)基團(tuán)的非蛋白多聚體，與免疫活性多肽耦聯(lián)，制備成耦聯(lián)多肽疫苗，試驗(yàn)驗(yàn)證其不但具有顯著的免疫活性及穩(wěn)定性，還避免了傳統(tǒng)多肽-載體蛋白疫苗所引起的炎癥或過(guò)敏反應(yīng)等毒副作用，極大的提高了多肽疫苗的安全性和特異性，且其具有制備工藝簡(jiǎn)單、成本低、質(zhì)量可靠等優(yōu)點(diǎn)，利于規(guī)?；a(chǎn)。

體液免疫效果是疫苗免疫評(píng)價(jià)重要標(biāo)準(zhǔn)之一，本試驗(yàn)針對(duì)PCV-2 特異性抗體進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，其結(jié)果表明，本研究制備的耦聯(lián)多肽疫苗具有與市售疫苗相似的免疫效果，可以有效提高機(jī)體體液免疫能力。臨床癥狀觀察及體征檢測(cè)同樣可以對(duì)疫苗免疫效果做出客觀評(píng)價(jià)，臨床觀察經(jīng)多肽疫苗免疫的豬在攻毒后未見(jiàn)發(fā)病及死亡，增重及體溫檢測(cè)也說(shuō)明攻毒后的多肽疫苗組動(dòng)物體征與對(duì)照組變化差異明顯，與攻毒前體征水平相當(dāng)，表明耦聯(lián)多肽疫苗臨床免疫具有良好的保護(hù)效果。

豬感染PCV-2 后，不但可以通過(guò)胎盤進(jìn)行垂直傳播，還可經(jīng)鼻液和糞便進(jìn)行水平傳播，該病毒對(duì)環(huán)境理化因子抵抗力極強(qiáng)，在酸性及高溫環(huán)境下同樣可以存活一定時(shí)間。因此，有效減少排毒量，減短帶毒血癥時(shí)間，是評(píng)價(jià)PCV-2 疫苗的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)攻毒后不同階段的各組動(dòng)物血液內(nèi)病毒含量，表明經(jīng)多肽疫苗免疫的豬能夠有效抑制病毒血癥的發(fā)生。同時(shí)，病毒可存在于機(jī)體多個(gè)器官，并導(dǎo)致相應(yīng)器官的功能異常，其中淋巴結(jié)和肺臟是PCV-2 病毒復(fù)制的重要的器官，感染后不但可以造成呼吸功能障礙，更重要的是可以引起機(jī)體免疫抑制，為其他病原的感染提供途徑，因此，高效PCV-2 疫苗應(yīng)該具有有效減少淋巴結(jié)、肺臟等病毒靶器官內(nèi)病毒滴度的能力。本試驗(yàn)在耦聯(lián)多肽疫苗免疫組的淋巴結(jié)及肺臟組織樣本中未檢測(cè)出病毒，表明該多肽疫苗具有良好的阻斷病毒感染靶器官的能力。病理學(xué)觀察結(jié)果同樣表明，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫該耦聯(lián)多肽疫苗后，與對(duì)照組相比較，淋巴結(jié)和肺臟未出現(xiàn)病理變化，再次說(shuō)明，本研究所用耦聯(lián)多肽疫苗可以有效抑制PCV-2 病毒在靶器官內(nèi)的復(fù)制，并減少病毒所致的病理變化，避免機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制、呼吸功能障礙等臨床癥狀。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，PCV-2 耦聯(lián)多肽疫苗具有較好的免疫效果及保護(hù)率。作為一種候選新型疫苗，其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)能為企業(yè)和市場(chǎng)帶來(lái)新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)與競(jìng)爭(zhēng)力，市場(chǎng)空間巨大。同時(shí)該疫苗的研制方法也可為其他相關(guān)疾病疫苗的研制提供重要的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，對(duì)我國(guó)動(dòng)物疫苗的研發(fā)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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