新型鴨呼腸孤病毒S組基因克隆及序列分析

卿柯香，袁遠(yuǎn)華，郭霄峰，黃淑堅

根據(jù)國際病毒分類委員會第九次報告，正呼腸孤病毒屬依然分3 個亞群：第Ⅰ亞群包括不含融合基因的哺乳動物呼腸孤病毒（Mammalian reoviruses，MRV）；第Ⅱ亞群包括具有融合基因的禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）和內(nèi)爾森海灣病毒（Nelson Bay virus，NBV）；第Ⅲ亞群包括狒狒呼腸孤病毒（Baboon reovirus，BRV）；從蛇分離到的兩株呼腸孤病毒暫且將其歸為第Ⅳ亞群[1-2]。其中禽呼腸孤病毒包含雞源、火雞源、鵝源、番鴨源的呼腸孤病毒。

新型鴨呼腸孤病毒（New-type duck reovirus，NDRV）病，是一種以肝臟不規(guī)則壞死、出血斑/點和心肌、腔上囊出血為主要特征的新疫病，各品種鴨（如番鴨、半番鴨、麻鴨、北京鴨等）均可感染發(fā)病。該病病原為呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬，一種分節(jié)段的dsRNA病毒[3]。NDRV含有10個RNA片段，即3 個大基因Ll、L2、L3，分別編碼λA、λB、λC3 種蛋白；3 個中基因M1、M2、M3，分別編碼μA、μB和μN(yùn)S5 種蛋白；4 個小基因S1、S2、S3 和S4，分別編碼P10、P18、σC、σA、σB和σNS6 種蛋白[4]。

本實驗室從臨床病料分離到1 株新型鴨呼腸孤病毒，并命名為NDRV-QY 株[5]。為了解QY 株病毒與其他正呼腸孤病毒的遺傳進(jìn)化關(guān)系，本試驗將QY 株的S組基因核苷酸序列與國內(nèi)外參考毒株進(jìn)行了比對和分析，以初步明確該株病毒的分類地位。

1 材料與方法

1.1 病毒株及工程菌 新型鴨呼腸孤病毒（NDRVQY）、工程菌大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院傳染病室提供。

1.2 主要試劑 RNAiso Reagent，購自美國Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix ExTaqTMVersion2.0、pMD18-T 載體、DNAMarker（DL-2 000），均購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒E.Z.N.A.Gel Extraction Kit（2000）為OMEGA公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物的設(shè)計與合成 參照GenBank 中登錄的NDRVS1、S2、S3 和S4 基因序列（JX478256、JF320803、GQ888710、GU338025），用Primer Primer5.0 軟件設(shè)計合成了覆蓋S1、S2、S3 和S4 基因開放閱讀框的多對特異性引物（見表1）。

表1 引物序列

1.4 病毒S組基因RT-PCR 擴(kuò)增 按RNAiso Reagent 操作說明書提取病毒總RNA，隨機(jī)引物和AMV反轉(zhuǎn)錄后作為模板，采用見表1 中引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃4 min；94 ℃50 s，55 ℃50 s，72 ℃1 min 20 s；進(jìn)行30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠純化與回收PCR 產(chǎn)物，連接至pMD18-T 載體中，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，鋪氨芐抗性LB瓊脂平板37 ℃倒置培養(yǎng)，經(jīng)鑒定后挑取陽性菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 S組基因核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸序列分析利用DNAStar（Version 7.10）軟件對測定的病毒核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列與GenBank 中收錄的正呼腸孤病毒屬成員的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸的序列進(jìn)行同源性比對和分析。

2 結(jié)果

2.1 S1、S2、S3 基因和S4 基因的RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果 利用S組各段基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果與預(yù)期相符。利用DNAStar 軟件進(jìn)行序列拼接，QY 株S1、S2、S3 基因和S4 基因核苷酸編碼區(qū)序列已登錄在GenBank 中，登錄號分別為：KF689545、JQ863359、JQ866923、JQ922269。

2.2 S組基因編碼區(qū)cDNA核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列的比較分析 S1 基因為多順反子，編碼區(qū)全長1 517bp，3 個部分重疊開放性閱讀框（ORF）分別編碼p10 蛋 白（ORF 為294，編 碼97aa），功能未知的p18 蛋白（ORF 為489 bp，編碼162aa）和σC蛋白（ORF 為966 bp，編碼321aa）。DRV-QY 株σC蛋白編碼區(qū)核苷酸序列與DRV的相似性為95.5%～97.5%，與MDRV的相似性為51.3%～52.3%，與ARV的相似性只有39.4%～40.9%。氨基酸序列相似性顯示，DRV-QY 株與DRV的氨基酸序列相似性為96.0%～97.2%，與MDRV的相似性為42.6%～43.0%，與ARV的相似性為27.0%～29.9%。

S2 基因ORF 全長1 251 bp，編碼由416 個氨基酸組成的σA蛋白。DRV-QY 株σA蛋白編碼區(qū)核苷酸序列與DRV的相似性為88.1%～99.5%，與MDRV的相似性為85.8%～91.2%，與ARV的相似性為73.3%～74.8%。

S3 基因ORF 全長1 104 bp，編碼由367 個氨基酸組成的σB蛋白。和氨基酸序列相似性分析表明，DRV-QY 株σB蛋白編碼區(qū)核苷酸序列與DRV的相似性為96.6%～98.6%，與MDRV的相似性為66.5%～66.8%，與ARV和TRV的相似性為64.7%～67.6%。氨基酸序列相似性顯示，DRVQY 株與DRV的氨基酸序列相似性為94.8%～98.4%，與MDRV的相似性為68.1%～68.9%，與ARV和TRV的相似性為67.0%～69.2%。

S4 基因ORF 全長1 104 bp，編碼由367 個氨基酸組成的σNS蛋白。DRV-QY 株σNS蛋白編碼區(qū)核苷酸序列與DRV的相似性為92.9%～99.2%，與MDRV的相似性為83.9%～85.0%，與ARV和TRV的相似性為76.6%～79.1%。

2.3 QY 株與其他正呼腸孤病毒的遺傳進(jìn)化關(guān)系QY 分離株S組核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析表明，參比序列大致分為3 個亞群，即哺乳動物呼腸孤病毒（MRV）亞群，狒狒呼腸孤病毒（BRV）亞群及禽呼腸孤病毒（ARV）和內(nèi)爾森海灣病毒（NBV）亞群。其中DRV、ARV、TRV、MDRV、NRV位于第二亞群，且NDRV-QY 與新近報道的新型鴨呼腸孤病毒DRV處于進(jìn)化樹的同一小分支，親緣性較近（見圖1）。

3 分析與討論

本研究參考新型鴨呼腸孤病毒的S組基因序列設(shè)計特異性引物，對國內(nèi)分離株NDRV-QY 的S組基因編碼區(qū)進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增、克隆及序列測定，表明QY 株S組基因片段所包含的主要ORF 大小分別為1 517 bp、1 251 bp、1 104 bp 和1 104 bp。

圖1 基因σC、σA、σB和σNS的遺傳發(fā)育樹

各序列分析結(jié)果表明，QY 株的S組基因各節(jié)段編碼區(qū)和GenBank中已有的ARV、TRV、MDRV、DRV、GRV均有不同程度的同源性，其中與DRV的同源性最高，核苷酸序列和氨基酸序列同源性均達(dá)90%以上，與NBV、BRV、MRV同源性則為9.3%～59.4%，同源性較低。另外，QY 株與DRV、ARV、NBV、MRV的外殼蛋白，σC蛋白是由S1 基因編碼[4，6，7]，而MDRV的σC蛋白則是由S4 基因編碼的[8]。MDRV的S4 基因為多順反子，但是QY 株和DRV、ARV、NBV的Sl基因包含3個開放閱讀框（ORF）[4-11]。MDRV的S4基因缺少Q(mào)Y 株S1 的ORF2，不能表達(dá)p18 蛋白。以上結(jié)果表明，QY 株是有別于MDRV和ARV的新型鴨呼腸孤病毒，同時也說明我國家禽尤其是水禽體內(nèi)存在著多種基因類群的呼腸孤病毒。

根據(jù)QY 株σC、σA、σB和σNS的遺傳進(jìn)化樹分析表明，QY 株與DRV、MDRV、ARV同在正呼腸孤病毒的第Ⅱ亞群，是不同于MDRV和ARV的獨立分支。QY 株與DRV具有很高的同源性且處在同一個分支，提示它們可能來自同一祖先。

由上述結(jié)果分析可知，NDRV與MDRV、ARV可能具有相同的祖先而進(jìn)化成不同的分支，建議將NDRV歸屬為正呼腸孤病毒屬的第Ⅱ亞群中。

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