重組BCG 的抑瘤活性及免疫學(xué)機(jī)制研究①

薛慶節(jié) 李秀真 李運(yùn)清 楊媛媛 胡文潔 章洪華 呂厚東 李士根

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，醫(yī)學(xué)免疫學(xué)省級重點(diǎn)學(xué)科，濟(jì)寧 272067)

EB 病毒(Epstein-Barr virus，EBV)為1964 年Epstein 和Barr 等用改良組織培養(yǎng)技術(shù)自非洲兒童惡性淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的一種新型病毒，屬于雙鏈DNA 病毒，為人類皰疹病毒4 型。其具有嗜淋巴細(xì)胞的特性，在世界各地都有分布。在EBV 原發(fā)感染中，約半數(shù)患者出現(xiàn)傳染性單核細(xì)胞增多癥。非洲兒童惡性淋巴瘤及鼻咽癌易發(fā)于感染過EB 病毒的患者，故現(xiàn)在普遍認(rèn)為EB 病毒是人類重要的腫瘤相關(guān)病毒［1］。本研究擬將文獻(xiàn)［2］構(gòu)建成功的包含GM-CSF(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)基因與EB 病毒表面蛋白基因LMP2A 的重組BCG(rBCG)進(jìn)行免疫學(xué)及抑瘤活性研究，進(jìn)一步評價rBCG 的作用和效果。

1 材料與方法

1.1 材料 GT39(EB 病毒陽性胃癌細(xì)胞)為青島大學(xué)羅兵教授饋贈、FIFC 標(biāo)記的兔抗鼠CD4、PE 標(biāo)記的兔抗鼠CD8a 購自BD PharmingenTM公司;CTL殺傷活性檢測試劑盒為Promega 公司產(chǎn)品;小鼠淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊镏破酚邢薰?中性蛋白酶DISPASE 購自Roche 公司;6 周齡的C57BL/6 小鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司;鼠IFN-ELISPOT 預(yù)包被試劑盒購自北京曠博生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 EB 病毒陽性腫瘤預(yù)防模型的建立及免疫策略 雌性6 周齡的C57BL/6 小鼠隨機(jī)分4 組，每組中有18 只小鼠，用6 只進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)、6 只需進(jìn)行免疫機(jī)制分析、最后6 只需進(jìn)行生存觀測。第一組注射PBS 作為對照;第二組注射BCG作為對照;第三組注射含空載體pMV261 的BCG 作對照;第四組注射含目的基因的重組BCG。

培養(yǎng)GT39 細(xì)胞，收集指數(shù)生長期細(xì)胞，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度，倒置顯微鏡計數(shù)，使?jié)舛葹? ×107個/ml。無菌操作在2 只C57BL/6 雌性小鼠右肋腹側(cè)皮下，分別一次性接種250 μl/鼠。1 個月后處死荷瘤小鼠，無菌操作剝下瘤體。碾碎瘤體并勻漿，加4℃冰冷后的PBS 混合，200 目濾網(wǎng)過濾腫瘤細(xì)胞，用PBS 調(diào)細(xì)胞濃度為2 ×105個/ml，最后一次免疫后10 d 將培養(yǎng)好的腫瘤細(xì)胞無菌操作250 μl/鼠接種于C57BL/6 雌性小鼠右肋腹側(cè)皮下，9 d 后隨機(jī)分組。

對實(shí)驗(yàn)小鼠C57BL/6 在進(jìn)行腫瘤接種前30 d，連續(xù)3 次進(jìn)行疫苗接種，中間間隔10 d，免疫時采用右肋腹側(cè)皮下注射的方式進(jìn)行，第一組于右肋腹側(cè)皮下注射250 μl PBS/(次·只)作對照;第二組皮下注射250 μl BCG(5 ×108個細(xì)菌溶于250 μl PBS中)/次/只;第三組注射含空載體pMV261 的BCG(5 ×108個細(xì)菌溶于250 μl PBS 中)/(次·只);第四組注射含目的基因的重組BCG(5 ×108個細(xì)菌溶于250 μl PBS 中)/(次·只)。在最后一次免疫后10 d 接種腫瘤細(xì)胞。在接種腫瘤細(xì)胞后40 d 斷頸處死小鼠，手術(shù)剝離腫瘤并測定各種數(shù)據(jù)。

1.2.2 疫苗抑瘤活性測量與分析 觀察小鼠皮下腫瘤的生長情況，當(dāng)可觸及腫瘤結(jié)節(jié)時，記錄其成瘤時間;然后每間隔2 d 用游標(biāo)卡尺測量腫瘤垂直長徑(X)及短徑(Y)，計算其體積，公式為:腫瘤體積V=X×Y2/2，第40 天(從接種腫瘤細(xì)胞起)處死小鼠，手術(shù)剝離腫瘤，稱取瘤重，進(jìn)行分析。統(tǒng)計各組瘤體積并計算抑瘤率，腫瘤生長抑制率的計算公式:抑制率(%)=(對照組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

1.2.3 ELISA 法檢測血清中特異性抗體 最后一次免疫后第10、20 天，取各實(shí)驗(yàn)組小鼠眼眶靜脈血，室溫下4 h，然后離心(4 000 r/min，離心半徑10 cm)10 min，取血清，-20℃保存。用表達(dá)純化的GM-CSF、LMP2A 包被ELISA 板，檢測血清中有無特異性抗體及其滴度。

具體步驟如下:(1)用包被液稀釋純化的蛋白質(zhì)GM-CSF、LMP2A 至濃度為3 μg/ml，100 μl/孔包被平板，冰箱內(nèi)4℃過夜;(2)24 h 后，將包被液棄去，用ddH2O 洗板2 次并在吸水紙上扣干;(3)2%酪蛋白溶液封閉4 h，然后吸去封閉液，于吸水紙上扣干;(4)將100 μl/孔用PBS 倍比稀釋后的小鼠血清加入酶標(biāo)板，37℃孵育1 h;(5)用PBST 洗板，共5次，然后加入羊抗鼠IgG(HRP 標(biāo)記)抗體0.1 μg/ml，37℃孵育0.5 h;(6)PBST 洗5 次后，用A、B 液(H2O2+TMB)顯色，時間為15 min，最后用100 μl/孔硫酸(1 mol/L)終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測450 nm 的OD 值。

1.2.4 ELISPOT 法檢測脾臟細(xì)胞特異性細(xì)胞因子 單細(xì)胞懸液的制備:(1)在末次免疫后第10 天，處死小鼠，將其浸入75%酒精中5 min 后放入已滅菌的超凈臺內(nèi);(2)無菌操作取其脾臟，盡量去除脂肪、結(jié)締組織等，剪碎后置于200 目細(xì)胞篩中，將細(xì)胞篩放在含3%血清的PBS 的小燒杯中，用研磨杵擠壓出脾細(xì)胞;(3)用含2%血清的PBS 沖洗研磨出的脾細(xì)胞;(4)將淋巴細(xì)胞分離液5 加入到15 ml 離心管，將脾細(xì)胞懸液緩慢加入到分離液上方，2 500 r/min(離心半徑8 cm)冷凍離心機(jī)離心0.5 h;(5)取上層白膜，然后加10 ml 含血清PBS 洗2 次(1 200 r/min，5 min，離心半徑8 cm);在10 ml 無血清PBS 中重新懸浮并計算細(xì)胞的數(shù)量。

ELISPOT 法檢測脾細(xì)胞IFN-γ 分泌:實(shí)驗(yàn)設(shè)陽性對照1 組(加PMA 刺激)，每個細(xì)胞樣品(來自同一小鼠)設(shè)1 組陰性對照(不加PMA)，另外設(shè)一組無細(xì)胞，只加檢測試劑、培養(yǎng)基的背景陰性對照。操作步驟如下:取出預(yù)包被的板，無血清培養(yǎng)基Lympho-SpotTM200 μl，靜止10 min，然后棄去;接種稀釋成的不同濃度細(xì)胞，細(xì)胞分布要均勻，100 μl/孔;陽性對照:濃度細(xì)胞2.5 ×105個/孔;細(xì)胞樣品:5 ×105個/孔;背景陰性對照:加無血清培養(yǎng)基礎(chǔ)100 μl陽性對照加10 μl 的PMA +離子霉素，使其終濃度為1 μg/ml，以刺激IFN 分泌;加刺激物GM-CSF、LMP2A 蛋白20 μg/孔;樣品加完后，放37℃CO2培養(yǎng)箱36 h。在CO2培養(yǎng)箱36 h 后，進(jìn)行如下操作:(1)傾倒孔內(nèi)的培養(yǎng)基，每孔加250 μl 冰冷去ddH2O，置于冰箱4℃下10 min，低滲裂解細(xì)胞;(2)棄去孔內(nèi)液體，用緩沖液洗5～6 次，250 μl/孔，每次1 min，最后在吸水紙上扣干;(3)加入酶標(biāo)親和素100 μl/孔，37℃下1 h，然后棄去孔內(nèi)液體，用緩沖液洗5～6 次，250 μl/孔，每次1 min，最后在吸水紙上扣干;(4)將100 μl/孔AEC 顯色液加入，避光30 min，每5 min 檢查1 次;(5)當(dāng)斑點(diǎn)生長到合適大小后，以ddH2O 洗2 遍，終止顯色。在吸水紙上倒扣反應(yīng)板，當(dāng)小水珠干后，取下保護(hù)層，置于室溫下，讓膜晾干;(6)在讀板機(jī)上將ELISPOT 反應(yīng)板放好，調(diào)節(jié)好參數(shù)，測定斑點(diǎn)數(shù)據(jù)。

1.2.5 CTL 殺傷活性檢測 (1)制備效應(yīng)細(xì)胞:無菌操作獲得rBCG 免疫后的小鼠脾細(xì)胞懸液，以15 U/ml 的IL-2 和2.5 μg/ml PHA-P 刺激淋巴細(xì)胞生長，另外，我們還加入表達(dá)純化的GM-CSF 蛋白質(zhì)作刺激物，其濃度為30 μg/ml，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后，加終濃度為25 U/ml 的IL-2。再次培養(yǎng)過夜后，每孔吸去0.5 ml 液體，補(bǔ)加含終濃度為25 U/ml 的IL-2 培養(yǎng)液，再培養(yǎng)2 d，把收獲的細(xì)胞作效應(yīng)細(xì)胞。(2)制備靶細(xì)胞:EB 病毒陽性腫瘤細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。(3)檢測CTL 活性的檢測(乳酸脫氫酶釋放法):按照試劑盒Non-Radioactive Cytotxixity Assay(Promega 公司)說明書操作規(guī)程進(jìn)行:自然釋放組(效應(yīng)細(xì)胞):收集并調(diào)整其細(xì)胞濃度，每孔加50 μl，最后補(bǔ)足至100 μl(用無血清培養(yǎng)基);自然釋放組(靶細(xì)胞):收集并調(diào)整其細(xì)胞濃度，每孔加1 ×105個/50 μl，最后補(bǔ)足至100 μl(用無血清培養(yǎng)基);最大釋放組(靶細(xì)胞):收集并調(diào)整其細(xì)胞濃度，每孔加1 ×105個/50 μl，最后補(bǔ)足至100 μl(用無血清培養(yǎng)基);背景釋放組:加100 μl 無血清培養(yǎng)基;實(shí)驗(yàn)組:每孔加稀釋的效應(yīng)細(xì)胞濃度分別是1 ×106個/50 μl、2 ×106個/50 μl、4 ×106個/50 μl，靶細(xì)胞1 ×105個/50 μl;1 200 r/min 離心5 min(離心半徑8 cm)，使其充分接觸，然后在37℃下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。在細(xì)胞孵育結(jié)束前40 min，將20 μl 5 ×裂解液加入到靶細(xì)胞最大釋放孔，培養(yǎng)結(jié)束后，3 000 r/min 離心5 min。將離心后獲得的上清50 μl 移入新96 孔酶標(biāo)板中，每孔加入50 μl 底物，避光30 min，然后加50 μl 終止液，完成后讀出490 nm 吸光值。CTL 殺傷率的計算:實(shí)驗(yàn)組=實(shí)驗(yàn)組平均-培養(yǎng)基背景平均;效應(yīng)細(xì)胞自然釋放值=效應(yīng)細(xì)胞組自然釋放平均-培養(yǎng)基背景平均;靶細(xì)胞自然釋放值=靶細(xì)胞組自然釋放平均-培養(yǎng)基背景平均;靶細(xì)胞最大釋放值=靶細(xì)胞組最大釋放平均-體積糾正值平均。殺傷率(%)=實(shí)驗(yàn)組釋放-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放-靶細(xì)胞自然釋放/靶細(xì)胞最大釋放-靶細(xì)胞自然釋放×100%。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測 用手術(shù)刀剝下免疫小鼠的腫瘤，稱約0.4 g，放入6 ml 濃度為0.15%預(yù)熱蛋白酶溶液(pH7.0)中，于水浴中37℃裂解，用移液器輕吹裂解的腫瘤細(xì)胞，在裂解下來的腫瘤細(xì)胞中加入相等體積的1640 培養(yǎng)基。然后，將蛋白酶溶液(pH7.0)再次加入未能裂解的組織中，重復(fù)上述過程3 次，將中性蛋白酶裂解的腫瘤細(xì)胞收集在一起。將4 次裂解得到的腫瘤組織細(xì)胞離心(1 000 r/min)，獲得的細(xì)胞沉淀用1 ml PBS 緩沖液重懸，得到的溶液用200 目濾網(wǎng)過濾，離心收集過濾得到的細(xì)胞，用PE 標(biāo)記兔抗鼠CD8a 抗體、FITC 標(biāo)記兔抗鼠CD4 抗體(終濃度為2 μg/ml)100 μl 于4℃孵育2 h，然后用10 ml 清洗細(xì)胞3 次，用6 μl PBS 重新懸浮細(xì)胞沉淀，用流式細(xì)胞儀檢測免疫小鼠腫瘤中的CD8+、CD4+T 淋巴細(xì)胞的數(shù)量，并進(jìn)行分析。

1.2.7 免疫小鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)觀察 對rBCG免疫后小鼠的腫瘤組織石蠟切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察分析其組織形態(tài)學(xué)變化及免疫后腫瘤組織中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞是否出現(xiàn)。具體步驟如下:(1)腫瘤的剝離與固定:從免疫小鼠體內(nèi)剝離腫瘤，放入4%多聚甲醛溶液中固定，以維持細(xì)胞的固有形態(tài)與結(jié)構(gòu);(2)組織的脫水與透明化處理:腫瘤經(jīng)65%、75%、85%乙醇逐級脫水各2 h，再浸入95%、無水乙醇各2 次，每次1.5 h，逐步脫去腫瘤組織中的水份。將脫水后的組織塊浸入二甲苯中進(jìn)行透明處理;(3)包埋:把已透明化處理的腫瘤組織放入溶化的蠟中，置于恒溫箱保溫。當(dāng)組織中完全被石蠟浸入后包埋;先疊好幾個小紙盒，倒入溶化后的液體石蠟，然后將浸透蠟的組織置于其中，蠟冷卻凝固后腫瘤可在其中長期保存;(4)切片:將包埋后的腫瘤固定于切片機(jī)上進(jìn)行切片，切成5 μm 的薄片，為防皺褶的出現(xiàn)，將切下的薄片放入42℃水中;(5)貼片與烤片:將切片在水中伸展之后，用預(yù)先涂有1∶1蛋白甘油液的載玻片從水中撈取薄片，將薄片置于中心，晾干后置于37℃干燥箱中烘干;(6)脫蠟:將切片放入二甲苯20 min 以溶去石蠟，然后將其放入另一二甲苯液體漂洗20 min，最后放入二甲苯、無水乙醇(1∶1)溶液中3 min;(7)復(fù)原:脫蠟完成后將其置于無水乙醇2 min，然后放入另一新的無水乙醇2 min 以除去二甲苯;然后放入90%、80%、70%、60%、50%的酒精中各浸泡2 min，最后放入蒸餾水中泡2 min;(8)初染:將在蒸餾水中放置后的切片取出浸入蘇木精染液10 min;然后水中泡洗2～3 min;細(xì)胞質(zhì)脫色:用鹽酸酒精分化至切片呈磚紅色(約15～20 s)，然后用自來水沖洗;(9)藍(lán)化:用1%氨水處理1～2 min，然后水漂洗1～2 min;(10)脫水:將切片重新置于65%、75%、85%、95%乙醇逐級脫水，時間各2 min;(11)復(fù)染:將切片置于95%酒精伊紅混合液中染色5 min，然后用無水乙醇浸泡2 min，共2 次，以完成對組織細(xì)胞的脫水;(12)透明化處理:經(jīng)二甲苯二次各8 min 浸泡，使切處透明化及除去組織中的乙醇;(13)封固:將切片從第二次浸泡的二甲苯中取出，即可滴上中性加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封固，平放于干燥處，稍加重壓，待干燥后觀察。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 對各組數(shù)據(jù)整理后采用SPSS11.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，成瘤時間以及腫瘤的重量、體積的采用隨機(jī)單因素方差分析(ANOVA)統(tǒng)計處理。每兩者之間差異進(jìn)行t 檢驗(yàn)，以P ≤0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P≤0.01 作為差異非常顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠成瘤時間 各組小鼠的成瘤時間如表1所示，第一組時間約為8 d，第二組、第三組成瘤時間與第一組相比無顯著性差異;第四組成瘤時間最晚，約為20 d 左右才可以觸摸至腫瘤結(jié)節(jié)。與各對照組相比，差異達(dá)顯著水平(P≤0.05)，見表1。

2.2 小鼠的存活情況 在皮下接種腫瘤細(xì)胞后的100 d 內(nèi)，第三天觀察小鼠的存活情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第一、第二、第三三個對照組在接種45 d 內(nèi)全都死亡，而第四組重組BCG 免疫后的小鼠在90 d 仍有1只存活，與其余各組相比，差異達(dá)顯著水平(P ≤0.05)。

2.3 重組BCG 對腫瘤的抑制作用 結(jié)果見表2，可以看出，第一、二、三組平均瘤重差異不顯著，與各對照組相比，第四組平均重量明顯降低，其對腫瘤的抑制率為82%，與對照組的差異達(dá)顯著水平(P ≤0.05)。

表1 各組免疫小鼠皮下接種腫瘤細(xì)胞的成瘤時間Tab.1 Time of tumors formation in each immunized group after inoculation

2.4 ELISA 法檢測血清中特異性抗體 對于GMCSF 蛋白的包板，在最后一次免疫后10 d，第四組的抗體滴度為1∶14 800，在最后一次免疫后30 d，第四組的抗體為1∶4600。對于LMP2A蛋白包被的平板，分別為1∶10 000 和1∶1 000，都達(dá)非常顯著水平(P≤0.01)，見表3、4。

表2 重組BCG 對腫瘤的抑制作用Tab.2 Inhibitory effect of recombinant BCG on tumor

表3 小鼠血清抗體ELISA 檢測結(jié)果(GM-CSF 蛋白包板)Tab.3 ELISA results of mice serum antibody detection(GM-CSF protein coated board)

表4 小鼠血清抗體ELISA 檢測結(jié)果(LMP2A 蛋白包板)Tab.4 ELISA results of mice serum antibody detection(LMP2A protein coated board)

表5 各免疫組小鼠ELISPOT 計數(shù)結(jié)果Tab.5 Count results in ELISPOT of immunization mice

表6 CTL 特異性殺傷活性(%)Tab.6 Specific killing activity of CTL (%)

圖1 rBCG 免疫小鼠腫瘤組織腫瘤組織浸潤淋巴細(xì)胞Fig.1 Infiltrating lymphocytes of tumor tissue of mice immunized with rBCG

2.5 ELISPOT 法檢測小鼠IFN-γ 分泌水平 用GM-CSF、LMP2A 融合蛋白(20 μg/孔)作為刺激物對各組免疫小鼠的淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激，對特異性抗原肽有反應(yīng)的T 淋巴細(xì)胞被激活，進(jìn)而分泌IFN-γ，這些因子被包被的IFN-γ 抗體捕獲并通過顯色的方式變成斑點(diǎn)。而對GM-CSF、LMP2A 融合蛋白沒有反應(yīng)的淋巴細(xì)胞不會產(chǎn)生細(xì)胞因子，我們對所形成的斑點(diǎn)進(jìn)行了計數(shù)，結(jié)果如表5 顯示。

2.6 特異性CTL 檢測 按試劑盒操作方法，設(shè)定效靶比(E/T)分別為10∶1、20∶1、40∶1，測 定OD490nm 值，分析CTL 活性，隨效靶比逐步增加，重組目的蛋白免疫組殺傷能力增加，這說明產(chǎn)生了對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷能力，而其他各組變化不明顯，重組BCG 組與對照組相比差異顯著(P ≤0.05)，結(jié)果如表6 所示。

2.7 形態(tài)學(xué)觀察腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞 通過對免疫小鼠腫瘤組織的切片觀察，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過重組BCG 免疫的腫瘤組織局部有淋巴細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，如圖1 箭頭所示。

3 討論

癌癥是當(dāng)今世界所面臨的最嚴(yán)重的疾病之一。傳統(tǒng)方法的治療是用手術(shù)切除腫瘤，然后進(jìn)行化療和放療，以防止殘留的腫瘤細(xì)胞重新大量繁殖。但是，放療和化療有非常大的負(fù)作用，其在清除腫瘤細(xì)胞的同時，對人體正常的組織和細(xì)胞亦造成很大的傷害，且療效有限。

基因工程疫苗是使用DNA 重組技術(shù)，把天然的或人工合成的DNA 定向插入到哺乳動物細(xì)胞、真菌或細(xì)菌中，使之高效表達(dá)，經(jīng)純化后而制備的疫苗。這種疫苗的構(gòu)建通常使用高效表達(dá)質(zhì)粒，將編碼特異性抗原的多肽或蛋白基因構(gòu)建到這種質(zhì)粒中，使其在哺乳動物細(xì)胞、真菌或細(xì)菌中表達(dá)，注射機(jī)體后，表達(dá)的抗原可激活免疫系統(tǒng)，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體自身產(chǎn)生主動的、特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫，從而達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤的目的。

抗腫瘤基因工程疫苗是近年來發(fā)展起來的一種治療腫瘤的新方式，雖然出現(xiàn)的時間比較短，但其研究已獲得了很大的進(jìn)展，其有效性已在實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證，部分疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

GM-CSF(Granulocyte/macrophase colony-stimulating factor，GM-CSF)全稱為粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，由144aa 組成，它不但對樹突狀細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用，而且能促進(jìn)其增殖與分化，維持細(xì)胞活力［3］。另外，該細(xì)胞因子還能對樹突狀細(xì)胞的分布和抗原提呈起重要調(diào)節(jié)作用。因此，被認(rèn)為是抗腫瘤研究的重要細(xì)胞因子。研究表明，將其轉(zhuǎn)移至腫瘤細(xì)胞能極大增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，提高人體抗腫瘤反應(yīng)［4-6］。LMP2A 為EB 病毒的潛伏膜蛋白基因，存在于被感染的B 淋巴細(xì)胞膜表面，具有阻止?jié)摲腅B 病毒再次被激活的作用，LMP2A 蛋白不但可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，而且能引發(fā)機(jī)體CTL 反應(yīng)［7-9］。Redchenko 等［10］用LMP2A 表位多肽負(fù)載DC，誘導(dǎo)出大量的特異性CTL。因此，EB 病毒表面膜蛋白基因LMP2A 可成為其相關(guān)腫瘤免疫治療的靶抗原。本研究設(shè)想將GM-CSF 與LMP2A 基因融合并轉(zhuǎn)入表達(dá)載體，讓其同時在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使機(jī)體產(chǎn)生針對EB 病毒陽性腫瘤細(xì)胞的體液免疫和細(xì)胞免疫，協(xié)同殺傷EBV 陽性腫瘤細(xì)胞。

卡介苗(BCG)是當(dāng)今世界上應(yīng)用的最廣泛的減毒活疫苗之一，其能形成胞內(nèi)菌，既能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，又能刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫。用作抗腫瘤研究的表達(dá)載體有其獨(dú)特的一面［11］。

從實(shí)驗(yàn)中可以看出，重組BCG 可誘導(dǎo)C57BL/6小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)抗腫瘤作用，對EB 病毒陽性腫瘤細(xì)胞具有明顯抑制作用。主要表現(xiàn)在腫瘤成瘤時間與其他對照相比明顯延遲，腫瘤生長明顯緩慢，小鼠生存期延長。這說明重組BCG 誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，對接種的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了特異性殺傷。

ELISA 檢測結(jié)果表明，重組BCG 免疫后能產(chǎn)生針對GM-CSF 和LMP2A 的特異性IgG 抗體，用EB病毒陽性腫瘤細(xì)胞GT39 作為靶細(xì)胞，以經(jīng)抗原肽刺激的免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞作效應(yīng)細(xì)胞，檢測特異性CTL。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同的效靶比設(shè)定值下，重組BCG 免疫組的小鼠都能檢測到特異性CTL 活性，統(tǒng)計分析結(jié)果表明，其已達(dá)顯著水平。

用ELISPOT 法檢測免疫小鼠淋巴細(xì)胞的IFN分泌情況，將無菌操作分離得到的重組BCG 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞用GM-CSF 蛋白質(zhì)刺激后，加到預(yù)包被IFN-抗體的酶標(biāo)板上，并通過對所形成的斑點(diǎn)計數(shù)，發(fā)現(xiàn)重組BCG 組檢測到的斑點(diǎn)數(shù)較多，而其余各對照組沒有檢測到IFN 的分泌，這說明重組BCG疫苗刺激機(jī)體后可誘導(dǎo)小鼠的細(xì)胞免疫反應(yīng)。用流式細(xì)胞儀及形態(tài)學(xué)觀察的方法檢測腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)重組BCG 免疫的小鼠，其腫瘤組織中可檢測到有淋巴細(xì)胞的浸潤生長，這表明重組BCG 的免疫成功募集淋巴細(xì)胞到達(dá)腫瘤生長部位，出現(xiàn)浸潤現(xiàn)象。上述實(shí)驗(yàn)為重組BCG 疫苗進(jìn)一步的藥效學(xué)及藥理學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)，為惡性腫瘤的預(yù)防提供了新思路和新方法。

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