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    姜黃素通過抑制STAT3 通路調(diào)控人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細胞株的耐藥性①

    2015-03-18 11:41:12文坤明程家平陳正權(quán)陳奕霖曾慶良遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科遵義563003
    中國免疫學(xué)雜志 2015年8期
    關(guān)鍵詞:姜黃細胞株結(jié)腸癌

    文坤明 冷 敏 程家平 陳正權(quán) 陳奕霖 曾慶良 (遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科,遵義 563003)

    腫瘤對化療藥物多藥耐藥(Multidrug resistance,MDR)是影響其化療效果的關(guān)鍵原因,腫瘤耐藥的機制包括:機體或腫瘤基因或表觀遺傳發(fā)生改變、腫瘤微環(huán)境改變或阻止化療藥物進入細胞等,其中腫瘤細胞高表達ABC 藥物轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette transporters,ABC transporters),將進入腫瘤細胞的化療藥物泵出細胞,使化療藥物無法達到有效濃度從而發(fā)生耐藥在腫瘤細胞耐藥機制中起了重要作用[1]。P-糖蛋白(P-gp)由耐藥基因MDR-1 編碼,是ABC 藥物轉(zhuǎn)運蛋白超家族一員,結(jié)腸癌細胞高表達P-gp 是影響治療效果的主要障礙之一[2]。研究發(fā)現(xiàn),表達P-gp 的基因MDR-1 存在受STAT3調(diào)控的啟動子結(jié)合域,STAT3 可調(diào)控P-gp 表達在腫瘤耐藥中起作用[3]。本項目擬研究具有抗癌活性的姜黃素(Curcumin,Cur)對具有MDR 特性的人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑(Oxaliplatin,Oxa)細胞株(SW620/OxR)的逆轉(zhuǎn)作用及其機制是否與抑制STAT3 信號通路有關(guān)。

    1 材料與方法

    1.1 細胞株 人結(jié)腸癌細胞株SW620 購于中國科學(xué)院上海細胞庫。將SW620 細胞在含10%胎牛血清(FBS)的L-15 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。按照我們之前報道的方法建立穩(wěn)定的耐藥細胞株[4]:在SW620 細胞的培養(yǎng)液中最初加入濃度0.1 μmol/L 的Oxa,加藥后大部分細胞死亡,少量存活細胞繼續(xù)生長,待細胞融合度達80%左右時予傳代處理,傳3 代后提高Oxa 濃度,由0.1 μmol/L 提高到0.5 μmol/L,同樣的處理方法由0.5 μmol/L 提高到1.0 μmol/L,最終達臨床血藥濃度2.0 μmol/L,至少傳5 代以上進行后續(xù)實驗,最終所建立的穩(wěn)定的耐藥細胞稱為SW620/OxR。

    1.2 相關(guān)試劑 奧沙利鉑及姜黃素購自美國Sigma 公司;細胞增殖檢測試劑WST-1 購自瑞士Roche公司;L-15 培養(yǎng)基購于北京邁成生物有限公司;胎牛血清(FBS)購自美國Gibco 公司;兔抗人P-STAT3(pY705)抗體購自美國Eptomics 公司、鼠抗人P-gp抗體購自美國Santa-Cruz 公司;鼠抗人β-actin 一抗、山羊抗鼠、山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司。

    1.3 細胞增殖活性檢測 為了選擇合適濃度的Cur 進行實驗,我們首先測定了姜黃素對耐藥細胞的IC50 值(半數(shù)抑制濃度)。Cur 用二甲基亞砜(DMSO)溶解配置成濃度為500 mmol/L 于-20℃儲存?zhèn)溆?,使用時用細胞培養(yǎng)基稀釋成目標濃度(DMSO 終濃度均<0.1%)。

    采用細胞增殖檢測試劑WST-1 檢測細胞增殖活性。將耐藥細胞SW620/OxR 接種于96 孔板,細胞數(shù)量為3 000 個/孔,培養(yǎng)液為含10%FBS 的L-15培養(yǎng)基。參考文獻報道的姜黃素對結(jié)腸癌細胞的作用濃度[5],我們選擇5 個梯度濃度的Cur 進行實驗。在接種12 h 細胞貼壁生長后,將細胞暴露于含Cur濃度分別為0、1、5、10、20、30 μmol/L 的培養(yǎng)基中,每種濃度設(shè)置3 個復(fù)孔,于37℃含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后(文獻報道[5,6],姜黃素對結(jié)腸癌、肺癌等腫瘤細胞的IC50 檢測時間選擇在加藥后24~48 h,本研究檢測時間定為加藥后48 h),酶標儀在570nm(OD570)波長下進行吸光度檢測。檢測前10 min,根據(jù)WST-1 試劑盒操作說明在每孔中加入10 μl WST-1 試劑震蕩混勻。按照我們之前報道的方法[4],計算加藥后細胞相對于未加藥對照組的存活細胞百分率,并且進行3 次獨立實驗??紤]到Cur 與Oxa可能存在協(xié)同殺傷癌細胞的作用,并且為了盡量減小高濃度藥物所致的不良反應(yīng),我們選擇的Cur 藥物濃度為IC50 前一濃度來進行后續(xù)實驗。

    1.4 細胞凋亡檢測 為了明確Cur 對耐藥細胞凋亡的影響,我們將SW620/OxR 分為對照組和實驗組(后面的實驗與之相同),對照組細胞培養(yǎng)液為含2 μmol/L Oxa 及10%FBS 的L-15 培養(yǎng)液,實驗組細胞培養(yǎng)液中另外增加IC50 前一濃度的Cur。取指數(shù)生長期SW620/OxR 細胞進行傳代,待12 h 細胞貼壁后,加入相應(yīng)的培養(yǎng)液各3 ml(50 ml 培養(yǎng)瓶),于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在加藥后48 h,0.25%胰酶消化收集每組細胞,每個樣本細胞數(shù)量約為1×106,采用Annexin V/PI 雙染色法,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,右下象限為早期凋亡細胞,右上象限為中晚期凋亡(死亡)細胞,總的細胞凋亡率按早期凋亡細胞加中晚期凋亡細胞在總細胞數(shù)中的百分率計算。

    1.5 Western blot 檢測蛋白表達 P-STAT3 和P-gp蛋白檢測采用Western blot 方法。實驗分組及細胞處理方法同1.4,使用細胞刮收集細胞,采用反復(fù)凍融法破碎細胞,加入適量的裂解液(每100 μl 裂解液中加入1 μl 蛋白酶抑制劑)充分混勻裂解30 min,按(Pierce BAC protein Assay Kit)蛋白定量試劑盒操作說明進行濃度測定,加入上樣緩沖液煮沸10 min 使蛋白充分變性,-80℃凍存?zhèn)溆?進行蛋白印跡實驗的上樣量為40 μg,6%或10%的SDS-PAGE膠分離蛋白,采用濕法轉(zhuǎn)膜將相應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h 后加入一抗稀釋液(P-STAT3:1∶2 000,P-gp:1∶500),4℃過夜孵育;PBST洗膜3 次,每次10 min;分別加入稀釋比例均為1∶5 000的山羊抗兔及山羊抗鼠二抗,室溫孵育1 h;PBST 洗膜3 次;ECL 發(fā)光并拍照;采用Quantity-One 軟件對條帶的吸光度值進行半定量分析,目的蛋白的相對量=目的條帶的吸光度值/內(nèi)參β-actin 蛋白條帶的吸光度值。

    2 結(jié)果

    2.1 細胞增殖活性檢測結(jié)果 不同濃度Cur 作用于SW620/OxR細胞后48h,采用細胞增殖檢測試劑WST-1 檢測的存活細胞百分率結(jié)果見圖1,Cur對SW620/OxR 細胞的IC50 濃度為18.9 μmol/L。根據(jù)實驗設(shè)計,在后續(xù)實驗中,我們使用的Cur 濃度為10 μmol/L。

    圖1 不同濃度Cur 作用于SW620/OxR 細胞48 h 后存活細胞百分率Fig.1 Effect on percentage of surviving cells after 48 h with Cur of different concentrations conducted in SW620/OxR cells

    圖2 流式細胞技術(shù)檢測實驗組及對照組的細胞凋亡率Fig.2 Cells apoptosis rate in control group and experimental group detected by flow cytometry

    2.2 細胞凋亡檢測結(jié)果 將SW620/OxR 細胞暴露于含10 μmol/L 的Cur、2 μmol/L 的Oxa 及10%FBS 的L-15 培養(yǎng)液中與不含Cur 的對照組比較,細胞凋亡率由(5.08± 1.82)% 上升到(30.69 ±2.94)%,10 μmol/L 的Cur 作用于SW620/OxR 細胞后細胞凋亡率明顯增高(P<0.05),見圖2。

    2.3 P-STAT3 及P-gp 表達結(jié)果 Western blot 檢測結(jié)果提示,P-STAT3 及P-gp 蛋白分別由對照組的(0.23 ±0.04)及(0.75 ±0.12),下降到實驗組的(0.09 ±0.01)及(0.16 ±0.04),加藥后的實驗組兩種蛋白表達明顯低于未加藥的對照組(P 均<0.05),提示Cur 能明顯抑制P-STAT3 及P-gp 蛋白的表達。圖3 為其中一次檢測結(jié)果。

    圖3 Western blot 檢測對照組及實驗組P-STAT3、P-gp蛋白表達結(jié)果Fig.3 Protein expression levels of P-STAT3 and P-gp in control group and experimental group detected by Western blot

    3 討論

    結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)的發(fā)病率位于惡性腫瘤的第3 位[7],手術(shù)和化療是其主要的治療方法。盡管在過去的十幾年時間內(nèi),手術(shù)及化療均取得了明顯的進展,但均未能明顯改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后,復(fù)發(fā)率仍維持在50%左右,MDR 是導(dǎo)致CRC 治療失敗的主要原因之一[8]。因此,研究結(jié)腸癌耐藥機制,尋找逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌MDR 的策略對改善結(jié)腸癌患者的預(yù)后具有重要意義。

    耐藥細胞株的建立為研究耐藥機制并尋找逆轉(zhuǎn)的方法提供了較好的研究平臺。我們在之前的研究中,成功建立了人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細胞株——SW620/OxR,已證實其具有MDR 特性[4]。Cur 是從姜黃根莖中提取出的主要活性物質(zhì),其具有抗癌活性[6-9],并且研究還發(fā)現(xiàn)其能逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥[6]。我們首先確定了Cur 對SW620/OxR 細胞是否具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。

    為了選擇適當濃度的Cur 進行研究,我們首先采用細胞增殖試劑WST-1 檢測了Cur 對耐藥細胞的IC50 值。結(jié)果提示,Cur 對SW620/OxR 細胞的IC50 濃度為18.9 μmol/L,見結(jié)果2.1??紤]到Cur與Oxa 可能存在協(xié)同殺傷腫瘤細胞的作用,并盡量降低高藥物濃度的Cur 對細胞的毒副作用,在后續(xù)實驗中,我們選擇10 μmol/L 的Cur 作用于SW620/OxR 細胞。采用流式細胞技術(shù)測定該濃度的Cur 對耐藥細胞凋亡的影響,結(jié)果提示,加藥后48 h,細胞凋亡率為(30.69 ±2.94)%,而未加藥的對照組細胞凋亡率為(5.08 ±1.82)%,提示10 μmol/L 的Cur 導(dǎo)致SW620/OxR 細胞凋亡率明顯增加(P<0.05),見結(jié)果2.2。以上結(jié)果表明Cur 作用于耐藥細胞后能夠明顯抑制細胞增殖,顯著增加細胞凋亡率,提示Cur 對具有MDR 特性的結(jié)直腸癌耐奧沙利鉑細胞SW620/OxR 具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。

    STAT3 信號通路激活參與了多種腫瘤的MDR[3,10]。我們在之前的研究中也發(fā)現(xiàn),SW620/OxR 細胞相對于其親本細胞SW620,STAT3 激活的標志磷酸化STAT3(p-STAT3)明顯高表達[4],P-gp表達也明顯增高[11],說明STAT3 信號通路激活及P-gp 高表達可能參與了結(jié)腸癌的MDR。研究還發(fā)現(xiàn),編碼P-gp 的基因MDR-1 存在受STAT3 調(diào)控的啟動子結(jié)合域,STAT3 可調(diào)控P-gp 表達在腫瘤耐藥中起作用[3]。我們進一步研究了姜黃素逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌細胞耐藥是否與抑制STAT3 通路,降低P-gp 表達有關(guān)。Western blot 檢測結(jié)果提示,加入10 μmol/L 的Cur 48 h 后的實驗組較未加藥的對照組P-STAT3 及P-gp 表達均明顯降低(P<0.05),見結(jié)果2.3,提示姜黃素可抑制SW620/OxR 細胞的STAT3 信號通路并明顯降低P-gp 表達。

    綜上所述,我們的研究顯示,姜黃素能夠明顯抑制具有MDR 特性的人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細胞增殖,能夠明顯增加細胞凋亡,說明其具有調(diào)控人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細胞耐藥性的作用,其作用機制可能與抑制STAT3 信號通路并明顯降低P-gp 表達有關(guān)。

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