不同抗原誘導(dǎo)后小鼠調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞趨化特性動態(tài)研究①

郭 音 李 偉 葉艾竹 安 宇 駱姝琳 劉水和 袁 軍

(貴州省貴陽醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，貴陽 550004)

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(Regulatory T cell，Treg)是重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，可以特異性抑制活化T 細(xì)胞功能［1］，且該抑制作用沒有MHC 限制性，無論是捐獻(xiàn)者或是第三方的Treg 都可以抑制效應(yīng)性CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的活化［2］。Treg 細(xì)胞作為潛在工具細(xì)胞防止移植排斥發(fā)生，引起移植免疫學(xué)研究的關(guān)注。Treg 細(xì)胞在皮膚同種異體移植物排斥反應(yīng)的獨(dú)特能力，更證實(shí)了這一特點(diǎn)［3］。Treg 細(xì)胞需要游走至移植局部方能發(fā)揮作用，然而目前，對器官移植后趨化因子在體內(nèi)介導(dǎo)CD4+CD25+Treg 細(xì)胞定向游走的機(jī)制尚未完全了解。因此，本項(xiàng)目旨在探索不同抗原誘導(dǎo)后趨化因子受體CCR4、CCR6 在Treg 細(xì)胞上的表達(dá)情況，并在體外觀察抗原誘導(dǎo)后Treg 細(xì)胞的趨化特性，以期為CD4+CD25+Treg 細(xì)胞定向游走機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級近交系，BALB/c(H-2d)和C57BL/6(H-2b)雌性小鼠，6～8 周齡，體重18～20 g，購于重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 卡介苗;熒光標(biāo)記抗體:Percp-AntiCD4、FITC-AntiCD25、PE-AntiCD127(BD 公司);趨化因子:MIP-3alpha(CCL20)，MDC(CCL22)(Pep roTech 公司);趨化因子受體:Alex Flour 647-AntiCCR4，Alex Flour 647-AntiCCR6(Biolegend 公司);小鼠淋巴細(xì)胞分離液;趨化結(jié)合液(Binding medium，BM)(1640 500 ml，胎牛血清白蛋白5 g，青、鏈霉素各5 萬單位，HEPES 3.6 g，谷胺酰胺1.5 g)，利用配好的BM 液，據(jù)試劑盒提供IC50 值，配制各趨化因子工作液，分裝并保存于-20℃。配制過程中所有操作均在冰浴環(huán)境進(jìn)行。

1.1.3 主要儀器 FACS AriaTM流式細(xì)胞儀(BD 公司);BILON-R1200 型非接觸式超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(上海比郎儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 C57BL/6 小鼠皮膚抗原的制備 頸椎脫臼處死C57BL/6 小鼠，剃去其背部毛發(fā)。取背部皮片，生理鹽水洗3～4 次，剪碎研磨后，用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)做超聲勻漿6 個(gè)循環(huán)(0.5 Kw，0.6 秒1 個(gè)循環(huán))，制成皮膚抗原懸液。用200 目滅菌濾網(wǎng)過濾后分裝，-20℃凍存?zhèn)溆?。紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量，按以下公式計(jì)算［4］:蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45A280 -0.74A260，(A260 和A280 分別為蛋白質(zhì)溶液在260 和280 nm 處測得的吸光度值，代入公式測得皮膚抗原的蛋白質(zhì)濃度為1.033 mg/ml)。

1.2.2 Treg 的體內(nèi)抗原誘導(dǎo)

1.2.2.1 皮膚抗原誘導(dǎo) 分為四組，每組3 只BALB/c 小鼠。每只小鼠腹腔注射皮膚抗原懸液1 ml(C57BL/6 小鼠皮膚抗原)。誘導(dǎo)后第1、2、3、4周頸椎脫臼處死小鼠，取脾臟分離單個(gè)核細(xì)胞，做趨化試驗(yàn)并利用流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg 細(xì)胞趨化因子受體的表達(dá)情況。

1.2.2.2 卡介苗誘導(dǎo) 分組同上，每只小鼠腹腔注射卡介苗活菌液體(17.4 ×104活菌/只)［5］。誘導(dǎo)后第1、2、3、4 周處死小鼠，取脾臟分離單個(gè)核細(xì)胞，做趨化試驗(yàn)并利用流式檢測Treg 趨化因子受體的表達(dá)情況。

1.2.2.3 滅菌生理鹽水組 分組及處理同上，每只小鼠腹腔注射0.5 ml 滅菌生理鹽水(0.9%NaCl)，作為對照組。

1.2.3 脾臟單個(gè)核細(xì)胞懸液的制備 頸椎脫臼法處死小鼠，用75%酒精消毒小鼠胸腹部，無菌操作取出脾臟，去除脂肪及結(jié)締組織。加入1 ml 滅菌生理鹽水，剪碎研磨脾臟。用200 目濾網(wǎng)過濾后，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，加入1 ml Hank's 液制備細(xì)胞懸液。取1 ml 小鼠淋巴細(xì)胞分離液，沿管壁緩緩加入上述細(xì)胞懸液，保持界面清晰。水平離心機(jī)，1 500 r/min 離心20 min，離心后小心吸取中間白膜層，即為小鼠單個(gè)核細(xì)胞層。

1.2.4 趨化因子受體的檢測 加入100 μl 脾臟單個(gè)核細(xì)胞懸液(含1 ×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞)，流式抗體試劑Percp-AntiCD4，F(xiàn)ITC-AntiCD25，PE-AntiCD127，Alex Flour-AntiCCR4 或Alex Flour-AntiCCR6 各2 μl，到入流式絕對計(jì)數(shù)管中，避光染色30 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行不同誘導(dǎo)組趨化因子受體CCR4、CCR6 的檢測。

1.2.5 趨化試驗(yàn) 將5 μm 孔徑的TransWell 上室移開，下室按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案加入600 μl 趨化因子工作液或BM 液對照。小心蓋上TransWell 上室，每孔加入100 μl 細(xì)胞懸液(含1 ×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞)放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h?；靹蛳率壹?xì)胞，用流式細(xì)胞儀對穿膜細(xì)胞作絕對計(jì)數(shù)，按以下公式計(jì)算趨化指數(shù):趨化指數(shù)=(穿膜細(xì)胞數(shù)/自然穿膜細(xì)胞數(shù))×100%［6］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果用SPSS11.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。所得結(jié)果采用單因素方差分析進(jìn)行兩兩比較;P ＜0.05 或P ＜0.01 表示有顯著性差異或極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 趨化因子受體CCR4、CCR6 在Treg 細(xì)胞的表達(dá)

2.1.1 CD4+CD25-T、CD4+CD25+CD127-T 亞群細(xì)胞CCR4 的表達(dá)情況 如圖1 所示，兩種抗原誘導(dǎo)的CD4+CD25-T 細(xì)胞在前3 周其表面趨化因子受體CCR4 的表達(dá)均隨著時(shí)間的延長呈下降趨勢，到第4 周又有所回升。其中皮膚抗原誘導(dǎo)組CD4+CD25-T 細(xì)胞在4 周時(shí)平均熒光強(qiáng)度值比3 周有顯著性差異(P ＜0.05)，第4 周與第1 周平均熒光強(qiáng)度接近(圖1A)。

皮膚抗原誘導(dǎo)的CD4+CD25+CD127-T 細(xì)胞CCR4 的表達(dá)在前3 周隨時(shí)間的延長呈緩慢下降趨勢，而到第4 周時(shí)平均熒光強(qiáng)度值升高且與前3 周相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)?？ń槊绾蜕睇}水誘導(dǎo)的CD4+CD25+CD127-T 細(xì)胞CCR4 的表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均無顯著變化(P ＞0.05)(圖1B)。

2.1.2 CD4+CD25-T、CD4+CD25+CD127-T 亞群細(xì)胞CCR6 的表達(dá)情況 如圖2 所示，兩細(xì)胞亞群CCR6 的表達(dá)呈現(xiàn)相似的趨勢。皮膚抗原誘導(dǎo)組平均熒光強(qiáng)度在2 周達(dá)到最高而后呈下降趨勢。卡介苗誘導(dǎo)組第4 周時(shí)CD4+CD25-T 細(xì)胞的表達(dá)明顯高于前3 周(P ＜0.05)，CD4+CD25+CD127-T 細(xì)胞CCR6 表達(dá)第2、4 周強(qiáng)于1、3 周。

圖1 誘導(dǎo)后CD4 +CD25 -T 細(xì)胞和CD4 +CD25 +CD127 -T 細(xì)胞表達(dá)CCR4 的平均熒光強(qiáng)度Fig.1 Average fluorescence intensity of CCR4 on CD4 +CD25 -T and CD4 +CD25 +CD127 -T cells after induced

圖2 誘導(dǎo)后CD4 +CD25 -T 細(xì)胞和CD4 +CD25 +CD127 -T 細(xì)胞表達(dá)CCR6 的平均熒光強(qiáng)度Fig.2 Average fluorescence intensity of CCR6 on CD4 +CD25 -T and CD4 +CD25 +CD127 -T cells after induced

圖3 CCL20 趨化下不同抗原誘導(dǎo)后不同亞群CD4 +T 淋巴細(xì)胞的趨化指數(shù)動態(tài)觀察Fig.3 Dynamic observation of chemotactic index of different CD4 +T lymphocytes subsets induced by different antigens by CCL20

圖4 CCL22 趨化下不同抗原誘導(dǎo)后不同亞群CD4 +T 淋巴細(xì)胞的趨化指數(shù)動態(tài)觀察Fig.4 Dynamic observation of chemotactic index of different CD4 +T lymphocytes subsets induced by different antigens by CCL22

2.2 趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 CCL20 趨化下CD4+CD25-T、CD4+CD25+CD127-T 細(xì)胞的趨化指數(shù) 如圖3 所示，皮膚抗原誘導(dǎo)組CD4+CD25-T 細(xì)胞趨化指數(shù)隨時(shí)間而升高，而CD4+CD25+CD127-T 細(xì)胞2、4 周明顯高于1、3周(P ＜0.05)。卡介苗誘導(dǎo)組CD4+CD25-T 細(xì)胞和CD4+CD25+CD127-T 細(xì)胞在4 周時(shí)的趨化指數(shù)要顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P ＜0.05)。

2.2.2 CCL22 趨化下CD4+CD25-T、CD4+CD25+CD127-T 細(xì)胞的趨化指數(shù) 如圖4 所示，皮膚抗原誘導(dǎo)組CD4+CD25-T 細(xì)胞前3 周隨時(shí)間而增高，第3周達(dá)高峰;CD4+CD25+CD127-T 細(xì)胞的趨化指數(shù)在第1 周顯著高于CD4+CD25-T 細(xì)胞組(P ＜0.05)?？ń槊缯T導(dǎo)組前3 周CD4+CD25+CD127-T 細(xì)胞比CD4+CD25-T 趨化指數(shù)高(P ＜0.05)，第4 周時(shí)各細(xì)胞亞群趨化指數(shù)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

3 討論

CD4+CD25+Treg 細(xì)胞為調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞中目前研究最廣泛、功能最確切的一種，鑒于其對效應(yīng)性T細(xì)胞的特異性抑制功能，能否將其運(yùn)用到移植免疫耐受的誘導(dǎo)，成為我們感興趣的問題。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(Treg)在維持免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要作用，Treg的功能發(fā)揮需要其向組織或二級淋巴組織的遷移，Treg 恰當(dāng)?shù)倪w移定位對其免疫抑制功能有效的發(fā)揮至關(guān)重要。Treg 在移植物局部激活后，在CCR2、CCR4、CCR5 和CCR7 的作用下又會通過輸入淋巴管向引流淋巴結(jié)遷移，完成整個(gè)遷移過程的Treg 才能獲得最有效的抑制功能［7，8］。Treg 具有很強(qiáng)的遷移能力，在從血液到移植物局部再引流淋巴結(jié)的遷移過程中其功能及表型逐漸成熟，此過程依靠不同趨化因子受體和黏附分子的表達(dá)［9］。趨化性細(xì)胞因子在正常的免疫系統(tǒng)中對淋巴細(xì)胞的遷移、歸巢、激活、分化發(fā)育及炎癥的發(fā)生、血管生成、腫瘤生長的過程中起著非常重要的作用，上調(diào)趨化因子CCL17 和CCL22 的表達(dá)可以增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的遷移［10］;細(xì)胞趨化因子介導(dǎo)的Treg 細(xì)胞遷移可以抑制過敏性炎癥［11］。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)成熟的樹突狀細(xì)胞可通過分泌CCR4 配體CCL17 及CCL22 引導(dǎo)CD4+CD25+Treg 細(xì)胞游走［12］。Iellem 等［13］在研究中發(fā)現(xiàn)CCL17 和CCL22(均為CCR4 的配體)對CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的趨化特異性較強(qiáng)。CCL20招募的主要是一些抗原提呈細(xì)胞，可趨化CCR6 表達(dá)細(xì)胞向抗原出現(xiàn)的組織部位定向遷移。

為了進(jìn)一步了解趨化因子受體在Treg 上的表達(dá)是否與抗原活化過程有關(guān)，以及抗原誘導(dǎo)活化對Treg 趨化特性的影響，我們在小鼠體內(nèi)利用不同抗原刺激后，分離脾臟單個(gè)核細(xì)胞，選用CCR4 配體CCL22、CCR6 配體CCL20 進(jìn)行了趨化實(shí)驗(yàn)，動態(tài)觀察了不同活化狀態(tài)下，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在這些趨化因子作用下的趨化特性及CCR4 與CCR6 的表達(dá)情況。文獻(xiàn)報(bào)道了BCG 具有明顯的免疫抑制能力，主要是通過增強(qiáng)Treg 的能力，但是關(guān)于BCG 對調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的表面趨化因子受體和對CCL20 和CCL22 趨化能力影響的研究并不多。本研究比較了皮膚抗原和BCG 對于調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和效應(yīng)T 細(xì)胞的趨化能力。

從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，BCG 誘導(dǎo)組效應(yīng)T 細(xì)胞CCR6 的趨化因子受體在第4 周的表達(dá)明顯上調(diào)，趨化指數(shù)也在第4 周達(dá)到最強(qiáng)。另外，BCG 在第4周明顯地增強(qiáng)Treg 細(xì)胞CCR6 表達(dá)，而且在第4 周Treg 細(xì)胞對CCL20 的趨化能力也最強(qiáng)。但是皮膚抗原第4 周Treg 細(xì)胞的CCR4 表達(dá)水平最高，但是皮膚抗原誘導(dǎo)組在第4 周Treg 細(xì)胞的趨化能力卻不是最強(qiáng)。皮膚抗原誘導(dǎo)組Treg 細(xì)胞的CCR6 第4周表達(dá)降低，但是趨化指數(shù)卻并沒有降到最低。而對于效應(yīng)T 細(xì)胞來說，皮膚抗原誘導(dǎo)組并沒有隨著趨化因子受體CCR4 和CCR6 表達(dá)水平的降低使趨化指數(shù)也隨之降低，趨化指數(shù)反而增加。而調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞則在第4 周和第2 周的趨化能力一致。因此，提示我們利用皮膚抗原可以在第3 周和第4 周時(shí)明顯地增強(qiáng)效應(yīng)T 細(xì)胞對CCL20 的趨化能力。CCL20、CCL22 對各組中CD4+CD25+CD127-T 細(xì)胞的趨化效率隨時(shí)間變化有不同趨勢，且與細(xì)胞表面相應(yīng)趨化因子受體表達(dá)的不完全同步，這說明趨化效率的高低可能與趨化因子受體的活性狀態(tài)有關(guān)，趨化因子受體的活性狀態(tài)和趨化因子的表達(dá)不完全一致。我們將在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中探討其可能存在的相關(guān)機(jī)制。先前的研究表明CCL20/CCR6 介導(dǎo)著調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的遷移［14，15］，CCL22/CCR4 在控制Treg 細(xì)胞的遷移方面也具有重要作用［16］。但是本研究發(fā)現(xiàn)雖然趨化因子受體的表達(dá)升高，但是趨化指數(shù)并不一定隨著增高，提示我們在趨化實(shí)驗(yàn)中趨化指數(shù)可能較趨化因子受體表達(dá)能更好地反映細(xì)胞的趨化能力。

另外，我們還發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg 細(xì)胞趨化特性與抗原性質(zhì)有關(guān)，在接受抗原刺激后，其表面趨化因子受體的表達(dá)與趨化能力隨時(shí)間呈動態(tài)變化。皮膚抗原誘導(dǎo)的CD4+CD25+CD127-T 細(xì)胞CCR4的表達(dá)在前3 周隨時(shí)間的延長呈緩慢下降趨勢，而到第4 周時(shí)平均熒光強(qiáng)度值升高，且與前3 周相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。兩細(xì)胞亞群CCR6 的表達(dá)呈相似趨勢，皮膚抗原誘導(dǎo)組平均熒光強(qiáng)度在2 周達(dá)到最高后呈下降趨勢?？ń槊缯T導(dǎo)組第4 周時(shí)CCR6 的表達(dá)明顯高于第3 周(P ＜0.05)，提示趨化因子受體表達(dá)變化與抗原性質(zhì)有關(guān)，不同抗原引起的CD4+T 細(xì)胞上趨化因子受體表達(dá)不同，若利用CD4+CD25+Treg 誘導(dǎo)耐受則須考慮上述因素?？乖T導(dǎo)早期CCL22 對Treg 細(xì)胞的趨化作用明顯，誘導(dǎo)后期CCL20 作用明顯。因此，我們可以在皮膚移植中，在皮膚移植部位早期可以利用CCL22 對Treg 細(xì)胞進(jìn)行定向趨化，增強(qiáng)機(jī)體對移植皮膚的免疫抑制，降低免疫排斥。而在4 周后，則利用CCL20對Treg 的趨化能力較好，這對我們合理的利用趨化因子在局部增強(qiáng)免疫抑制提供了參考。

本研究表明了不同抗原可以通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞表面的趨化因子受體來影響其趨化能力。在下一步的實(shí)驗(yàn)中，我們需要進(jìn)一步探討異體皮膚抗原對不同組織，特別是皮膚組織中趨化因子表達(dá)的影響，這對于我們在皮膚移植中合理利用皮膚抗原具有重要意義。

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