不同磷脂肽段誘導的實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型病理特征多樣性的研究①

鄭梅梅 王擁軍 張星虎 (首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京100050)

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)脫髓鞘疾病，臨床表現(xiàn)多種多樣［1］，包括肢體無力、感覺障礙、視力下降、共濟失調、發(fā)作性癥狀等，也可表現(xiàn)為疲勞、抑郁等非特異性癥狀，任何兩位MS 患者的臨床表現(xiàn)都不盡相同。MS 的臨床特點之一是時間多發(fā)性，85%～90%的MS 患者常常經(jīng)歷病情的反復發(fā)作和緩解;另一特點是病灶在空間上具有多發(fā)性，視神經(jīng)、大腦、小腦、腦干和脊髓均可受累［2］。MS的影像學表現(xiàn)各異，位于側腦室周圍白質的病灶比較常見，其長軸常與側腦室垂直，呈圓形、卵圓形。約2/3 患者可出現(xiàn)皮質下白質病變，有時病灶也可表現(xiàn)為黑洞、同心圓，當胼胝體病變時可呈現(xiàn)“蟲蝕狀”［3］。MS 病理特點為髓鞘脫失、炎性細胞浸潤、星形膠質細胞增生，而軸索相對保留［4］。Bruck等［1］認為MS 免疫病理學特征具有人群異質性，即不同的患者具有不同免疫病理學特征，且根據(jù)病灶的免疫病理學參數(shù)的異質性將病灶分為4 種組織病理學類型。以此分型為基礎，研究認為同一患者的病灶只表現(xiàn)為一種病理類型，即病灶的免疫病理學特征在某一患者中具有同質性［1］。

但MS 患者臨床表現(xiàn)差異、病理學人群異質性的原因尚不清楚。常采用磷脂抗原免疫易感動物建立實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)動物模型進行MS相關研究。常用的致敏抗原是髓鞘堿性蛋白(Myelin basic protein，MBP)和髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)，MBP 是髓鞘成分中抗原性最強的蛋白質，MOG 既可誘導自身抗體反應，也可激活致腦炎性T 細胞［5］。

Berger 等［6］發(fā)現(xiàn)不同磷脂肽段特異性T 細胞誘導的Lewis 大鼠EAE 模型具有抗原特異性炎性細胞浸潤分布，而且不同的磷脂肽段是致腦炎自身反應性T 細胞作用的靶點，神經(jīng)組織實質炎性細胞浸潤的程度和巨噬細胞活化的程度也與免疫抗原有關［7］。Abromson-Leeman 發(fā)現(xiàn)［8］MBP59-76 特異性T細胞免疫大鼠只可產(chǎn)生上升性脊髓麻痹，而MBP151-168 特異性T 細胞可以誘導周圍神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥和脫髓鞘，提示T 細胞的抗原表位特異性與病灶分布可能具有關聯(lián)。MBP68-86 肽段誘導Lewis大鼠后，在脊髓發(fā)現(xiàn)T 細胞的浸潤和小膠質細胞的激活［9］。MOG35-55 可誘導側腦室旁、丘腦、腦干、小腦和上段頸髓的病灶［10］。

CNS 局部黏附分子和趨化因子的不同可能與這些部位是否出現(xiàn)病灶有關［11］。CCL-7 是一種趨化因子，可趨化單核細胞和淋巴細胞，在多種CNS炎性疾病中其mRNA 表達均上調。血管內(nèi)皮黏附分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)是一種重要的黏附分子，可幫助細胞穿越血腦屏障，并使其在腦實質中駐留。

雖然以上研究也使用不同磷脂肽段免疫Lewis大鼠進行相關研究，但是存在以下局限性:(1)易感動物的遺傳學差異、體重、性別影響病理學表現(xiàn)，但以上研究所使用的Lewis 大鼠并不來源于同一克隆，且體重、性別均各不相同;(2)上述研究僅觀察部分病理學表現(xiàn)，未全面觀察炎性細胞浸潤、脫髓鞘和軸索受累等病理學特點。綜上，本課題組擬采用3 種不同磷脂肽段免疫具有相同遺傳背景的Lewis大鼠，觀察動物模型的神經(jīng)功能評分、炎性細胞浸潤的部位和程度、脫髓鞘分級和有無軸索受累，同時探索病灶局部黏附分子和趨化因子基因的表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Lewis 大鼠(雌性，6～8 周，160～180 g，SPF 級)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學實驗動物中心實驗室，環(huán)境設有恒溫、恒濕和除菌換氣系統(tǒng)，具有嚴格的微生物控制系統(tǒng)。大鼠3 只一籠，光照周期為12/12 h。本研究嚴格遵循《實驗動物管理條例》，經(jīng)首都醫(yī)科大學倫理委員會批準(批準號:2012-X-87)。所有手術操作均采用水合氯醛10%麻醉(1 ml/100 g)。

1.2 主要試劑 豚鼠MBP68-86:序列YGSLPQKSQRSQDENPV。大鼠MBP82-99:序列DENPVVHFFKNIVTPRTP。大鼠MOG35-55:序列MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK。以上肽段純度＞99%，購自上海吉爾生化有限公司。不完全弗氏佐劑(Freund's incomplete adjuvant，IFA)購自美國Sigma 公司，抗NF-200 抗體(Neurofilament-200，抗神經(jīng)絲蛋白-200抗體)購自Abcam 公司，Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司，反轉錄試劑盒和RT-PCR 試劑盒購自大連TaKaRa 公司。

1.3 實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠模型建立 IFA 加入人結核分枝桿菌(H37Ra)制備成含有4 mg/ml H37Ra 的弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant，CFA)。CFA 與等體積的含有1 mg/ml 的MBP68-86、1 mg/ml 的 MBP82-99、2 mg/ml 的MOG35-55 的磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline，PBS，pH7.4)均勻混合制備免疫乳劑。將大鼠隨機分為5 組，分別為正常對照組、佐劑對照組、MBP68-86 組、MBP82-99 組、MOG35-55 組、每組20只。向大鼠兩側尾根皮下分別注射乳劑100 μl，總計每只大鼠注射乳劑200 μl。正常組大鼠不接受乳劑免疫。佐劑對照組接受200 μl 的CFA 與PBS 的混合乳劑。MBP68-86 組、MBP82-99 組、MOG35-55組大鼠分別接受100 μg MBP68-86 組、100 μg MBP82-99 組、200 μg MOG35-55。

1.4 EAE 大鼠神經(jīng)功能評分和體重監(jiān)測 免疫后每組各取6 只大鼠每天進行神經(jīng)功能評分，并測量體重。神經(jīng)功能評分采用以下方法:0 分:無體征;1分:尾部無力;2 分:單個或雙后肢不完全性癱瘓;3分:單個或雙后肢完全性癱瘓;4 分:伴有前肢無力或癱瘓;5 分:瀕死狀態(tài)或死亡。

1.5 組織學觀察

1.5.1 制備石蠟切片 免疫后第12～15 天(Day post immunization，dpi)，每組取8 只大鼠經(jīng)心臟灌注生理鹽水和4%多聚甲醛。分別取出大腦、腦干、小腦和脊髓，置入4℃PFA 中放置4 h。制備石蠟組織塊和組織切片。

1.5.2 HE 染色觀察炎性細胞浸潤 每只大鼠每個部位隨機選10 張切片進行HE 染色，于×400 光學顯微鏡下觀察每張切片炎性細胞浸潤灶的數(shù)目。一個炎性細胞浸潤灶定義為至少20 個炎性細胞聚集在一起［12］。采用Photoshop 軟件計算每張組織切片的面積，并計算每平方厘米組織炎性細胞浸潤灶的數(shù)目。

1.5.3 快藍(Luxol Fast Blue，LFB)染色觀察髓鞘每個部位另選10 張切片行LFB 染色。顯微鏡下觀察有無髓鞘脫失。脊髓脫髓鞘的嚴重程度按照評分標準進行［12］。

1.5.4 免疫組化染色，觀察軸索受累情況 石蠟切片采用3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸修復液抗原修復，滴加一抗抗NF-200 抗體(1∶100 稀釋)，4℃過夜，切片不加一抗作為陰性對照。滴加二抗，DAB 顯色、蘇木素復染和分化，返藍，脫水、透明和封片;鏡下觀察軸索受累情況，重點觀察是否存在軸索腫脹、變細、斷裂、卵形體形成［13］。

1.6 實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR) 采用RT-PCR 方法定量測定CCL-7、VCAM-1 和NEFM的mRNA 表達情況。免疫后第10 天，每組取6 只大鼠拉頸處死，迅速取出各組大鼠大腦、小腦、腦干和脊髓，快速放入液氮中滅活RNA 酶。采用Trizol 試劑提取各部位全基因組RNA。去除DNA，反轉錄成cDNA。實時定量PCR:CCL-7 前向引物序列(GGGACCAATTCATCCACTTGC)，反向引物序列(TCAGCACAGACTTCCATGCC)。VCAM-1 前向引物序列(GGAAATGCCACCCTCACCTT)，反向引物序列(CACCTGAGATCCAGGGGAGA)。NEFM前向引物序列(TCTGTACACACCCGAA-CAGC)，反向引物序列(CTGTGAGGGCGTCTTCA-CATT)。94℃反應5 min;變性和擴增和延伸，94℃反應30 s，58℃反應30 s，72℃反應40 s，共40 個循環(huán);72℃反應7 min。采用ΔΔcycle threshold (ΔΔCt)方法進行定量分析［14］?；蚩截悢?shù)經(jīng)管家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的拷貝數(shù)校正。計算2ΔΔCt值，即為實驗組的目的基因表達量是對照組表達量的百分數(shù)，大于200%為表達上調，小于50%為表達下調。

1.7 統(tǒng)計學分析 使用SPSS16.0 進行分析。ANOVA 和Student's T-test 用于組間差異比較。數(shù)據(jù)以±s 表示。組間神經(jīng)功能評分比較采用非參數(shù)Mann-Whitney U 檢驗。采用Pearson 相關分析或者偏相關分析方法進行相關分析。以P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EAE Lewis 大鼠神經(jīng)功能評分變化規(guī)律 MBP82-99 組和MBP68-86 組大鼠發(fā)病率為100%，MOG35-55 組和對照組大鼠均未表現(xiàn)出EAE 的臨床體征。MBP68-86 組大鼠的神經(jīng)功能評分較MBP82-99 組大鼠高(P ＜0.05)。各組大鼠神經(jīng)功能評分變化趨勢見圖1。

2.2 組織學表現(xiàn)

2.2.1 神經(jīng)組織炎性細胞浸潤情況 對照組大鼠各神經(jīng)組織均未見到炎性細胞浸潤。MBP68-86 組、MBP82-99 組兩組大鼠的大腦、腦干、小腦和脊髓組織均發(fā)現(xiàn)炎性細胞浸潤，以小血管周圍和軟脊膜下為主。MOG35-55 組大鼠僅有脊髓組織存在炎性細胞浸潤。HE 代表性圖片見圖2A。各組大鼠不同部位神經(jīng)組織炎性細胞浸潤灶數(shù)目/cm2見圖2B。各組大鼠脊髓組織炎性細胞浸潤數(shù)目均高于其余部位(P ＜0.01)，且MBP68-86 組和MBP82-99 組的脊髓組織炎性細胞浸潤數(shù)目高于MOG35-55 組大鼠(P＜0.01)。

本研究還分析了MBP82-99 組大鼠神經(jīng)功能評分與脊髓實質炎性細胞浸潤數(shù)目/cm2之間的關系，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)功能評分與脊髓實質炎性細胞浸潤數(shù)目呈正相關(r=0.494)。

2.2.2 神經(jīng)組織脫髓鞘和軸索受累觀察 各組大鼠神經(jīng)組織LFB 染色均未見任何脫髓鞘改變，見圖3。本研究各組大鼠也未見軸索受累。

圖1 免疫后各組大鼠的神經(jīng)功能評分變化Fig.1 Neurological score of EAE rats induced by MBP68-86，MBP82-99，MOG35-55 and CFA only

圖2 大鼠神經(jīng)組織HE 染色的代表性圖片，不同部位神經(jīng)組織炎性細胞浸潤灶數(shù)目/cm2(×400)Fig.2 Inflammatory infiltrates in CNS of rats at 12 -15th day post immunization(×400)

圖3 MBP68-86 誘導的EAE 大鼠脊髓組織LFB 髓鞘染色圖片，未見脫髓鞘現(xiàn)象(×400)Fig.3 LFB staining of spinal cord of MBP68-86 induced EAE didn't showed demyelination(×400)

圖4 各組大鼠不同部位神經(jīng)組織的CCL-7、VCAM-1、NEFM 基因表達調節(jié)Fig.4 Relative mRNA expression of CCL-7，VCAM-1 and NEFM

2.3 各組大鼠不同部位神經(jīng)組織CCL-7、VCAM-1、NEFM 基因的表達調節(jié)情況 CCL-7 mRNA 表達情況(圖4A):MBP 組大鼠的大腦、腦干、小腦和脊髓該基因表達上調，MOG 組大鼠各部位的基因表達無上下調節(jié)。

VCAM-1 mRNA 表達情況(圖4B):MBP68-86組大鼠的大腦、腦干、小腦、脊髓和MBP82-99 組大鼠的大腦、腦干和脊髓該基因表達上調。NEFM mRNA 表達情況(圖4C):MBP68-86 組和MBP82-99組大鼠的腦干和脊髓該基因表達上下調。

2.4 炎性細胞浸潤數(shù)目與CCL-7、VCAM-1、NEFM基因的相對表達之間的關系 MBP82-99 和MBP 68-86 兩組大鼠脊髓的炎性細胞浸潤數(shù)目/cm2與CCL-7、VCAM-1 的mRNA 表達水平呈正相關(R1=0.52，R2=0.17)，脊髓和腦干NEFM 的mRNA 水平與炎性細胞浸潤數(shù)目/cm2呈負相關(r=-0.61)。

3 討論

MS 的臨床表現(xiàn)和病理學特征具有高度異質性［1］。MS 的臨床表現(xiàn)和預后均與神經(jīng)系統(tǒng)的炎性細胞浸潤部位有關，但炎性細胞選擇性浸潤不同的神經(jīng)組織部位的機制尚不明確。我們推測可能與不同的磷脂肽段受免疫攻擊有關。因此在本研究中，我們采用不同的磷脂肽段免疫Lewis 大鼠，并觀察其病理學表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)不同的磷脂肽段可以誘發(fā)不同的病理學特征。

本研究發(fā)現(xiàn)3 種肽段免疫Lewis 大鼠后，病灶分布不同:MBP82-99、MBP68-86 兩組大鼠的脊髓、大腦、腦干和小腦中可發(fā)現(xiàn)炎性細胞浸潤灶，但是僅在MOG35-55 組大鼠的脊髓中發(fā)現(xiàn)炎性病灶，且炎性細胞浸潤程度不一致，但是不同磷脂肽段誘導不同的炎性病灶分布的原因尚不明確。本研究使用具有相同遺傳背景的大鼠，仍發(fā)現(xiàn)病灶分布的差異，因此可除外遺傳背景的影響。免疫所用的肽段具有不同的溶解性和生物利用度可能是另外一個影響肽段致腦炎活性的原因。Lassmann 等研究發(fā)現(xiàn)將不同磷脂肽段特異性T 細胞轉移至Lewis 大鼠體內(nèi)，誘導的不同部位神經(jīng)組織的病灶，是由于所用磷脂肽段不同所致［7］。因此，T 細胞的抗原特異性可能可以部分解釋EAE 的不同臨床表現(xiàn)和病理表現(xiàn)。

本研究使用200 μg MOG35-55 免疫Lewis 大鼠，觀察8 周，并未發(fā)現(xiàn)模型大鼠表現(xiàn)出相應的臨床體征，且僅在脊膜下觀察到炎性細胞浸潤，與既往研究不一致。既往曾有研究使用200 μg MOG35-55 免疫Lewis 大鼠，在免疫后2 周左右表現(xiàn)出體重下降和后肢無力。雖然Adelmann［5］觀察到MOG 誘導的EAE 神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥，但是同本研究一樣，均未發(fā)現(xiàn)相應的臨床體征。Ichikawa［15］發(fā)現(xiàn)MOG35-55 誘導的神經(jīng)組織炎性細胞浸潤主要集中在側腦室周圍白質、丘腦、腦干、小腦和脊髓。然而，在我們的研究中，僅在脊膜下發(fā)現(xiàn)炎性細胞浸潤，脊髓實質和其余部位神經(jīng)組織均未發(fā)現(xiàn)炎性細胞。隨后的RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)神經(jīng)組織中趨化因子和黏附分子的水平基本無上調，可能與之相關。本實驗動物臨床體征、病理學特征與既往研究不同的原因可能在于:與其他研究所使用的Lewis 大鼠的克隆不同。

本研究通過免疫組織化學方法并未發(fā)現(xiàn)各組大鼠神經(jīng)組織存在軸索損害，但是在神經(jīng)組織中炎性浸潤最明顯的部位——脊髓和腦干的NEFM mRNA表達水平下降，且相關分析顯示其mRNA 水平與炎性浸潤灶的數(shù)目呈負相關，由于神經(jīng)絲是軸索的組成成分之一，實驗結果提示神經(jīng)組織炎癥反應明顯時可能引起神經(jīng)絲合成障礙，從而導致軸索受累。

CCL-7 和VCAM-1 在EAE 的誘導過程中非常重要。本研究發(fā)現(xiàn)MBP82-99 和MBP68-86 免疫大鼠的神經(jīng)組織中CCL-7 和VCAM-1 的mRNA 水平增加，而且炎性病灶數(shù)目與兩者的mRNA 水平呈正相關，進一步證明了趨化因子和黏附分子在外周炎性細胞通過血腦屏障進入CNS 過程中的重要性。

該研究發(fā)現(xiàn)不同磷脂蛋白誘導Lewis 大鼠神經(jīng)組織炎性細胞浸潤的程度和分布不同，且由于每個MS 患者受累的神經(jīng)組織不盡相同，部分以脊髓和延髓受累為主，部分患者的側腦室周圍白質和腦干受累，因此給予我們的提示是:對不同自身磷脂肽段的攻擊可能導致了不同神經(jīng)部位神經(jīng)組織的受累。

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