C-反應(yīng)蛋白上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析試紙條的研制

周明澤

(北京熱景生物技術(shù)有限公司，北京100076)

上轉(zhuǎn)磷光技術(shù)(UPT)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種具有高靈敏度，基于上轉(zhuǎn)磷光體UCP的新型生物檢測(cè)技術(shù)［1］。其中，上轉(zhuǎn)磷光顆粒是納米級(jí)的晶體顆粒，它由包埋于氧化硫等惰性材料中的稀土鑭系元素組成。其特性可由紅外線(xiàn)激發(fā)，而發(fā)射紅、藍(lán)、綠等不同波長(zhǎng)的可見(jiàn)光［2］。磷光信號(hào)可由改進(jìn)的落射顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察，并可用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)和分析，達(dá)到定性、定量檢測(cè)生物活性分子的目的［3］。

UCP具有高度的靈敏性、穩(wěn)定性、簡(jiǎn)易性、靈活性、安全性等獨(dú)特光學(xué)特性，使其作為新型標(biāo)記物在生物檢測(cè)領(lǐng)域?qū)l(fā)揮巨大的潛能。迄今為止，上轉(zhuǎn)磷光技術(shù)已被應(yīng)用于免疫標(biāo)記分析、免疫層析分析等多種標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)中。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)C-反應(yīng)蛋白濃度甚至在正常范圍內(nèi)的輕度升高都與心血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)性增加有關(guān)，可以推測(cè)心肌梗死事件發(fā)生的可能性。超敏C-反應(yīng)蛋白是心腦血管疾病中的一項(xiàng)獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)指標(biāo)，可以敏感地預(yù)測(cè)糖尿病合并心腦血管事件的危險(xiǎn)發(fā)生率［4］。所以CRP的定量測(cè)定至關(guān)重要。

CRP是一種能與肺炎鏈球菌C多糖體反應(yīng)的急性時(shí)相蛋白，在組織損傷、感染等刺激下，被激活的單核細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素1(IL．1)，刺激肝細(xì)胞加速合成CRP，對(duì)炎癥感染的發(fā)生發(fā)展存在很大的相關(guān)［5－6］。筆者是在雙抗體夾心免疫分析的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的檢測(cè)方法，具有反應(yīng)時(shí)間短，靈敏度高，特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性好，無(wú)環(huán)境污染和放射危害的特點(diǎn)［7］。

1 材料與方法

1．1 抗體配對(duì)篩選 抗體配對(duì)篩選采用的是同時(shí)對(duì)幾組抗體標(biāo)記及包被，最后相互配對(duì)來(lái)測(cè)定CRP校準(zhǔn)品，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果來(lái)選擇標(biāo)記及包被抗體。主要利用克隆號(hào)為3B11、3C8等抗體來(lái)標(biāo)記及包被，包被量按2．0 mg/ml，標(biāo)記比例按mucp∶m抗體=20∶1來(lái)測(cè)定CRP校準(zhǔn)品，最終根據(jù)測(cè)定的靈敏度、測(cè)定結(jié)果梯度及反應(yīng)強(qiáng)度等來(lái)選擇抗體配對(duì)。

表1 抗體配對(duì)組合

1．2 反應(yīng)條件的選擇 由于CRP測(cè)定過(guò)程中反應(yīng)時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響，為了滿(mǎn)足臨床快速診斷的要求，同時(shí)也要保證試劑測(cè)定的準(zhǔn)確性及符合率，故在相同的試紙條測(cè)定相同樣本在不同時(shí)間的變化，該試驗(yàn)主要是加樣孔中分別加入稀釋后的樣本100μl，室溫反應(yīng)不同時(shí)間后，測(cè)量各試紙條的T/C值來(lái)平行對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2．1 抗體配對(duì)篩選 由圖1可知，經(jīng)過(guò)2株抗體3B11及3C8的相互配對(duì)，結(jié)果表明:①3C8標(biāo)記和3B11包被測(cè)定結(jié)果靈敏度好，線(xiàn)性相關(guān)也很好，在抗體配對(duì)中，該標(biāo)記、包被的配對(duì)情況均符合要求;②3B11標(biāo)記和3C8包被測(cè)定結(jié)果靈敏度不是特別好，線(xiàn)性相關(guān)也不是特別好，但抗體配對(duì)仍有反應(yīng)，若3C8標(biāo)記與3B11配對(duì)仍無(wú)法調(diào)節(jié)到最優(yōu)，可以考慮使用此配對(duì)方案來(lái)調(diào)整;③3C8標(biāo)記及3C8包被配對(duì)不成功，反應(yīng)均沒(méi)有一定的梯度，高濃度仍與陰性相同;④3B11標(biāo)記及3B11包被配對(duì)并不是最好，線(xiàn)性相關(guān)并不好，目前暫且不使用此配對(duì)。綜上分析，目前CRP測(cè)定使用3C8標(biāo)記和3B11包被，可以實(shí)現(xiàn)一個(gè)較優(yōu)組合。

2．2 反應(yīng)條件的選擇 由圖2可知，反應(yīng)5 min時(shí)T/C值較低，線(xiàn)性也不夠理想，反應(yīng)10～20 min時(shí)T/C值基本穩(wěn)定，線(xiàn)性、靈敏度也較滿(mǎn)意?？紤]到免疫層析反應(yīng)的特點(diǎn)，一般15 min才能完成層析過(guò)程，所以選擇15 min作為反應(yīng)時(shí)間。

3 討論

上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的出現(xiàn)為免疫層析技術(shù)的發(fā)展提供了新的空間。自然界中所有物質(zhì)的發(fā)光過(guò)程均需遵循Stokes規(guī)則，即發(fā)射光的波長(zhǎng)長(zhǎng)于激發(fā)光的波長(zhǎng)［8］。

上述特點(diǎn)使得UCP作為生物標(biāo)記物有著極為廣泛的應(yīng)用前景。因而在以抗原抗體為代表(還可包括核苷酸等)的UCP標(biāo)記技術(shù)平臺(tái)的基礎(chǔ)上，使其與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，再利用微型化的光電子材料可以開(kāi)發(fā)出一種靈敏、快速、操控簡(jiǎn)易的免疫診斷分析儀［9］。

目前美國(guó)國(guó)防部研制的UPT儀器用于生物防恐檢測(cè)鼠疫、定量檢測(cè)炭疽芽孢，美國(guó)Orasure公司研制的UPT儀器用于檢測(cè)艾滋病病毒抗體、毒品含量定量檢測(cè)等，我國(guó)國(guó)內(nèi)科研單位如軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病研究所楊瑞馥課題組研究該領(lǐng)域已經(jīng)將近10年，已經(jīng)研制成功鼠疫、O157細(xì)菌、炭疽芽孢、表面抗體定量檢測(cè)等免疫層析檢測(cè)試劑，相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表20余篇，SCI文獻(xiàn)發(fā)表10 余篇［10］。

4 結(jié)論

該研究主要在上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)平臺(tái)上，通過(guò)抗體篩選、反應(yīng)條件的選擇來(lái)確立C-反應(yīng)蛋白測(cè)定條件，建立起包被濃度2 mg/ml和反應(yīng)時(shí)間15 min時(shí)，與人血清白蛋白、膽紅素等結(jié)構(gòu)類(lèi)似物無(wú)交叉反應(yīng)，且具有反應(yīng)時(shí)間短，靈敏度高，特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性好，無(wú)環(huán)境污染和放射危害的試劑。同時(shí)通過(guò)抗體配對(duì)篩選，3C8標(biāo)記和3B11包被可以實(shí)現(xiàn)一個(gè)較優(yōu)組合，2 mg/ml的包被濃度及反應(yīng)時(shí)間在15 min時(shí)，能保證T/C值，線(xiàn)性和靈敏度較好。

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