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    西瓜抗枯萎病種質(zhì)資源的分子標(biāo)記篩選研究

    2015-03-18 12:22:44王吉明李楠楠尚建立李娜徐永陽(yáng)馬雙武
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年32期
    關(guān)鍵詞:感病枯萎病抗病

    王吉明,李楠楠,尚建立,李娜,徐永陽(yáng),馬雙武

    (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所,河南鄭州450009)

    西瓜枯萎病是由半知菌亞門鐮孢屬尖孢鐮刀菌西瓜?;?Fusarium oxysporum f.sp.niveurn)寄生引起的一種世界性真菌土傳病害,嚴(yán)重制約西瓜的生產(chǎn)[1-4]。目前西瓜抗枯萎病育種主要采用人工接種鑒定技術(shù)進(jìn)行抗性選擇,易受環(huán)境和接種技術(shù)的影響,存在鑒定時(shí)間長(zhǎng)、準(zhǔn)確性差、鑒定效率低等缺點(diǎn),分子標(biāo)記技術(shù)鑒定具有不易受環(huán)境影響,鑒定時(shí)間短,準(zhǔn)確性高,鑒定效率高等優(yōu)點(diǎn),可作為分子輔助選擇的重要工具,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,研究者已對(duì)西瓜枯萎病病菌1號(hào)生理小種的抗病基因(Fon-1)進(jìn)行定位[5-8]。筆者采用張屹等[8]發(fā)表的西瓜枯萎病生理小種1抗性基因緊密連鎖Caps標(biāo)記“fon_7716”對(duì)130份不同類型西瓜種質(zhì)進(jìn)行抗性基因分子檢測(cè)分析,以期為西瓜抗枯萎病抗原篩選和分子輔助育種提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料 供試材料為國(guó)家西瓜甜瓜中期庫(kù)(河南,鄭州)提供的西瓜種質(zhì)資源,包括地方品種、育成品種(系)和野生種質(zhì),共計(jì)130份(表1),具有較為廣泛的代表性。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 DNA提取。于西瓜果實(shí)膨大期取蔓上幼嫩真葉用于基因組 DNA的提取,采取 CTAB法提取基因組 DNA[9]。

    1.2.2 PCR 反應(yīng)體系。擴(kuò)增反應(yīng)體系 25 μl,包括 12.5 μl 2×Taq Master Mix,2 μl模板 DNA,10 μmol/μl上、下游混合引物2μl,ddH2O 8.5μl。擴(kuò)增反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性 5 min;94℃ 20 s,55℃ 20 s,72℃ 30 s,34個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min;4℃保存。2×Taq Master Mix購(gòu)自北京百泰客生物技術(shù)有限公司。引物7716_fon為張屹等[8]已發(fā)表的西瓜抗枯萎病基因分子標(biāo)記,由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成。7716_fon 引 物 序 列 為:5′-TTAAAAATCATCTCCTCTTTAAAACTATT-3′,5′-ATATATTTGGTCTCCGAGTGTTCAA-3′。

    1.2.3 CAPS反應(yīng)與分析。PCR產(chǎn)物采用 Taq I進(jìn)行酶切,酶切識(shí)別位點(diǎn)為T′CGA,酶切體系為 15 μl,含有 1.5 μl 10 ×Buffer;1.0 μl限制內(nèi)切酶Taq I;5 μl PCR 產(chǎn)物,7.5 μl H2O。酶切程序:65℃酶切16 h,80℃變性20 min,4℃保存。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Fermentas公司。

    擴(kuò)增/酶切產(chǎn)物采用8.0%聚丙烯酰胺電泳,280 V恒定電壓下電泳50 min,銀染顯色后拍照分析;PCR產(chǎn)物酶切后電泳出單條帶170 bp判定為抗病基因型,出現(xiàn)單條帶104 bp為感病基因型,同時(shí)出現(xiàn)170和104 bp 2條帶為抗/感病雜合基因型。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PCR及Caps酶切結(jié)果 130份西瓜種質(zhì)資源的總DNA提取后均擴(kuò)增出170 bp條帶,但條帶較淺;采用Taq I酶切后部分種質(zhì)的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)104 bp條帶和一條70 bp左右的條帶,將170 bp和104 bp條帶判定為抗病和感病基因型(圖1)。

    2.2 種質(zhì)資源基因型鑒定 在130份種質(zhì)資源中,45份種質(zhì)資源表型為抗病基因型(+),80份種質(zhì)資源為感病基因型(-),5份種質(zhì)資源為抗/感病雜合基因型(+/-)(表1)。

    2.2.1 地方品種基因型鑒定。在34份地方品種類型種質(zhì)資源中,21份種質(zhì)鑒定為抗病基因型,占供試地方品種總數(shù)的61.8%??共』蛐头N質(zhì)包括著名的地方品種三白瓜、撫州瓜、馬鈴瓜、喇嘛瓜、陜西白、黑崩筋等食用西瓜,以及鄭州籽瓜、大板紅籽瓜、皋蘭籽瓜、寧夏紅籽瓜、大安子瓜等籽瓜。

    2.2.2 野生種質(zhì)資源基因型鑒定。選用13份野生種質(zhì)進(jìn)行了抗性基因型鑒定,結(jié)果鑒定出3份抗病基因型種質(zhì),分別為PI 494530、PI 494528、PI 595203,占供試野生種質(zhì)總數(shù)的23.1%,其余均為感病基因型種質(zhì)。

    2.2.3 育成品種基因型鑒定。在82份育成品種(系)類型種質(zhì)資源中,鑒定出21份抗病基因型種質(zhì),主要為久比例、Smokylee、Sugarlee等國(guó)外育成品種,以及紅1號(hào)、中育10號(hào)、中育1號(hào)和96B41等國(guó)內(nèi)育成品種(系),占供試育成品種(系)種質(zhì)總數(shù)的25.6%;另鑒定出5份雜合基因型種質(zhì),分別為 Jan-06、All Sweet、Dixielee、開雜5 號(hào)-1、AB 系;其余為感病基因型種質(zhì),主要為查理斯頓、Black Stone、Calhoun Gray、Black diamond、Crimson Sweet等國(guó)外育成品種和中育9號(hào)、興城紅、火洲1號(hào)、無(wú)杈早、蘇蜜1號(hào)、中汴一號(hào)等國(guó)內(nèi)育成品種。

    表1 西瓜種質(zhì)資源抗枯萎病生理小種1基因型鑒定

    續(xù)表1

    3 討論

    該研究采用Caps標(biāo)記“Fon_7716”對(duì)我國(guó)部分西瓜種質(zhì)資源包括地方品種、野生種質(zhì)、育成品種(系)3種不同類型的種質(zhì)資源進(jìn)行了抗枯萎病生理小種1的基因型鑒定,結(jié)果表明抗性基因型種質(zhì)比例偏高,如我國(guó)地方西瓜品種通常認(rèn)為不抗枯萎病,但在34份我國(guó)地方西瓜品種中,有21個(gè)品種表現(xiàn)為抗病基因型,抗性種質(zhì)比例高達(dá)61.8%,表明抗性基因型和表型抗性性狀之間出現(xiàn)一定的偏差,推測(cè)不同類型種質(zhì)資源之間存在較大的抗性背景遺傳差異,有待進(jìn)一步研究;此外一些公認(rèn)的抗性種質(zhì)如PI296341是目前認(rèn)為兼抗枯萎病生理小種0、1、2的材料,而Calhoun Gray則是開發(fā)“Fon_7716”標(biāo)記的抗性親本材料,這些種質(zhì)在該研究中均表現(xiàn)為感病基因型,出現(xiàn)這種情況可能與采用的試驗(yàn)材料與之前報(bào)道用的材料來(lái)源不同,或在繁殖更新過(guò)程中抗性基因丟失有關(guān)。在育成品種(系)中,Sugarlee、Smokylee、紅1號(hào)等是抗枯萎病育種中較為常用的抗性材料,該研究鑒定為抗病基因型,與表型抗性性狀相符。

    不同西瓜種質(zhì)資源材料其抗病基因可能各不相同,抗性遺傳和表型規(guī)律也相差很大,枯萎病抗性遺傳可能受多個(gè)基因協(xié)同控制[10-18],采用單一分子標(biāo)記難以全面從整個(gè)種質(zhì)資源角度篩選和鑒定抗性種質(zhì),因此十分有必要繼續(xù)從分子水平開展枯萎病的抗性遺傳和抗性機(jī)理研究,并開發(fā)更多緊密連鎖的分子標(biāo)記。

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