高F值牡蠣寡肽酶解條件優(yōu)化

劉雄飛，張鐵濤，武天明

海南熱帶海洋學院食品科學與工程學院（三亞 572022）

高F值寡肽是指利用酶解生物蛋白制備3～9個氨基酸殘基（F值大于20）組成的寡肽的混合物。F值是指混合物中支鏈氨基酸（BCAA，即亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）與芳香族氨基酸（AAA，即苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）物質的量比值[1]。高F值寡肽的主要特征是氨基酸混合物中BCAA與AAA比值遠高于人體模式，在臨床上的應用已從最初的保肝護肝、輔助肝性腦病及苯丙酮尿癥治療延伸到抗疲勞、抗衰老及其他生物活性領域[2]。利用大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、花生（Arachis hy-pogaea）等植物蛋白制備高F值寡肽，并進一步開發(fā)功能食品成為研究焦點[3]。現(xiàn)以牡蠣蛋白為主要原料，通過優(yōu)化活性炭脫除牡蠣蛋白酶解液中芳香族氨基酸的最佳吸附條件，探討溫度、時間、固液比等因素影響，獲取較優(yōu)高F值牡蠣寡肽的酶解條件，為高F值寡肽的開發(fā)奠定理論基礎，為牡蠣系列產品深加工技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

香港巨牡蠣（海南省三亞市旺豪超市）；胰酶（國藥集團化學試劑有限公司）；活性炭（西隴化工股份有限公司）；鄰苯二甲酸氫鉀（上海儀電科學儀器股份有限公司）；混合磷酸鹽（上海儀電科學儀器股份有限公司）；氫氧化鈉（天津市恒興化學試劑制造有限公司）；鹽酸（西隴化工股份有限公司）、無水乙醇（西隴科學股份有限公司）；所用分析試劑均為分析純。

ME204E/02電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DZ-500/1S真空包裝機（上海運馳包裝機械有限公司）；X85-2s磁力攪拌器（金壇市盛藍儀器制造有限公司）；Multifuge X1R高速冷凍離心機[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；PB-10 Sartorius普及型pH計（Sartorius科學儀器股份有限公司）；紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；HWS-26數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市盛藍儀器制造有限公司）；Pilot7-12M真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 高F值牡蠣寡肽的生產工藝流程

牡蠣肉→預處理→酶解→調pH→活性炭處理→離心→過濾→高F值寡肽

1.2.2 原料預處理

牡蠣清洗干凈、勻漿，煮沸20 min，轉移到三角瓶中，置于冰箱中備用。

1.2.3 固液比對脫芳后寡肽液A220/A280的影響

選擇固液比1∶10，1∶30，1∶50，1∶70，1∶90和1∶110（g/mL），控制溫度30 ℃，調節(jié)pH 2.0，吸附處理4 h，選擇A220/A280較高條件下為最佳固液比。

1.2.4 pH對脫芳后寡肽液A220/A280的影響

pH為2.0～10.0（梯度為2.0），控制溫度30 ℃、固液比1∶30（g/mL），吸附4 h，分析不同條件下寡肽液A220/A280高低，選擇較優(yōu)pH。

1.2.5 吸附時間對脫芳后寡肽液A220/A280的影響

使用不同的吸附時間檢測對吸附效果的影響，通過胰酶處理牡蠣酶解液，控制溫度30 ℃，固液比1∶30（g/mL），調節(jié)pH 2.0，分別吸附處理1，2，3，4和5 h，在8 000 r/min條件下處理20 min，取上清液，分析不同條件下寡肽液A220/A280高低，選擇較優(yōu)吸附時間[4]。

1.2.6 溫度對對脫芳后寡肽液A220/A280的影響

使用不同的溫度檢測對吸附效果的影響，通過胰酶處理牡蠣酶解液，控制固液比1∶30（g/mL）、pH 2.0，分別在25，35，45，55和65 ℃條件下處理4 h，在8 000 r/min條件下處理20 min，取上清液，分析不同條件下寡肽液A220/A280高低，選擇較優(yōu)吸附溫度。

1.2.7 三因素三水平正交試驗

為保證試驗的精準性，在單因素的基礎上進行正交試驗，以BCAA保留率和AAA去除率情況作為主要測量指標，采用三水平三因素試驗進行優(yōu)化，優(yōu)選固液比、pH和時間進行正交優(yōu)化試驗，試驗因素水平表如表1所示。由此確定最優(yōu)條件。

表1 三因素三水平試驗設計表

1.2.8 活性炭篩選

選取6種不同的類型活性炭，靜態(tài)吸附方式，以BCAA保留率和AAA去除率為主要評價指標，通過計算AAA和BCAA的吸光度平均值，選擇A220/A280較高值，初步篩選活性炭類型[5]。

1.2.9 AAA去除率和BCAA保留率測定

一般的寡肽類混合物中，芳香族肽類氨基酸和支鏈氨基酸在測定熒光波長值分別為λ=280 nm和λ=220 nm的特殊情況下的2個波長上，具有最高的吸收特征性質和吸收峰，其他的肽類氨基酸在這一波長條件下并沒有被直接吸收，酶解后樣品在轉速8 000 r/min下處理20 min，取上清液用紫外可見分光光度計測定寡肽聚合物中AAA和BCAA的吸光度，通過式（1）和（2）可計算AAA去除率和BCAA保留率。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 活性炭類型對吸附脫芳后寡肽液A220/A280的影響

選用6種0.075 0 mm孔徑（200目）活性炭作為吸附材料，對比表2不同活性炭的吸附效果，活性炭1吸附脫芳后寡肽液A220/A280值顯著高于其他5種活性炭。高F值寡肽的制備需要在去除芳香族氨基酸的同時，盡量保留支鏈氨基酸。因此，選用活性炭1作為吸附劑。進一步分析發(fā)現(xiàn)，雖然6種活性炭都是粉末狀，但是活性炭1的粉末較為粗大，相對而言可以更好地保留BCAA[6]，基于此選取活性炭1作為吸附活性炭材料。

表2 不同活性炭吸附脫芳后寡肽液A220/A280

2.1.2 固液比對脫芳后寡肽液A220/A280的影響

由表3可知，隨著固液比增加，固液比為1∶30（g/mL）吸附脫芳后寡肽液A220/A280出現(xiàn)較明顯的下降，其活性炭含量逐步變少，顯示出其對AAA吸附的能力逐步下降，而BCAA保留率則逐步提高，反之亦然。為確保有相對較高BCAA的同時盡可能地降低AAA含量，綜合試驗結果最佳固液比為1∶30（g/mL）[7]。

表3 不同固液比對脫芳后寡肽液A220/A280的影響

2.1.3 pH對對脫芳后寡肽液A220/A280的影響

從表4中A220/A280數(shù)值變化可知，隨著溶液酸堿度增加，AAA去除率逐漸下降而BCAA保留率卻在緩慢增加[8]，綜上可知溶液pH 2.0時A220/A280值最高，因此優(yōu)選最佳溶液pH 2.0。

表4 不同pH對脫芳后寡肽液A220/A280的影響

2.1.4 吸附時間對脫芳后寡肽液A220/A280的影響

從表5中數(shù)據(jù)可知，隨吸附時間持續(xù)推移，A220/A280數(shù)值逐漸增大，4 h增大不明顯，可能是由于隨吸附時間的推移，吸附已逐漸變得趨于飽和，進行一種繼續(xù)性和擴大性的吸附，但時間對其他吸附物質樣品吸附時間效果的變化影響并不明顯，因此，綜合考慮，最佳吸附時間為4 h。

表5 不同吸附時間對脫芳后寡肽液A220/A280的影響

2.1.5 溫度對脫芳后寡肽液A220/A280的影響

從表6中A220/A280可知，隨著溫度增加，BCAA保留率呈現(xiàn)先下降后增加趨勢，但變化并不明顯，而AAA去除率則呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。由于在試驗過程中溫度升高會對溶質的熱穩(wěn)定性產生一定影響，而溫度指標對BCAA保留率和AAA去除率的影響又不是特別明顯[9]，基于此，最終溫度為25 ℃。

表6 不同溫度對脫芳后寡肽液A220/A280的影響

2.2 三因素三水平正交試驗

高F值牡蠣寡肽正交試驗結果如表7所示。根據(jù)K值大小，理論最優(yōu)水平為A1B3C2，這與正交試驗結果A1B3C3時A220/A280最高達到2.26，二者有一定的偏差，相差不大，結合前面單因素分析結果，可近似忽略。

表7 高F值牡蠣寡肽正交試驗結果

由極差分析可知，時間為影響最大的條件，極差值為1.44，pH的影響顯著性最小，僅為0.09，分析得知影響高F值牡蠣寡肽的主要因素為吸附時間＞固液比＞pH。最佳理論制備工藝參數(shù)為固液比1∶10（g/mL），pH 3.0、吸附時間5 h。

3 結論

所選擇的6種活性炭均展現(xiàn)出較強的BCAA保留能力和AAA吸附能力，試驗篩選出活性碳1效果最好。單因素試驗獲取較優(yōu)的固液比1∶30（g/mL）、pH 2.0、吸附溫度25 ℃、吸附時間4 h。三因素三水平正交試驗極差結果分析表明，較優(yōu)的提取條件為固液比1∶10（g/mL）、pH 3.0、吸附溫度25 ℃、吸附時間5 h，其中影響因素順序為時間＞固液比＞pH。