長(zhǎng)柄側(cè)耳胞外多糖PSEPS2-A的分離純化及降血糖活性

李 燦，胡 芳，朱瑞娟，陳同強(qiáng)，鄧西貝，王淑敏，封士蘭,*

（1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410111；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117）

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長(zhǎng)柄側(cè)耳胞外多糖PSEPS2-A的分離純化及降血糖活性

李 燦1,2，胡 芳1，朱瑞娟1，陳同強(qiáng)2，鄧西貝3，王淑敏3，封士蘭3,*

（1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410111；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117）

摘 要：研究長(zhǎng)柄側(cè)耳胞外多糖分離純化方法及對(duì)糖尿病小鼠的降血糖作用。從長(zhǎng)柄側(cè)耳液體發(fā)酵液中提取出長(zhǎng)柄側(cè)耳胞外多糖，采用Sevag法除蛋白、H2O2脫色素、透析和Sepadex G-200、100柱色譜分離純化得到一種分子質(zhì)量單一的多糖組分PSEPS2-A，以凝膠滲透色譜與光散射儀聯(lián)用技術(shù)（gel permeation chromatography-eighteen angle laser scattering detector，GPC-MALLS）和元素分析等其他化學(xué)分析法考察多糖的理化性質(zhì)。以四氧嘧啶誘導(dǎo)建立糖尿病小鼠模型，通過(guò)不同劑量PSEPS2-A治療，比較治療前后小鼠體質(zhì)量及空腹血糖值、糖耐量水平、臟器指數(shù)、肝組織肝糖原水平變化。結(jié)果表明：PSEPS2-A的分子質(zhì)量為6.268×105D，在0.9% NaCl溶液中為棒狀結(jié)構(gòu)的多糖。PSEPS2-A能顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖值（P＜0.05）和血糖曲線下面積（P＜0.05），減緩糖尿病小鼠體質(zhì)量的負(fù)增長(zhǎng)；顯著降低肝臟、腎臟臟器指數(shù)（P＜0.05），顯著升高肝糖原水平（P＜0.05），促進(jìn)肝糖原合成。PSEPS2-A是一種新的長(zhǎng)柄側(cè)耳胞外多糖，在一定劑量下具有調(diào)節(jié)糖代謝、降低血糖、改善糖尿病癥狀的作用。

關(guān)鍵詞：長(zhǎng)柄側(cè)耳；胞外多糖；分離純化；糖尿??；降血糖

E-mail：lic2012@lzu.edu.cn

長(zhǎng)柄側(cè)耳（Pleurtus spodotecus Fr.）系傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬食藥用真菌，別名灰白側(cè)耳，主要分布在吉林、云南等地。長(zhǎng)柄側(cè)耳不僅營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)肥厚、味道鮮美，而且含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、維生素、核苷酸和不飽和脂肪酸，具有很高的醫(yī)療保健作用，有延年益壽的功效[1-3]。作為自然界中含量最豐富的大分子聚合物之一，多糖廣泛分布于動(dòng)植物、真菌和細(xì)菌中[4]，可通過(guò)其特異性識(shí)別受體[5]發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗感染、抗消化性潰瘍、抗氧化、防衰老等多種功效[6-8]。

目前，糖尿病的發(fā)病率日益增高，嚴(yán)重危害人類健康，糖尿病導(dǎo)致的死亡率已在繼心血管疾病和癌癥之后位列第三[9]。糖尿病是一種多病因的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，尚無(wú)理想的治療方法。傳統(tǒng)磺酰脲類和雙胍類降糖藥，久用會(huì)產(chǎn)生依賴性和不良反應(yīng)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)始從天然產(chǎn)物中篩選降糖類化合物[10-12]，取得了一些進(jìn)展。目前研究證實(shí)，真菌多糖有顯著的降低血糖、改善糖耐量、增加體內(nèi)肝糖原的作用[13-17]，其作用是由調(diào)節(jié)糖代謝、促進(jìn)肝糖原的合成、減少肝糖原分解引起的。但是，目前對(duì)于長(zhǎng)柄側(cè)耳的研究還停留在長(zhǎng)柄側(cè)耳液體發(fā)酵技術(shù)研究等初步研究[18-19]，還未見(jiàn)長(zhǎng)柄側(cè)耳胞外多糖分離純化和降血糖活性的相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)從長(zhǎng)柄側(cè)耳液體發(fā)酵液胞外多糖，經(jīng)分級(jí)醇沉、Sevag法除蛋白、H2O2脫色素和葡聚糖Sepadex柱色譜等步驟分離純化出一種均一組分PSEPS2-A，并對(duì)其純度和糖含量進(jìn)行分析，考察不同劑量的PSEPS2-A降血糖作用，并對(duì)糖尿病小鼠血糖值、糖耐量和肝糖原水平等糖代謝相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，為研制降血糖功能性食品或藥物的開(kāi)發(fā)提供參考。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物、材料與試劑

清潔級(jí)昆明種小白鼠，體質(zhì)量（20±2）g，蘭州大學(xué)動(dòng)物中心提供。

長(zhǎng)柄側(cè)耳由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院培養(yǎng)提供。

Sepadex G-200、Sepadex G-100 北京 Biotopped公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)單糖 中國(guó)食品藥品檢定研究院；剛果紅、牛血清白蛋白、四氧嘧啶（alloxan） 美國(guó)Sigma公司；消渴丸（批號(hào)：R01322） 廣州白云山中一藥業(yè)有限公司；口服葡萄糖（批號(hào)：121228） 重慶和平制藥有限公司；95%乙醇、生理鹽水 甘肅扶正藥業(yè)科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)中所用其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

BP211D型和BS224S型電子天平、Multi EA 4000元素分析儀 德國(guó)Elementar Analysensysteme公司；UV-1700紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；紫外掃描儀（Lambda 25 Uv/Vis spectrometer） 美國(guó)Perkin Elmer公司；DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BS-100N自動(dòng)部分收集器、BT-100N數(shù)顯恒流泵 上海青浦滬西儀器廠；CR22GⅡ離心機(jī) 日本日立公司；Freezone 6PWS型真空冷凍干燥儀 美國(guó)Labconco公司；透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量3 500） 美國(guó)科技發(fā)展公司；Waters 600高效液相色譜儀、UltrahydrogelTM1000、500色譜柱、示差折光檢測(cè)器美國(guó)Waters公司；Dawn HeleosⅡ型十八角度激光散射儀美國(guó)懷雅特技術(shù)公司；三諾安穩(wěn)血糖測(cè)試儀 長(zhǎng)沙三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司；Well scan MK3型酶標(biāo)儀芬蘭Thermo Labsystems公司。

1.3方法

1.3.1多糖的提取與分離純化[20-23]

長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵液參照齊放等[22]的方法經(jīng)液體發(fā)酵制得；最終得長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵液共40 L，雙層紗布過(guò)濾，10 000×g離心10 min，得到上清液，60 ℃濃縮至5 L。加入95%的乙醇至乙醇終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到30%，在4 ℃條件下靜置過(guò)夜，離心，去除沉淀，上清液繼續(xù)加入95%乙醇至乙醇終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%，在4 ℃條件下靜置過(guò)夜，離心，收集沉淀，冷凍干燥得長(zhǎng)柄側(cè)耳胞外多糖2 （PSEPS2），PSEPS2經(jīng)Sevag法脫蛋白和H2O2除色素后再次以95%乙醇醇沉至50%，以透析袋流水透析48 h、雙蒸水透析24 h，冷凍干燥。用水溶解后（控制質(zhì)量濃度在30 mg/mL左右），經(jīng)Sepadex G-200柱（2.6 cm×70 cm）分離，雙蒸水0.5 mL/min洗脫，每管12 min，收集20 h，苯酚-硫酸法測(cè)定糖含量，收集主要餾分，后經(jīng)Sepadex G-100柱（2.6 cm×67 cm）分離，雙蒸水0.5 mL/min洗脫，收集20 h得到PSEPS2-A分子質(zhì)量單一的組分。

1.3.2 多糖的理化性質(zhì)測(cè)定

對(duì)PSEPS2-A進(jìn)行外觀及溶解性、碘-碘化鉀反應(yīng)、Molish試劑反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)等[24]分析，多糖中碳（C）、氫（H）、氮（N）、硫（S）采用元素分析儀進(jìn)行分析。

PSEPS2-A總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)單糖；蛋白質(zhì)含量測(cè)定用Bradford法[23]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，全波長(zhǎng)紫外掃描檢測(cè)多糖是否含有核酸和蛋白質(zhì)。采用高效凝膠色譜（high performance liquid chromatography-gel permeation chromatography，HPLC-GPC）示差折光檢測(cè)器聯(lián)用方法對(duì)PSEPS2-A進(jìn)行均一性鑒定，色譜柱為凝膠滲透色譜柱UltrahydrogelTM1000、500串聯(lián)，體積流量0.8 mL/min，柱溫30 ℃，示差折光檢測(cè)器溫度為35 ℃，流動(dòng)相為蒸餾水。

1.3.3 分子質(zhì)量、分子構(gòu)象及分子質(zhì)量分布[23]

采用凝膠滲透色譜與光散射儀聯(lián)用技術(shù)（GPC-eighteen angle laser scattering detector，GPC-MALLS）測(cè)定其分子質(zhì)量、分子構(gòu)象及相對(duì)分子質(zhì)量分布，流動(dòng)相為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9% NaCl與質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02% NaN3的混合溶液。色譜柱為凝膠滲透色譜柱UltrahydrogelTM1000、500 串聯(lián)，體積流量0.8 mL/min，柱溫30 ℃，示差折光檢測(cè)器溫度為35 ℃。

1.3.4 剛果紅反應(yīng)

剛果紅可與具有三螺旋構(gòu)象的多糖形成復(fù)合物，復(fù)合物的λmax與剛果紅相比發(fā)生紅移，因此根據(jù)所研究多糖的水溶液與剛果紅形成配合物的λmax的變化情況，可判斷出所研究多糖是否具有螺旋結(jié)構(gòu)[24]。取5 mg PSEPS2-A樣品，加入2 mL蒸餾水和2 mL 80 μmol/mL剛果紅溶液，逐漸加入4.0 mol/L NaOH，使溶液中的NaOH終濃度分別為0.00、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40、0.50、1.00 mol/L?；靹颍覝胤胖?0 min 后，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描各溶液的最大吸收波長(zhǎng)。另外按照上述方法配制不同NaOH濃度的剛果紅溶液，作為對(duì)照。以NaOH溶液濃度為橫坐標(biāo)，λmax為縱坐標(biāo)作圖。

1.3.5 糖尿病小鼠模型構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

取健康昆明種雄性小鼠80 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，禁食（不禁水）12 h，尾靜脈注射四氧嘧啶80 mg/kg，間隔24 h后腹腔注射四氧嘧啶80 mg/kg。為了避免藥物在成模前引起的動(dòng)物低血糖相及其可能對(duì)小鼠造成的應(yīng)激性損害，每次注射給藥后2.5～5 h，灌胃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%葡萄糖，0.5 mL/只。末次給藥72 h后，禁食（不禁水）10 h，斷尾取血，測(cè)空腹血糖值（fasting blood-glucose，F(xiàn)BG）。FBG＞11.1 mmol/L，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿者，判定為建模成功。

將建模成功的60 只小鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（消渴丸）、PSEPS2-A低劑量組、PSEPS2-A中劑量組、PSEPS2-A高劑量組，每組12 只，編號(hào)。另隨機(jī)抽取12只沒(méi)有注射四氧嘧啶的小鼠作為空白對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照組（消渴丸1 g/kg）、PSEPS2-A低劑量組（0.086 4 mg/kg）、PSEPS2-A中劑量組（0.172 8 mg/kg）、PSEPS2-A高劑量組（0.259 2 mg/kg）[25]按體質(zhì)量灌胃給藥，糖尿病模型組和空白對(duì)照組灌胃給予生理鹽水0.1 mL/10 g。每天灌胃給藥1次，連續(xù)15 d。

1.3.6 指標(biāo)檢測(cè)

觀察小鼠飲食、飲水、尿量、體質(zhì)量（分別在小鼠造模前、造模成功后、給藥第5、10、15天稱量小鼠的體質(zhì)量）、精神狀態(tài)、毛色等狀況。

血糖測(cè)定：用血糖儀測(cè)定第5、10、15天禁食3 h、灌胃5 h后的血糖值；糖耐量[26]測(cè)定：在第15天斷尾采血后給藥1 次，并在給藥后0.5 h給予葡萄糖2.0 g/kg灌胃，于灌胃葡萄糖后0.5、2 h斷尾采血測(cè)血糖值（0 h的血糖值采用第15天給葡萄糖前的空腹血糖值），計(jì)算血糖曲線下面積，比較各組動(dòng)物血糖值及灌胃葡萄糖后各時(shí)間點(diǎn)血糖曲線下面積的變化。

臟器指數(shù)測(cè)定：脫臼處死小鼠，取肝臟、腎臟、胸腺和脾臟，去除脂肪和結(jié)締組織，稱質(zhì)量，并以其質(zhì)量（g）和動(dòng)物體質(zhì)量（g）的比值表示小鼠的臟器指數(shù)。

肝糖原含量測(cè)定（蒽酮法）[27]：取小鼠肝臟400 mg，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸制備組織勻漿，取10%三氯乙酸肝勻漿液l mL，置于10 mL刻度試管中，加入10 mol/L KOH 1 mL，置沸水浴煮沸1 h。取出冷卻后，加入0.5 mL冰醋酸中和過(guò)量的堿，加水至10 mL。同時(shí)用10 mL容量瓶配制不同質(zhì)量濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（倍比稀釋），以吸光度為縱坐標(biāo)，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=1.052 6x＋0.030 3（R2=0.996 9）。取上述樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液各l mL置于試管中，移入冰水浴內(nèi)，分別加入蒽酮試劑4 mL，搖勻，待冷至室溫后，移至沸水浴中，6 min后取出，放入冰水浴中冷卻。在分光光度計(jì)650 nm波長(zhǎng)處用空白管調(diào)零，比色測(cè)定吸光度。將測(cè)得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得小鼠肝糖原含量。

2　結(jié)果與分析

2.1多糖的分離與純化結(jié)果

圖 1 多糖PSEPS2-A經(jīng)Sephadex G-200（A）和Sephadex G-100（B）柱層析色譜圖Fig.1 Sephadex G-200 (A) and Sephadex G-100 (B) column chromatography of PSEPS2-A

長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵液40 L，經(jīng)過(guò)濾、離心、濃縮至5 L后醇沉得長(zhǎng)柄側(cè)耳胞外多糖2（PSEPS2）粗多糖60.71 g，又經(jīng)除蛋白、脫色素、透析、SephadexG-200 和SephadexG-100排阻色譜分離純化得白色絮狀長(zhǎng)柄側(cè)耳胞外多糖PSEPS2-A 5.52 g，得率為0.138 g/L。SephadexG-200和SephadexG-100柱層析色譜洗脫曲線如圖1所示，PSEPS2-A經(jīng)過(guò)SephadexG-200時(shí)峰型并未完全分離開(kāi)，故收集主峰洗脫液濃縮、真空冷凍干燥后繼續(xù)上SephadexG-100，得到峰型單一主峰，表明PSEPS2-A純化完全，濃縮主峰洗脫液，冷凍干燥得純化好的PSEPS2-A。

2.2多糖理化性質(zhì)

PSEPS2-A外觀為白色絮狀，無(wú)味，易溶于水，難溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑；碘-碘化鉀反應(yīng)呈陰性，說(shuō)明所得產(chǎn)品中不含淀粉；茚三酮反應(yīng)呈陰性，說(shuō)明所得產(chǎn)品中不含有蛋白質(zhì)；Molish 反應(yīng)呈陽(yáng)性，說(shuō)明所得產(chǎn)品中含有糖類物質(zhì)。PSEPS2-A的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.51%，未檢出蛋白質(zhì)。由圖2可知，全波長(zhǎng)掃描在260、280 nm波長(zhǎng)處沒(méi)有吸收峰，說(shuō)明不含核酸和蛋白質(zhì)。元素分析結(jié)果顯示C、H、S、N 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為39.37%、6.40%、1.90%、0.00%，經(jīng)計(jì)算得O元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.33%，C、H、O 的物質(zhì)的量比約為1∶2∶1，符合多糖的元素及組成比例，N元素含量為0證明PSEPS2-A不含蛋白質(zhì)。由圖3可知， PSEPS2-A經(jīng)過(guò)HPLC-GPC檢測(cè)，呈單一對(duì)稱峰，根據(jù)峰面積歸一化法計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.7%，說(shuō)明該組分是分子質(zhì)量單一的多糖。

圖2　PSEPS2-A全波長(zhǎng)掃描圖譜Fig.2 Full wavelength scan of PSEPS2-A

圖3　PSEPS2-A的高效液相凝膠色譜圖Fig.3 HPLC-GPC of PSEPS2-A

2.3多糖分子質(zhì)量、分子構(gòu)象及分子質(zhì)量分布分析

采用示差折光檢測(cè)器和激光檢測(cè)器分別記錄供試品質(zhì)量濃度和供試品在不同角度的光散射強(qiáng)度；比折光指數(shù)增量值（dn/dc）為0.138，通過(guò)多角度激光散射儀自帶ASTRAV軟件計(jì)算得到PSEPS2-A的分子質(zhì)量為6.268×105D、分布指數(shù)d＝Mw/Mn＝1.014（Mw為重均分子質(zhì)量，Mn為數(shù)均分子質(zhì)量）。分布指數(shù)接近1.00說(shuō)明PSEPS2-A分布呈單分散性，即表明摩爾質(zhì)量分布范圍較集中，分子大小均一；以旋轉(zhuǎn)均方根半徑對(duì)摩爾質(zhì)量作圖（圖4）得到的斜率為1.03，說(shuō)明PSEPS2-A的構(gòu)象為棒狀。

圖4　多糖PSEPS2-A均方根旋轉(zhuǎn)半徑對(duì)摩爾質(zhì)量圖Fig.4 Root mean square turning radius of PSEPS2-A

圖5　不同堿濃度下剛果紅與多糖混合液的波長(zhǎng)變化Fig.5 Absorption wavelength change of Congored-polysaccharide complex in different concentrations of NaOH solutions

2.4剛果紅反應(yīng)分析

由圖5可知，多糖與剛果紅作用后在低濃度的NaOH溶液中發(fā)生紅移，說(shuō)明PSEPS2-A存在三螺旋結(jié)構(gòu)；在高濃度NaOH溶液中沒(méi)有此現(xiàn)象，說(shuō)明多糖結(jié)構(gòu)由于堿濃度的增加將有序結(jié)構(gòu)破壞至無(wú)序結(jié)構(gòu)，因?yàn)榘魻罱Y(jié)構(gòu)能影響線性分子間氫鍵的穩(wěn)定性。

2.5小鼠基本生活狀況觀察

造模后小鼠多飲、多食、多尿、體質(zhì)量減輕，即“三多一少”癥狀十分明顯，PSEPS2-A 3個(gè)劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)程癥狀逐漸緩解、反應(yīng)靈活、毛發(fā)平伏有光澤。實(shí)驗(yàn)中，有個(gè)別組中有老鼠意外死亡的情況，可能原因是個(gè)體差異和人為操作因素。

2.6PSEPS2-A對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖值的影響

由表1可知，實(shí)驗(yàn)期間，造模后小鼠空腹血糖值顯著升高，與空白對(duì)照組比較差異極顯著（P＜0.01），顯示造模成功。開(kāi)始給藥后，PSEPS2-A高、中、低劑量組小鼠血糖值逐漸降低，在給藥15 d后明顯低于給藥前水平（P＜0.01）；在給藥15 d后，PSEPS2-A高、中、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組與糖尿病模型組比較差異極顯著（P＜0.01）；在給藥15 d后，PSEPS2-A高、中、低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異不顯著。表明PSEPS2-A具有明顯控制糖尿病小鼠空腹血糖值升高、降低其血糖值的作用，且有與消渴丸相當(dāng)?shù)淖饔?，并存在一定的劑量依賴關(guān)系。

表1　多糖PSEPS2-A對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖值的影響（±s）Table 1 Effect of PSEPS2-A on blood glucose in alloxan-induced diabetic miccee (±s)

表1　多糖PSEPS2-A對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖值的影響（±s）Table 1 Effect of PSEPS2-A on blood glucose in alloxan-induced diabetic miccee (±s)

注：—. 不給藥；*. 與空白對(duì)照組比較差異極顯著（P＜0.01）；**. 與糖尿病模型組比較差異極顯著（P＜0.01）；▲.與給藥前比較差異顯著（P＜0.05）；▲▲.與給藥前比較差異極顯著（P＜0.01）。

組別　劑量/動(dòng)物　血糖值/（mmol/L）（g/kg）　只數(shù)　給藥前　給藥5 d　給藥10 d　給藥15 d空白對(duì)照組　—　12　4.74±0.89　3.97±0.78　4.44±0.84　4.95±0.95糖尿病模型組　—　12　18.08±3.79* 18.87±2.99* 17.07±5.96*　17.85±4.22* PSEPS2-A低劑量組　0.086 4　12　17.66±3.08* 12.89±2.87　9.71±3.13　8.69±1.67**▲PSEPS2-A中劑量組　0.172 8　10　18.13±2.15* 12.20±2.11　8.72±3.00　7.63±1.89**▲PSEPS2-A高劑量組　0.259 2　11　17.74±1.72*　10.1±1.84　8.15±1.97　7.11±1.61**▲▲陽(yáng)性對(duì)照組　1.000 0　11　17.25±2.67* 13.97±3.59 10.22±2.679 8.85±3.59**▲

2.

表2　多糖PSEPS2-A對(duì)糖尿病小鼠糖耐量的影響（±s）Table 2 Effect of PSEPS2-A on glucose tolerance in alloxan-induced diabetic mice±s)

表2　多糖PSEPS2-A對(duì)糖尿病小鼠糖耐量的影響（±s）Table 2 Effect of PSEPS2-A on glucose tolerance in alloxan-induced diabetic mice±s)

注：*. 與空白對(duì)照組比較差異極顯著（P＜0.01）；**. 與糖尿病模型組比較差異極顯著（P＜0.01）；▲.與陽(yáng)性對(duì)照組比較差不異顯著（P＞0.05）。

組別　劑量/血糖值/（mmol/L）　曲線下面積/（g/kg）0 h　0.5 h　2 h（mmol/L）空白對(duì)照組　—　4.95±0.95　12.37±1.26　5.12±0.92　17.45±2.28糖尿病模型組　—　17.85±1.22　28.63±2.23　19.14±2.06　47.45±4.06* PSEPS2-A低劑量組　0.086 4　8.69±1.67　16.24±1.86　8.41±2.01　24.72±1.87**▲PSEPS2-A中劑量組　0.172 8　7.63±1.89　14.52±2.07　7.67±1.94　22.18±1.98**▲PSEPS2-A高劑量組　0.259 2　7.11±1.61**　13.69±1.55**　7.02±1.45** 20.73±2.04**▲陽(yáng)性對(duì)照組　1.000 0　8.85±3.59　16.13±1.28　7.56±1.17　23.76±3.25

由表2可知，糖尿病模型組小鼠血糖曲線下面積與空白對(duì)照組比較極顯著升高（P＜0.01），PSEPS2-A 各劑量組血糖曲線下面積的降低與糖尿病模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且有明顯的量效關(guān)系，與陽(yáng)性對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。表明PSEPS2-A具有明顯降低糖尿病小鼠血糖曲線下面積的作用，且有與消渴丸相當(dāng)?shù)淖饔?，并存在一定的劑量依賴關(guān)系。

2.8PSEPS2-A對(duì)糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響

由圖6可知，小鼠在造模后體質(zhì)量與空白對(duì)照組相比均顯著降低（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)期間，PSEPS2-A 3個(gè)劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠體質(zhì)量與糖尿病模型組相比均顯著回升（P＜0.05）。PSEPS2-A 3個(gè)劑量組中，隨著劑量的增加，小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯，各劑量組在給藥后10 d起均高于造模前水平，并以PSEPS2-A高劑量組體質(zhì)量增長(zhǎng)最明顯。表明PSEPS2-A具有一定促進(jìn)糖尿病小鼠體質(zhì)量恢復(fù)的作用，并存在一定的劑量依賴關(guān)系。

圖6　多糖PSEPS2-A對(duì)糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響Fig.6 Effect of PSEPS2-A on body weight in alloxan-induced diabetic mice

2.9PSEPS2-A對(duì)糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響

圖7　多糖PSEPS2-A對(duì)糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響Fig.7 Effect of PSEPS2-A on organ indexes in alloxan-induced diabetic mice

由圖7可知，糖尿病模型組小鼠肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)與空白對(duì)照組比較均顯著升高，PSEPS2-A高劑量組與糖尿病模型組對(duì)比差異顯著（P＜0.05），與空白對(duì)照組對(duì)比則無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。各組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均無(wú)顯著性差異。表明糖尿病小鼠肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)均升高，而PSEPS2-A 具有降低臟器指數(shù)恢復(fù)到正常水平趨勢(shì)的作用，但對(duì)小鼠免疫器官的作用不是很明顯。

2.10PSEPS2-A對(duì)糖尿病小鼠肝糖原水平的影響

由圖8可知，糖尿病模型組小鼠肝糖原含量明顯低于空白對(duì)照組（P＜0.05）；PSEPS2-A 3個(gè)劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肝糖原水平均顯著高于糖尿病模型組（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，PSEPS2-A中、低劑量組小鼠肝糖原水平略高于陽(yáng)性對(duì)照組，高劑量組差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明PSEPS2-A促進(jìn)糖尿病小鼠肝糖原合成作用優(yōu)于消渴丸，且存在劑量依賴關(guān)系。

圖8　多糖PSEPS2-A對(duì)糖尿病小鼠肝糖原水平的影響Fig.8 Effect of PSEPS2-A on hepatic glycogen level in alloxan-induced diabetic mice

3　結(jié) 論

長(zhǎng)柄側(cè)耳等側(cè)耳屬真菌含有多種氨基酸、維生素、礦物元素等，具有較好的食用和藥用價(jià)值，是一種極具開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用前景的食藥用菌，但目前對(duì)于長(zhǎng)柄側(cè)耳胞外多糖的分離純化以及生物學(xué)活性的研究較少，本實(shí)驗(yàn)利用從長(zhǎng)柄側(cè)耳液體發(fā)酵培養(yǎng)基中制備的胞外粗多糖，經(jīng)過(guò)除蛋白、脫色素和Sepadex凝膠柱色譜等一系列分離純化得到一種均一化多糖PSEPS2-A。

糖尿病性高血糖癥主要體現(xiàn)在葡萄糖在血液中的濃度過(guò)高帶來(lái)的血糖升高[28]。一些證據(jù)表明，胰島β細(xì)胞的主要功能是參與胰島素的產(chǎn)生和釋放，β細(xì)胞通過(guò)內(nèi)源性胰島素的調(diào)節(jié)，降低血糖濃度，從而抑制糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥[29]。四氧嘧啶是一種β細(xì)胞毒劑，可選擇性地?fù)p傷多種動(dòng)物的胰島β細(xì)胞，造成胰島素分泌的下降，引起實(shí)驗(yàn)性糖尿病[30]。本研究以四氧嘧啶制備糖尿病小鼠模型，以消渴丸作為陽(yáng)性藥參照，研究長(zhǎng)柄側(cè)耳胞外多糖PSEPS2-A對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠血糖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PSEPS2-A對(duì)四氧嘧啶所致胰島素依賴型糖尿病小鼠血糖升高有顯著的抑制作用，糖耐量實(shí)驗(yàn)表明PSEPS2-A能顯著提高糖尿病小鼠葡萄糖耐受能力，能較快地抑制餐后血糖的上升，這可能是由于PSEPS2-A可以減弱四氧嘧啶對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷、增加胰島素的分泌，從而發(fā)揮降糖及改善糖耐量作用所致；給藥組小鼠體質(zhì)量回升明顯，肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)均有一定程度的降低，說(shuō)明PSEPS2-A可能對(duì)糖尿病導(dǎo)致的肝臟、腎臟腫大有較好的恢復(fù)能力；給藥組的肝糖原水平有明顯增高，表明PSEPS2-A能促進(jìn)血糖進(jìn)入肝臟，使肝糖原合成增加；以上各項(xiàng)指標(biāo)存在一定的劑量依賴關(guān)系，而且PSEPS2-A的治療療效都要稍好于消渴丸的治療療效。

綜上分析，從長(zhǎng)柄側(cè)耳液體發(fā)酵液中分離純化出來(lái)的長(zhǎng)柄側(cè)耳胞外多糖PSEPS2-A具有調(diào)節(jié)糖代謝、降低血糖、改善糖尿病癥狀的作用，且作用機(jī)制是多方面綜合影響的，有繼續(xù)深入研究的價(jià)值。

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Purification and Hypoglycemic Effect of Extracellular Polysaccharide from Pleurtus spodotecus Fr.

LI Can1,2, HU Fang1, ZHU Ruijuan1, CHEN Tongqiang2, DENG Xibei3, WANG Shumin3, FENG Shilan3,*
(1. School of Pharmacy, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China; 2. Hunan Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research, Changsha 410111, China; 3. School of Pharmaceutical Sciences, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

Abstract:This study was conceived to investigate the isolation, purification and hypoglycemic effect of extracellular polysaccharides from Pleurtus spodotecus Fr. in diabetic mice. A homogeneous extracellular polysaccharide named as PSEPS2-A was extracted from the fermented broth of Pleurtus spodotecus Fr.. Then PSEPS2-A was treated with Sevag method, H2O2and purified with Sephadex gel filtration chromatography. GPC-MALLS and other methods were utilized to examine the physical and chemical properties of PSEPS2-A. The absolute molecular weight of PSEPS2-A was 6.268 × 105D and the structure was rod-like in 0.9% NaCl solution. Diabetic mice induced by Alloxan were subjected to continuous intragastric administration with different doses of PSEPS2-A. The changes in body weight, fasting blood glucose (FBG), glucose tolerance, organ index, and liver glycogen in diabetic mice were determined before and after the treatment. PSEPS2-A could significantly reduce the content of FBG (P < 0.05) and the area under curve of blood glucose (P < 0.05). The symptom of negative growth of body weights was slowed down and the organ index was decreased in diabetic mice. PSEPS2-A also could significantly promote liver glycogen synthesis and elevate the level of liver glycogen. PSEPS2-A is a new extracellular polysaccharide from Pleurtus spodotecus Fr., which plays an important role in regulating glucose metabolism, lowering blood sugar, and improving diabetic symptoms at a certain concentration.

Key words:Pleurtus spodotecus Fr.; extracellular polysaccharides; isolation and purification; diabetes; hypoglycemic

*通信作者：封士蘭（1957—），女，教授，博士，主要從事中藥小分子及大分子（多糖）化合物提取分離、結(jié)構(gòu)研究；中藥止咳、祛痰、降血鉛、降血糖等藥效研究。E-mail：fengshl@lzu.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：李燦（1989—），男，碩士研究生，主要從事中藥小分子及大分子（多糖）化合物提取分離、結(jié)構(gòu)研究。

基金項(xiàng)目：“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAI05B02）；吉林省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（201205050）

收稿日期：2014-06-11

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507034

中圖分類號(hào)：TS201.3；Q946.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2015）07-0183-06