魚類白介素（IL- 1β）及干擾素（IFN）重組質(zhì)粒構(gòu)建及聯(lián)合應(yīng)用研究

閆春梅　鄭　偉*杜曉燕　肖志國　李忠強熊占山　劉長有　李秀穎　劉慧吉（吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院　吉林　長春　130033）

魚類白介素（IL- 1β）及干擾素（IFN）重組質(zhì)粒構(gòu)建及聯(lián)合應(yīng)用研究

閆春梅鄭偉*杜曉燕肖志國李忠強熊占山劉長有李秀穎劉慧吉
（吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院吉林長春130033）

摘要：為增強魚類自身防病抗病能力，本研究人工合成了細胞因子白介素（IL-1β）及干擾素（IFN）基因序列，分別與pIRES2-EGFP真核表達載體連接，構(gòu)建熒光表達質(zhì)粒。兩種質(zhì)粒分別接種Hela細胞，倒置于熒光顯微鏡下觀察，確定質(zhì)粒在細胞內(nèi)的表達情況。之后將兩種質(zhì)粒注射免疫魚體，于免疫后第2周抽樣采集腹水、肌肉組織及血清，通過熒光、RT-PCR及SDS-PAGE方法檢測目的蛋白表達情況。最后將兩種質(zhì)粒聯(lián)合免疫待產(chǎn)虹鱒親魚，同時在人工授精過程中進行二次免疫，抽樣采集孵化出的虹鱒魚苗，檢測目的蛋白表達情況。結(jié)果表明，兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞均可見熒光反應(yīng)，空白對照無熒光，表明兩種質(zhì)粒在細胞內(nèi)成功表達；室內(nèi)動物試驗結(jié)果表明只有兩試驗組腹水中檢測到熒光信號，RT-PCR結(jié)果可見兩試驗組每組10尾均可檢測到目的片段，空白組未檢測到目的片段。SDS-PAGE顯示，兩試驗組在40KD處可見目的條帶；中試試驗幼魚可檢測到熒光蛋白表達；試驗組繁殖成活率97%，空白對照組繁殖成活率56%。以上結(jié)果證明人工合成IL-1β、IFN熒光質(zhì)粒免疫魚體，顯著提高了魚體自身免疫力，可有效的增強魚體自身防病抗病能力。

關(guān)鍵詞：白介素（IL-1β）；干擾素（IFN）；蛋白表達；核酸免疫；聯(lián)合應(yīng)用

資助項目：吉林省科技發(fā)展計劃項目（20130102059JC）

作者：閆春梅（1981-），女，漢，吉林省長春市，工程師，碩士，水產(chǎn)養(yǎng)殖及預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)，Email：Yanchunmei199950@126.com

Construction of interleukin（IL-1 beta）and interferon（IFN）recombinant plasmid and joint application in fish

Yan chunmei Zheng wei* Du xiaoyan Xiao zhiguo Li zhongqiang Xiong zhanshan Liu changyou Li xiuying Liu huiji
（Jilin Fisheries Research Institute，Changchun，130033）

[Abstract] To enhance prevention disease resistance of the fish, we synthetic cytokine interleukin（IL-1 beta）and interferon（IFN）gene sequence, respectively build fluorescence plasmids connected with PIRES2 EGFP - eukaryotic expression vector. the plasmids transfection Hela, fall under the fluorescent microscope fluorescence reaction, then intramuscular immunization fish. Within 2 weeks after the immune, collecting each group ascites samples, Muscle tissue and serum, Through the fluorescence, RT-PCR and SDS-PAGE testing purpose protein expression. then the plasmids intramuscular immunization trout broodstock obtained expectantstill in the process of artificial insemination for secondary immune. Trout fry sample collection, applying fluorescence microscope testing purpose protein expression. The results showed that both plasmids Transfection Hela visible fluorescence reaction, ck without fluorescence; Laboratory animal test results show that there are only two fluorescent signal detected in the experimental group ascites, RT-PCR result shows two patients in each group of 10 tail pieces can be detected purpose, blank group without a purpose. Sds-page shows that two group at 40 kd visible banding. After the second immunization larvae can be detected by fluorescent protein expression. Experimental group survival rate 97%. Blank control group reproductive survival rate 56%. These results prove that synthetic IL-1β、IFN fluorescent plasmids immune fish, Significantly improves the fish itself immunity, Can effectively enhance prevention disease resistance of the fish.

[key word] IL-1β;IFN; protein expression；Nucleic acid immunization；Combined application

目前魚類病毒性疾病是無藥可治的世界性難題，尤其冷水性魚類病毒病可造成魚苗死亡率高達99%，加上細菌性和寄生蟲性疾病的聯(lián)合侵襲，給魚類養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。本項目從提高魚體自身免疫力入手，針對魚類免疫系統(tǒng)中特異性免疫機制不完善，非特異性免疫占重要地位的特點，同時利用IL-1β、IFN等細胞因子會影響粘液細胞分泌物，吸引中性粒細胞和巨噬細胞參與炎癥反應(yīng)這些特性，分別構(gòu)建pIRES2-EGFP-IL、pIRES2-EGFP-IFN熒光質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3進行克隆表達。大量提取兩種質(zhì)粒聯(lián)合注射免疫魚體，充分發(fā)揮魚類免疫因子IL-1β和IFN的活性，為開創(chuàng)魚類傳染性流行病防治新技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實驗材料

試驗用魚：試驗鯉魚購自吉林省土著魚類良種場。虹鱒魚中試試驗應(yīng)用于和龍青龍漁場。

基因片段合成：NCBI下載鯉魚細胞因子IL-1β及IFN基因序列，根據(jù)物種（虹鱒）進行優(yōu)化處理，委托上海生物工程有限公司合成，IL-1β基因全長840bp，IFN基因全長573bp，序列5’端和3’端分別添加BgⅢ和EcoR I酶切位點。

載體：pIRES2-EGFP購自invitrogen公司。

細胞：Hela細胞由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所提供。

主要試劑：限制性內(nèi)切酶BgⅢ和EcoR I，T4 DNA連接酶，Ex Taq DNA Polymerase，購自TaKaRa公司。Trizol Reagent購自上海生物工程有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒，購自Axygen公司。SDS-PAGE試劑購自北京鼎國生物科技有限公司。

1.2基因合成、克隆與鑒定

將人工合成的白介素（IL-1β）及干擾素（IFN）基因分別進行BgⅢ和EcoR I雙酶切后與同樣酶切的pIRES2-EGFP載體連接，分別構(gòu)建pIRES2-EGFP- IL、pIRES2-EGFP- IFN熒光質(zhì)粒，分別命名為A3777-1和A3777-2。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DE3菌，涂布于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)過夜，篩選陽性克隆，從每個培養(yǎng)皿上各挑取6個單菌落接種于4ml含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃恒溫搖床培養(yǎng)過夜，用試劑盒小量提取質(zhì)粒。

用BgⅢ和EcoR I雙酶切所得質(zhì)粒進行鑒定。同時對所得質(zhì)粒進行測序鑒定。

1.3核酸疫苗的制備及免疫

1.3.1核酸疫苗制備

對鑒定結(jié)果準確的質(zhì)粒進行大量提取，作為免疫用核酸疫苗。

1.3.2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞

在細胞培養(yǎng)板中接種傳代Hela細胞1×105～3×105個/ml，當細胞單層鋪滿孔底60%時，棄營養(yǎng)液，PBS洗滌備用。將DOTAP Liposomal加入500μl MEM中輕輕混勻，另取500μl MEM加入10μg重組質(zhì)粒DNA混勻（同時設(shè)立空載體DNA作為空白對照），將后者緩慢滴加于前者中輕輕混勻，室溫作用30min，加入細胞板內(nèi)，置于CO2培養(yǎng)箱37℃作用8～10h，補加含2% FCS的MEM，繼續(xù)培養(yǎng)48～72h。棄上清，倒置于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3免疫

于試驗前兩周，選取規(guī)格在20厘米左右，健康無病的同一批次鯉魚于控溫在19-22℃的水族箱中充氧飼喂。試驗組共30尾，分為兩組，15尾/組，分別腹腔注射A3777-1和A3777-2各50μg，同時腹腔注射空載體10尾為空白對照組。

免疫后第2周抽樣收集試驗組和對照組腹水及肌肉組織和血清樣本。腹水樣品在熒光顯微鏡下觀察，確定質(zhì)粒在魚體內(nèi)表達情況。兩試驗組每組采集10尾肌肉組織，對照組采集2尾肌肉組織樣品，應(yīng)用RT-PCR法檢測質(zhì)粒在組織中的表達情況。收集的血液樣本，分離血清，應(yīng)用SDS-PAGE法檢測血清中抗體產(chǎn)生情況。

1.3.4中試試驗

將所提取質(zhì)粒肌肉注射免疫待產(chǎn)虹鱒親魚，注射劑量仍為每種質(zhì)粒50μg。在人工授精過程中，在5kg魚卵中混入同樣的兩種質(zhì)粒各500μg進行二次免疫，待受精卵破膜后，抽樣采集虹鱒幼魚，應(yīng)用熒光顯微鏡檢測目的蛋白表達情況。并計算繁殖成活率。

2　結(jié)果

2.1基因合成、克隆與鑒定

人工合成的IL-1β及IFN基因BgⅢ和EcoR I雙酶切產(chǎn)物與pIRES2-EGFP載體連接，構(gòu)建A3777-1和A3777-2兩株質(zhì)粒。用BgⅢ和EcoRI雙酶切所得質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。結(jié)果顯示，A3777-1在840bp和5300bp處同時出現(xiàn)條帶；A3777-2在573bp和5300bp處同時出現(xiàn)條帶（見圖1）。同時對所得質(zhì)粒委托上海生物工程公司進行測序鑒定。鑒定結(jié)果顯示，所得質(zhì)粒正確。

2.2核酸疫苗的構(gòu)建

大量提取所得質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定（見圖2），紫外分光光度計定量顯示所得質(zhì)粒約為A3777-1 124 ng/μl；A3777-2 83 ng/μl。

Fig.2 A large number of extraction of plasmid gel electrophoresis（M：marker；1：A3777-1；2：A3777-2）

2.3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞

DOTAP Liposomal與質(zhì)粒DNA混合物加入在細胞培養(yǎng)板中接種傳代的Hela細胞后，置于CO2培養(yǎng)箱37℃作用8～10h，補加含2%FCS的MEM，繼續(xù)培養(yǎng)48～72h。棄上清，倒置于熒光顯微鏡下，可見A3777-1和A3777-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞均可見熒光反應(yīng)，空白對照無熒光顯示，如圖3所示。

圖3.質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染Hela細胞圖片（A：A3777-1；B：A3777-2；C：空白對照）Fig.3 Fluorescent photos of Hela cells transfected by plasmids DNA（A：A3777-1；B：A3777-2；C：control）

2.4免疫熒光檢測

免疫后第2周收集兩試驗組和對照組腹水，在熒光顯微鏡下觀察，可見兩試驗組均有熒光可見，對照組無熒光（見圖4）。肌肉組織樣品RT-PCR結(jié)果顯示，兩試驗組采集的各10尾肌肉組織樣品中，A3777-1組的10尾樣品在840bp處均有目的條帶出現(xiàn)，A3777-2組的10尾樣品在573bp處亦均有目的條帶出現(xiàn)，對照組2個樣品無目的帶（見圖5）。血清樣品SDS-PAGE結(jié)果顯示，兩試驗組在40KD處均有目的條帶產(chǎn)生，對照組無目的條帶（見圖6）。通過以上3組試驗結(jié)果證實，本研究制備的兩組質(zhì)粒疫苗在魚體內(nèi)均獲得了良好的表達。

2.5中試試驗

所提取質(zhì)粒肌肉注射免疫待產(chǎn)虹鱒親魚。人工授精過程中進行二次免疫。抽樣采集虹鱒幼魚，應(yīng)用熒光顯微鏡檢測目的蛋白表達情況，試驗魚可見明顯的熒光反應(yīng)，對照組無熒光顯示（見圖5）。試驗組卵粒共5.5kg，約合5.28萬粒，共繁殖虹鱒魚苗4.85萬尾，成活率97%。空白對照組卵粒共25.5kg，約合24.48萬粒，共繁殖虹鱒魚苗13.44萬尾，繁殖成活率56%?？梢娫囼灲M繁殖成活率顯著提高。

3　討論

核酸疫苗的免疫效果與目的基因序列、載體、佐劑、免疫途徑等多種因素有關(guān)。在目的基因選擇過程中，考慮到魚類的生活環(huán)境造成其易受各種致炎因子刺激發(fā)生炎癥乃至死亡，因此既要增強魚體抗菌能力，又要增強魚體抗病毒能力，最終選擇白細胞介素（IL）和干擾素（IFN）。其中白介素在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細胞，介導(dǎo)T、B細胞活化、增殖與分化及在炎癥反應(yīng)中起重要作用。由活化的巨噬細胞所產(chǎn)生，能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細胞增殖、分化并提高其功能。當魚類受細菌感染引起炎癥反應(yīng)時，機體最早分泌的抗炎癥細胞因子中包含有IL-1β。有研究認為IL-1β在魚類皮膚免疫中具有重要作用。其重組蛋白亦可引發(fā)機體免疫應(yīng)答反應(yīng)，如虹鱒（oncorhynchus mykiss）IL-1β重組體經(jīng)腹腔注射可有效抵御殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）感染。Sigh等證實了虹鱒感染多子小瓜蟲過程中有促炎細胞因子IL-1β受體的表達，感染4天后，與未感染的對照組相比，感染魚的皮膚中IL-1β的表達增加了17.8倍。因此，本研究選擇IL-1β作為目的基因之一。在選擇能夠增強魚體抗病毒能力基因過程中，查詢相關(guān)資料，研究人員選擇干擾素作為本研究的第二個目的基因。干擾素主要由病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生，能夠誘導(dǎo)動物進入抗病毒狀態(tài)。干擾素不能直接滅活病毒，而是通過誘導(dǎo)細胞合成抗病毒蛋白（AVP）發(fā)揮效應(yīng)，是機體防御反應(yīng)中出現(xiàn)最早的防御系統(tǒng)。本研究直接將干擾素基因作為核酸疫苗免疫魚體，直接激活細胞基因表達多種抗病毒蛋白，實現(xiàn)對病毒的抑制作用。魚類干擾素研究起步晚，但進展迅速。迄今為止，已陸續(xù)從虹鱒、牙鲆、草魚、黑鯽等多種魚類中發(fā)現(xiàn)了IFN。另有研究發(fā)現(xiàn)草魚IFN主要由頭腎等免疫組織中的淋巴細胞產(chǎn)生,除了抗病毒活性外，還具有促進巨噬細胞吞噬殺菌、調(diào)節(jié)淋巴細胞轉(zhuǎn)化等功能。在魚類IFN基因克隆方面，由于魚類IFN基因和已知的哺乳類、鳥類等IFN基因同源性較低，所以設(shè)計有效的引物用PCR或者探針篩選文庫等方法獲得該基因比較困難，因此本研究選擇人工合成方法來完成干擾素基因的合成，并進行物種優(yōu)化后作為目的基因。

本研究首先將構(gòu)建的兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞，驗證兩種質(zhì)粒在細胞內(nèi)的表達情況。進一步將兩種質(zhì)粒分別注射到鯉魚體內(nèi)，通過鯉魚腹水中熒光信號的有無及肌肉組織RT-PCR檢測結(jié)果和SDS-PAGE血清驗證結(jié)果，三者共同來驗證所構(gòu)建質(zhì)粒在魚體內(nèi)的表達情況，結(jié)果顯示，免疫試驗魚腹水內(nèi)明顯可見熒光信號，而對照魚腹水無熒光信號。兩試驗組各取10尾肌肉組織RT-PCR均可見目的片段，空白對照組肌肉無目的帶；血清凝膠電泳也證實兩試驗組在40KD處可見目的條帶，空白組無此條帶。通過以上諸多結(jié)果證實了所構(gòu)建的質(zhì)粒在魚體內(nèi)可以獲得表達。將兩種質(zhì)?；旌献⑸涿庖吆琪V待產(chǎn)親魚，并在人工授精過程中進行二次免疫。待幼魚孵化出后進行熒光檢測，檢測結(jié)果最終證明所構(gòu)建的質(zhì)粒在虹鱒體內(nèi)表達情況良好，同過試驗組和對照組繁殖成活率對照進一步證實，試驗組成活率達到97%，對照組僅為56%，足足提高了41%。上述幾項實驗結(jié)果可以證明，本研究所構(gòu)建的質(zhì)粒無論在人工培養(yǎng)的細胞還是魚體內(nèi)均能活動較理想的表達，可以明顯的提高機體的自身免疫力。

虹鱒是全球養(yǎng)殖普遍的鮭鱒魚類，但其病毒病也是世界難題，染病虹鱒苗種死亡率常達99%。常規(guī)手段是捕殺、隔離、徹底消毒，損失慘重。物理和化藥防治受條件和藥殘危害的限制，抗原疫苗研制和應(yīng)用剛剛起步，技術(shù)不成熟，有返毒危險。本研究屬于無毒無殘留的生物防治技術(shù)，通過提高魚體的自身免疫力對抗病毒和細菌，不僅可以避免上述危害，還將保護該產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

參考文獻（略）

通訊作者：鄭偉（1965-，）女，博士，研究員，水產(chǎn)養(yǎng)殖及預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)，Email:zw0721@sohu.com

中圖分類號S-942.1