高密度組織芯片簡易制作方法及體會

2015-03-17 02:13:22趙靜,徐明堂,趙煥芬等

河北醫(yī)科大學學報 2015年9期

·論著·

高密度組織芯片簡易制作方法及體會

趙靜1，徐明堂2，趙煥芬2，宋光耀3*

(1.河北省人民醫(yī)院腫瘤一科，河北石家莊 050051；2.河北省人民醫(yī)院病理科，河北石家莊 050051；3.河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北石家莊 050051)

[摘要]目的介紹高密度組織芯片的簡易制作技術(shù)。方法使用內(nèi)徑1.8 mm的自制套針，手工制成組織芯蠟塊及組織芯片，并進行 HE染色、免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)及熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技術(shù)檢測。結(jié)果制備組織芯片蠟塊2個，為9×12點陣的乳腺癌組織芯蠟塊， 9×10點陣的結(jié)腸癌及胃癌混合組織芯蠟塊。蠟塊內(nèi)無空泡及裂痕，組織芯陣列整齊，無組織芯移位或倒浮。切片數(shù)十張，經(jīng)HE染色后觀察，芯片上微陣列整齊分界清楚，無微組織片皺褶及脫片現(xiàn)象。經(jīng)IHC及FISH技術(shù)檢測，與常規(guī)病理切片檢測進行對照觀察，結(jié)果準確一致。結(jié)論組織芯片技術(shù)具有大樣本、高通量、高效率、低消耗、易于標準化等諸多優(yōu)點，本研究所述制備技術(shù)簡單易掌控，有利于組織芯片技術(shù)在臨床和科研中普及并推廣。

[關(guān)鍵詞]乳腺腫瘤；胃腫瘤；組織芯片；診斷技術(shù)和方法doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.09.030

[收稿日期]2014-06-04；[修回日期]2014-07-28

[作者簡介]趙靜(1981-)，女，河北石家莊人，河北省人民醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學博士研究生，從事腫瘤的靶向治療。

通訊作者*。E-mail: sguangyao2@163.com

[中圖分類號]R737.9；R735.2[文獻標志碼]B

隨著腫瘤生物學的迅猛發(fā)展，大量基因及蛋白逐漸被發(fā)現(xiàn)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。為了評價新檢測到的潛在癌基因和靶蛋白的臨床意義，通常需要檢測大量的腫瘤樣本。用傳統(tǒng)的分子病理學方法制作樣本，耗時耗力，而且消耗試劑及寶貴的組織資源，亟需高通量技術(shù)方法解決。組織芯片也稱組織微陣列(tissue microarray,TMA)，是將數(shù)十個甚至上千個組織標本規(guī)則有序地排布于一張載玻片上，進行同一指標檢測的原位組織學研究技術(shù)[1]。組織芯片具有小體積、大樣本、高通量、高效率、低消耗等諸多優(yōu)勢，可以同時對大量組織樣本進行研究分析，簡便經(jīng)濟。在疾病的分子診斷、預測預后指標的篩查、診斷治療靶點的驗證和定位等領(lǐng)域發(fā)揮了愈來愈重要的作用，該技術(shù)有利于將新發(fā)現(xiàn)的分子標記或靶點快速轉(zhuǎn)化為臨床應用，將成為轉(zhuǎn)化性研究的重要方法及橋梁[2-3]。但是，由于組織芯片的制作設備昂貴，基層醫(yī)院甚至很多大型醫(yī)院都無法順利開展此項技術(shù)。我們經(jīng)過長期的實踐改良，逐漸掌握了一套較高水平并且經(jīng)濟實用的高密度組織芯片制作技術(shù)，現(xiàn)以乳腺癌及胃癌和結(jié)腸癌的組織芯片制作為例，將方法及體會介紹如下。

1材料與方法

1.1標本來源選擇2009年4月—2013年12月河北省人民醫(yī)院乳腺癌手術(shù)切除的病理標本65例，癌旁正常乳腺組織37例。2010年1月—2013年12月胃癌手術(shù)切除的病理標本28例，癌旁正常胃組織12例；結(jié)腸癌手術(shù)切除的病理標本32例，癌旁正常結(jié)腸組織12例。所有標本均經(jīng)常規(guī)石蠟包埋切片以及組織病理學檢查證實。石蠟采用國產(chǎn)的熔點為52～56 ℃醫(yī)用石蠟。

1.2儀器設備組織包埋儀(Thermo Shandon Histocentre 3)，輪轉(zhuǎn)切片機(德國徠卡儀器公司 RM2245)，一次性石蠟切片刀(德國萊卡公司)，防脫載玻片，組織芯穿刺針(由腎穿針改制，直徑1.8 mm)，包埋模，膠水(膠水與蒸餾水1∶1混合)，小刀，鑷子。

1.3方法

1.3.1組織芯蠟模制備應用組織包埋儀向不銹鋼包埋模中直接注入蠟液至與模周水平，冷卻至蠟凝固。根據(jù)組織樣本量的大小，用小刀在蠟模上挖取所需大小的組織芯槽，槽深到包埋模底。本研究制作了15 mm×15 mm及15 mm×20 mm 2個芯槽。注意槽邊緣要比蠟模邊緣小3～5 mm，槽四壁要光滑并垂直于模底，以防組織芯附著不穩(wěn)。制作工具見圖1。

1.3.2組織芯選取及蠟塊制備 ①定位：首先選取所研究病例的HE染色切片及其對應的蠟塊，由經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師進行切片篩選，在顯微鏡下找到病變區(qū)，用記號筆作標記，注意標記范圍盡量小，直徑小于3 mm，并選取富含腫瘤細胞的區(qū)域，盡量避免因標記區(qū)域過大而取不到理想的病變組織。在燈光透照下反復比對切片標記點對應的石蠟包埋塊上的相應位置，并同樣在蠟塊上做好標記。注意盡量選取蠟塊中病變組織較厚的地方標記取材，以提高制備的組織芯蠟塊的利用率。②取芯：用自制的穿刺針垂直插入標記點處的組織，輕輕旋轉(zhuǎn)穿刺針取出組織芯。③固定：用鑷子小心地夾取組織芯柱，使有病變組織的一端向下沾取少許膠水，緊貼芯槽壁粘貼到槽底。其他組織芯柱依次與前一個組織芯緊密相貼，組織芯排與排之間也是直接粘貼，直至制作完畢。注意動作輕柔并使芯柱之間緊密相連以免芯柱傾倒，因組織芯長短不一，在放置組織芯時輕壓芯柱，使其在槽底處于同一切面水平。室溫過夜或42 ℃放置數(shù)小時，使黏附組織芯的膠水干燥。④包埋：應用組織包埋儀向包埋模的芯槽中直接注入蠟液填滿未布組織芯的區(qū)域，并立即把包埋模置于包埋儀的熱臺上(65 ℃)，直到蠟模與組織芯柱自身的石蠟全部熔解,組織芯陣列中的微組織塊在蠟液中全部觸底并清晰地呈現(xiàn)。小心平穩(wěn)地將芯柱溶解狀態(tài)的包埋模移至冷臺，底層蠟液迅速凝固，組織芯列陣也隨之固定，隨后經(jīng)包埋儀加注新的蠟液，并放上塑料包埋盒，繼續(xù)放置冷臺冷卻，待石蠟完全凝固后從包埋模中取出，既得組織芯陣列石蠟包埋塊。

1.3.3組織芯片的制作切片前將組織芯蠟塊放到冷臺上充分冷卻，切片時，修平切面，待組織芯充分暴露后，連續(xù)切厚4 μm切片，直到出現(xiàn)不滿意的切片。展片時，用二次展片法。初展直接用室溫水展片，再展片用溫水,但水溫要比常規(guī)展片溫度低，48～50 ℃較適宜，展片溫度過高不易控制展片時間，組織芯片上的微組織易發(fā)生離散，溫度過低則難以保證其充分展開。載玻片用3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷處理的防脫片，裱片后用吸水紙小心地吸凈組織芯蠟片與載玻片之間的水分，否則烤片時陣列中微組織易發(fā)生移位。隨后65 ℃烤片4～6 h，以保證組織牢固地黏附于載玻片上，取出切片自然降至室溫。芯片制作完成后如長期不用可封蠟后保存于4 ℃冰箱中。

2結(jié)果

2.1組織芯蠟塊按上述方法制備組織芯片蠟塊2個，一個為9×12點陣的乳腺癌組織芯蠟塊，另一個為9×10點陣的結(jié)腸癌及胃癌混合組織芯蠟塊。蠟塊內(nèi)無空泡，無裂痕，組織芯陣列整齊，無變形；無組織芯移位、錯位或倒浮現(xiàn)象；包埋塊中組織芯切面基本在一個平面上，沒有明顯凹凸不平現(xiàn)象。

2.2組織芯片一個組織芯片蠟塊大約可切出滿意切片(厚4 μm左右)50～100張。切片大體和鏡下觀察，組織芯片上微陣列整齊、彼此分界清楚，無微組織片皺褶及脫片現(xiàn)象。組織芯片經(jīng)HE染色、免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)及熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)檢測后，經(jīng)病理診斷醫(yī)師閱片，并與相對應的常規(guī)病理切片染色片進行對照觀察，病理診斷準確一致(圖2)。

3討論

組織芯片技術(shù)是生物芯片技術(shù)的一個重要分支。組織芯片將眾多樣本放在同一載玻片上，可以同時對這些樣本的DNA、RNA、蛋白質(zhì)水平進行檢測，同化了實驗條件，減少了常規(guī)方法中因分批、分次實驗造成的誤差，并節(jié)約了實驗試劑和時間[4]。幾乎任何組織都能夠使用TMA技術(shù)排列，所以其應用范圍相當廣泛。目前TMA技術(shù)絕大多數(shù)應用于癌癥研究領(lǐng)域，如多腫瘤組織芯片(不同類型腫瘤)、腫瘤進展組織芯片(有腫瘤分期資料)、腫瘤預后組織芯片(有隨訪至臨床終點的資料)等[5-6]。TMA被還成功地用于許多非腫瘤疾病，如阿爾茨海默癥或炎癥性疾病的研究[7]。組織芯片的應用領(lǐng)域也在不斷的拓展，可用于IHC及原位雜交等分子生物學技術(shù)研究[8-9]。TMA為基因功能研究走向臨床提供了捷徑。

由于組織芯片制作儀價格昂貴，使該項技術(shù)無法在絕大多數(shù)醫(yī)院開展。亦有報道手工制作組織芯片的技術(shù)，但絕大多數(shù)只適合50個以下微陣列的芯片制作。本研究介紹的簡易組織芯片制作技術(shù)成本低，簡便快捷，可操作性強，經(jīng)過長期反復實踐摸索改良，現(xiàn)已成熟并且能制作高質(zhì)量高密度的組織芯片，微陣列達90～100個甚至更多，滿足了臨床及科研的需要，并且容易在基層醫(yī)院開展。傳統(tǒng)的制作組織芯片的方法都是先在模體蠟塊上穿刺出多個組織芯的孔位，然后植入組織芯[10]。這種方法制作繁瑣不易控制，芯片密度小，對蠟質(zhì)的要求較高，對試劑的需求量大。而改良后我們直接在受體蠟塊上挖一芯槽，手工操作更容易，組織芯用少許膠水粘連相互緊貼直接排布于槽內(nèi)，芯片密度更大，15 mm×15 mm的芯槽內(nèi)可包埋直徑1.8 mm的組織芯柱90個。芯柱之間相互緊貼排布，可使芯柱間無多余空隙，互相支撐避免傾倒移位，膠水固定使得在制作過程中芯柱更加穩(wěn)固。制作過程中需要注意幾點：①組織芯柱粘取膠水時，一定要讓有病變組織的一端向下粘膠，并植入芯槽內(nèi)，這樣能使病變組織處于同一平面內(nèi)；②組織芯陣列排列完畢，不要立即熔蠟包埋，應放入烤箱使膠水揮發(fā)干燥，否則芯柱固定不牢靠影響包埋和切片；③在熔蠟階段，切勿移動包埋模，即使發(fā)現(xiàn)芯柱移位或傾倒也不能用鑷子或其他工具試圖觸碰芯柱，否則會造成更多的組織芯移位倒浮，打亂陣列排布；④裱片時，盡量用吸水紙吸凈蠟片與載玻片之間的水分，否則在烤片時，石蠟熔化，微組織片可能隨著水分的流出而游走；⑤在切片之前最好將蠟塊放置4 ℃冰箱中過夜，連續(xù)切片之前再放置冰臺上片刻，可以使組織收縮利于切片；⑥展片的水溫控制在48 ℃左右，展片3、4 s迅速撈片，展片溫度過高或時間延長會使微組織離散；⑦組織芯蠟塊包埋的材料可穩(wěn)定多年，蠟塊切片后需封蠟保存，大批量制備組織芯片時，切片后的組織可能由于氧化丟失某些抗原，最好是芯片染色前即切即用，如果一次將組織芯蠟塊全部切完，應將組織芯片蠟封低溫保存。

組織芯片也有其潛在的缺點，最主要的是組織取材相對較少，而蛋白質(zhì)的表達在腫瘤內(nèi)部具有異質(zhì)性，所取位點的微組織并不一定能代表腫瘤的全貌；Fonseca等[11]利用82例多形性腺瘤標本，分別制作了直徑為1.0、2.0和3.0 mm組織芯的TMA，IHC分析細胞角蛋白7、Ki67、P63及CD34，結(jié)果顯示與傳統(tǒng)大標本病理切片相比，1.0 mm芯的TMA陽性率低于2.0和3.0 mm組織芯TMA，原因可能與基質(zhì)組織的量增加有關(guān)，推薦直徑2.0 mm的TMA為最佳選擇。van Zwieten[12]利用57種抗體，對含有89個直徑1 mm組織芯的TMA進行研究，以評估TMA技術(shù)對IHC診斷的有效性和可行性，結(jié)果顯示，相對于普通蠟塊切片染色，應用TMA技術(shù)的55種抗體得到預期的陽性染色，一些抗體還出現(xiàn)了未預料的陽性免疫反應，認為TMA技術(shù)可以有效地進行IHC診斷，并為組織病理學家提供有價值的信息。因此，增大組織芯直徑和增加同一樣本組織芯的數(shù)量可以很好地解決異質(zhì)性的問題。推薦組織芯直徑最好在1.0～2.0 mm；研究病例較少，若組織芯直徑小于1.0 mm，建議每個病例最好選取2個點位。Avninder等[13]提出在制作TMA時，有些組織需要特別注意，如前列腺癌建議多位點取芯，骨組織取芯困難，對于骨病變?nèi)绻侨饬鲎詈貌捎弥睆?.0 mm的針芯取材。其次切片上微組織在加工過程中的移位、脫落，給結(jié)果的判定帶來誤差，為了減少這種誤差，我們通過使用黏合劑(稀釋了的膠水)來固定組織芯，達到了很好的效果。

組織芯片技術(shù)具有大樣本、高通量、高效率、低消耗、易于標準化等諸多優(yōu)點，還可以與IHC、原位雜交、原位PCR等其他分子生物學技術(shù)相結(jié)合。加之本文介紹的自制工具及操作技術(shù)簡便易行，經(jīng)濟實用，易于普及，尤其適用于基層醫(yī)院。因此，組織芯片技術(shù)將成為篩查與診斷、預后和預測相關(guān)的生物標志物的快速及高性價比的方式，并逐漸成為個體化醫(yī)療中發(fā)現(xiàn)并驗證生物標記的必備工具。采用組織芯片將大大加快基礎(chǔ)研究成果向臨床應用的轉(zhuǎn)化。(本文圖見封三)

[參考文獻]

[1]Kallioniemi OP,Wagner U,Kononen J,et al.Tissue microarray technology for high-throughput molecular profiling of cancer[J].Hum Mol Genet,2001,10(7):657-662.

[2]Pandey A,Kurup A,Shrivastava A,et al.Cancer testes antigens in breast cancer:biological role,regulation,and therapeutic applicability[J].Int Rev Immunol,2012,31(5):302-320.

[3]Hawley S,Fazli L,McKenney JK,et al.A model for the design and construction of a resource for the validation of prognostic prostate cancer biomarkers:the Canary Prostate Cancer Tissue Microarray[J].Adv Anat Pathol,2013,20(1):39-44.

[4]Jawhar NM.Tissue microarray:a rapidly evolving diagnostic and research tool[J].Ann Saudi Med,2009,29(2):123-127.

[5]Arafa M,Boniver J,Delvenne P.Progression model tissue microarray (TMA) for the study of uterine carcinomas[J].Dis Markers,2010,28(5):267-272.

[6]Sun X,Guo L,Wang J,et al.Prognostic value of matrix metalloproteinase 9 expression in patients with juvenile nasopharyngeal angiofibroma:Tissue microarray analysis[J].Int J Pediatr Otorhinolaryngol,2014,78(8):1232-1238.

[7]Simon R.Applications of tissue microarray technology[J].Methods Mol Biol,2010,664:1-16.

[8]Franco R,Caraglia M,Facchini G,et al.The role of tissue microarray in the era of target-based agents[J].Expert Rev Anticancer Ther,2011,11(6):859-869.

[9]Cihoric N,Savic S,Schneider S,et al.Prognostic role of FGFR1 amplification in early-stage non-small cell lung cancer[J].Br J Cancer,2014,110(12):2914-2922.

[10]何春年,趙煥芬,陳士超,等.HBME-1和p14ARF抑癌基因在甲狀腺腫瘤診斷與鑒別中的意義[J].河北醫(yī)科大學學報,2008,29(1):50-53.

[11]Fonseca FP,de Andrade BA,Rangel AL,et al.Tissue microarray is a reliable method for immunohistochemical analysis of pleomorphic adenoma[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol,2014,117(1):81-88.

[12]van Zwieten A.Tissue microarray technology and findings for diagnostic immunohistochemistry[J].Pathology,2013,45(1):71-79.

[13]Avninder S,Ylaya K,Hewitt SM.Tissue microarray:a simple technology that has revolutionized research in pathology[J].J Postgrad Med,2008,54(2):158-162. OP,Wagner U,Kononen J,et al.Tissue microarray technology for high-throughput molecular profiling of cancer[J].Hum Mol Genet,2001,10(7):657-662.