m Ab-EGFR功能化修飾的納米金棒靶向光熱作用對(duì)下咽癌FADU細(xì)胞株和293T細(xì)胞株的溫度影響△

張熒熒何曉光叢林海董守安李玉曉鐘玲王雨丁演鸝

·實(shí)驗(yàn)研究·

m Ab-EGFR功能化修飾的納米金棒靶向光熱作用對(duì)下咽癌FADU細(xì)胞株和293T細(xì)胞株的溫度影響△

張熒熒1何曉光1叢林海1董守安2李玉曉1鐘玲1王雨1丁演鸝1

目的 探討上皮生長(zhǎng)因子受體單克隆抗體（epidermal growth factor receptor monoclonal antibody，m Ab-EGFR）功能化修飾的納米金棒靶向光熱作用對(duì)下咽癌FADU細(xì)胞株和非腫瘤細(xì)胞的溫度影響。方法 在CTAB體系下合成實(shí)驗(yàn)所需納米金棒并完成上皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）單克隆抗體功能化修飾，用紫外分光光度計(jì)及電鏡表征；以體外培養(yǎng)的下咽癌FADU細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞293T細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)材料，用western blot免疫印跡法定性比較兩株細(xì)胞EGFR的表達(dá)及明確細(xì)胞內(nèi)吞納米金棒；Annexin-5／PI雙染法熒光顯微鏡觀察FADU細(xì)胞和293T細(xì)胞凋亡情況；設(shè)定不同劑量納米金濃度（15%、25%、35%），應(yīng)用808 nm波長(zhǎng)近紅外激光照射6分鐘，每隔一分鐘檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)溫度，并用XTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果 納米金棒濃度在15%～25%、近紅外激光照射6分鐘時(shí)，細(xì)胞溫度為41～43℃，并且趨于穩(wěn)定，對(duì)下咽癌細(xì)胞有明顯的殺傷作用（P＜0.05），而對(duì)293T細(xì)胞沒(méi)有明顯的殺傷作用，而納米金棒濃度在35%時(shí)對(duì)下咽癌FADU細(xì)胞和293T細(xì)胞都具有明顯的殺傷作用（P＜0.05）。結(jié)論 濃度為15%～25%m Ab-EGFR功能化修飾的納米金棒在近紅外激光照射6分鐘時(shí)細(xì)胞溫度升至41～43℃，對(duì)下咽癌細(xì)胞具有明顯的殺傷作用，而對(duì)非腫瘤細(xì)胞無(wú)明顯損傷。

上皮生長(zhǎng)因子受體單克隆抗體； 納米金棒； 下咽癌FADU細(xì)胞株； 細(xì)胞溫度

納米金是一種具有近紅外吸收和散射功能的貴金屬納米材料，納米金的表面等離波子共振效應(yīng)能使納米金棒產(chǎn)生熱能，即納米金在近紅外激光下的光熱效應(yīng)。腫瘤細(xì)胞代謝異常，在細(xì)胞膜的表面可產(chǎn)生過(guò)表達(dá)的特異性蛋白，納米金粒子能夠以較強(qiáng)的親和力與抗體或蛋白質(zhì)、DNA片段形成共軛物種，這些物種選擇性的或通過(guò)免疫介導(dǎo)靶向結(jié)合在腫瘤細(xì)胞膜表面上，增加惡性腫瘤治療的準(zhǔn)確性。納米金棒的共軛物種也會(huì)吸收連續(xù)波激光器發(fā)射出的近紅外照射（near infrared radiation，NIR），把吸收的光能轉(zhuǎn)換成大量的熱能，這些瞬間散發(fā)的熱量足夠有效的轟擊腫瘤細(xì)胞而不會(huì)損傷周?chē)恼＜?xì)胞，從而達(dá)到使癌細(xì)胞凋亡的目的。頭頸部惡性腫瘤中上皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）檢出率高達(dá)98.3%［1］，為納米金棒靶向治療頭頸部惡性腫瘤提供可能。下咽癌是發(fā)生在喉咽部的惡性腫瘤，多以鱗狀細(xì)胞癌為主，其治療以手術(shù)切除加術(shù)后放化療為主，然而因?yàn)槠渚哂泻芨叩哪退幒娃D(zhuǎn)移特性，所以預(yù)后很差，5年生存率在40%左右［2，3］。本實(shí)驗(yàn)分析EGFR功能化修飾的納米金棒在近紅外激光的激發(fā)下對(duì)惡性和正常細(xì)胞株的溫度影響，探索納米金棒治療惡性腫瘤的可行性，為新型的腫瘤治療方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 下咽癌FADU細(xì)胞株（購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)），人腎上皮細(xì)胞293T細(xì)胞株（昆明動(dòng)物研究所），納米金棒（λ＝800 nm，吸光度為1.3）（昆明貴金屬研究所），鼠抗人EGFR單克隆抗體（美國(guó)SIGMA公司），808 nm波長(zhǎng)激光發(fā)生器。主要試劑為：MEM培養(yǎng)基（GIBCO公司，美國(guó)），胎牛血清（FBS）（GIBCO公司，美國(guó)），0.25%胰蛋白酶，羊抗小鼠IgG（ABMART公司，上海），Annexin-5／PI雙染試劑盒（Roche公司，美國(guó)），XTT試劑盒（Roche公司，美國(guó)），溫度測(cè)量?jī)x：TM-902C測(cè)溫表，購(gòu)自北京圣達(dá)駿業(yè)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 FADU細(xì)胞和293T細(xì)胞均設(shè)m Ab-EGFR／Au（金）+NIR組，Au+NIR組，m Ab-EGFR／Au組，Au組，NIR組，m Ab-EGFR組，空白對(duì)照組。加入m Ab-EGFR／Au及Au的濃度均設(shè)置為15%、25%、35%（近紅外激光照射為NIR）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 使用10%胎牛血清-MEM培養(yǎng)基，將FADU細(xì)胞置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，平均每2～3 d傳代1次。

1.3.2 納米金棒的合成、表征 ①在存在CTAB誘導(dǎo)試劑的水溶液體系中，研究利用熱化學(xué)或光化學(xué)還原HAuCl4生長(zhǎng)納米金棒方法。②anti-EGFR／Au共軛物的制備。調(diào)節(jié)納米金溶液的p H值為7.4，將納米金顆粒置于20 mmol HEPES（羥乙基哌嗪乙磺酸）緩沖液（p H＝7.4）中，直到所得溶液在800 nm處的光密度為0.8。將不同濃度鼠抗人EGFR單克隆抗體溶液分別稀釋到HEPES緩沖液中，形成500μl稀釋液，然后取上述制得的不同濃度單克隆抗體溶液與10 ml納米金溶液混合30分鐘。隨著anti-EGFR抗體濃度的增加，用美國(guó)Lambda900紫外可見(jiàn)光譜儀掃描，出現(xiàn)納米金溶液最大光吸收峰值不變時(shí)，進(jìn)入吸收峰值平臺(tái)的初始濃度即為所需最佳鼠抗人EGFR單克隆抗體濃度。取該濃度混合物溶液10 ml加入0.5 ml 1%的聚乙二醇中作用10分鐘后，在低溫下離心，得到anti-EGFR／Au共軛物，加入PBS緩沖液中（p H＝7.4），制備分散良好的穩(wěn)定的anti-EGFR／Au共軛物溶液，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞與納米金棒的相互作用 使用激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿（型號(hào)：P35G-1.5-14-C，美國(guó)康寧），將FADU細(xì)胞和293T細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)后以5×105個(gè)放置于專用培養(yǎng)皿，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，10%胎牛血清-MEM培養(yǎng)基，36小時(shí)后取出，棄培養(yǎng)基，加入3 ml納米金棒溶液后放置于CO2孵箱約45分鐘后，用激光共聚焦顯微鏡（Leica SP5）以633激光器488 nm激發(fā)波長(zhǎng)觀察納米金棒富集于細(xì)胞的情況。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)FADU細(xì)胞株及293T細(xì)胞EGFR的表達(dá) 用RIPA蛋白裂解液提取蛋白，以常規(guī)Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞EGFR蛋白的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參，做EGFR蛋白條帶吸光度定性分析，比較FADU細(xì)胞株及293T細(xì)胞EGFR的表達(dá)的差異。

1.3.5 Annexin-5／PI雙染法熒光顯微鏡觀察FADU細(xì)胞和293T細(xì)胞凋亡 選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞消化傳代，調(diào)整細(xì)胞密度為2.0 ×105／m L，將FADU下咽癌細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中（培養(yǎng)基容量為1 000μl），加入150μl、250μl及350μl m Ab-EGFR功能化修飾的納米金棒及近紅外激光處理6 min后，每孔加入100μl Annexin-5／PI熒光染色劑，室溫下孵育20 min，于激發(fā)波長(zhǎng)488 nm熒光纖維鏡下定性觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.3.6 測(cè)量溫度 選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞消化傳代，調(diào)整細(xì)胞密度為1.4×105個(gè)／ml，將FADU下咽癌細(xì)胞和293T細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，棄培養(yǎng)基，每孔加入檢測(cè)培養(yǎng)基（1%FBS+MEM）和納米金棒溶液共100μl，按比例分別加入15、25、35μl納米金溶液，其余用檢測(cè)培養(yǎng)基補(bǔ)齊，此時(shí)，納米金的濃度為15%、25%、35%。每個(gè)樣本設(shè)3次重復(fù)。置于CO2孵箱約45分鐘后，用808 nm激光發(fā)生器5 W／cm2將m Ab-EGFR／Au+NIR組和Au+NIR組照射6分鐘，每隔一分鐘測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)溫度并記錄。

1.3.7 XTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 完成溫度測(cè)量后，即照射6分鐘后，將XTT反應(yīng)顯色液加入96孔板中（按說(shuō)明書(shū)操作），每孔50μl，放置于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18小時(shí)后于酶標(biāo)儀讀板（波長(zhǎng)480 nm，參考波長(zhǎng)650 nm）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，不同處理因素間進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 m Ab-EGFR功能化修飾的納米金棒的表征

將制備好的納米金棒溶液放于比色皿中，在紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Lamda 900）中以400～1 000 nm波長(zhǎng)紫外光掃描對(duì)功能化修飾的納米金棒進(jìn)行表征和電鏡表征見(jiàn)圖1和圖2。

從圖1可見(jiàn)制備好的納米金棒最大吸收峰位于800 nm位置，經(jīng)m Ab-EGFR修飾后，納米金棒的最大吸收峰向右移動(dòng)，峰值為812 nm。圖2示將納米金溶液滴于銅網(wǎng)表面，干燥后于透射電鏡下15萬(wàn)倍觀察，可見(jiàn)納米金棒分散性良好，縱橫比大約為3.9，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 Western blot免疫印跡法檢測(cè)EGFR在FADU下咽癌細(xì)胞及293T細(xì)胞中的表達(dá) Western-blot結(jié)果見(jiàn)圖3。可見(jiàn)，F(xiàn)ADU細(xì)胞在170 KD條帶上可以明顯看到蛋白表達(dá)，293T細(xì)胞在170 KD條帶位置上未見(jiàn)表達(dá)，β-actin表達(dá)清晰。

圖1 納米金棒紫外吸收峰光譜圖

圖2 納米金棒電鏡表征圖（×150 000）

圖3 Western blot法檢測(cè)EGFR在FADU細(xì)胞和293T細(xì)胞表達(dá)電泳圖

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察納米金棒富集于細(xì)胞

用激光共聚焦顯微鏡（Leica SP5）以633激光器488 nm激發(fā)波長(zhǎng)觀察納米金棒富集于細(xì)胞情況如圖，圖中紅色的部分為納米金棒的富集部位（圖4）。

2.4 Annexin-5／PI雙染法熒光顯微鏡定性觀察FADU細(xì)胞和293T細(xì)胞凋亡，如圖5～12，綠染為細(xì)胞凋亡，紅染為細(xì)胞壞死。

圖4 納米金棒富集于細(xì)胞情況

圖5 15%m Ab-EGFR／Au+NIR作用FADU細(xì)胞后細(xì)胞凋亡（×10）

圖6 25%m Ab-EGFR／Au+NIR作用FADU細(xì)胞后細(xì)胞凋亡（×10）

圖7 35%m Ab-EGFR／Au+NIR作用FADU細(xì)胞后細(xì)胞凋亡（×10）

圖8 未經(jīng)處理FADU細(xì)胞凋亡（×20）

圖9 15%m Ab-EGFR／Au+NIR作用293T細(xì)胞后細(xì)胞凋亡（×10）

圖10 25%m Ab-EGFR／Au+NIR作用293T細(xì)胞后細(xì)胞凋亡（×20）

圖11 35%m Ab-EGFR／Au+NIR作用293T細(xì)胞后細(xì)胞凋亡（×10）

圖12 未經(jīng)處理的293T細(xì)胞凋亡（×10）

2.5 m Ab-EGFR功能化修飾納米金棒光熱作用對(duì)下咽癌FADU細(xì)胞及293T細(xì)胞溫度變化影響見(jiàn)表1～3。

表1 m Ab-EGFR／Au+NIR組293T細(xì)胞和FADU細(xì)胞不同納米金濃度時(shí)溫度變化情況（℃，±s）

表1 m Ab-EGFR／Au+NIR組293T細(xì)胞和FADU細(xì)胞不同納米金濃度時(shí)溫度變化情況（℃，±s）

作用時(shí)間（分）293T細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)溫度15%納米金 25%納米金 35%納米金FADU細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)溫度15%納米金 25%納米金 35%納米金0 15 25.67±0.58 25.00±0.00 1 28.00±0.00 33.33±0.58 36.00±1.73 30.00±1.00 33.00±0.00 34.67±0.58 2 32.67±0.58 37.67±2.31 42.33±0.58 32.67±2.52 38.33±0.58 38.67±0.58 3 34.67±1.53 40.33±1.53 46.33±0.58 35.00±1.00 41.33±1.15 42.67±0.58 4 37.33±3.06 43.00±2.00 51.00±1.73 39.67±0.58 46.00±1.00 47.00±2.00 5 39.67±5.03 44.00±1.73 53.33±1.53 43.67±1.53 49.67±0.58 51.67±2.08 6 41.00±4.58△44.33±1.15△58.00±2.00*△45.33±0.58△51.00±1.00△55.33±0.58 24.33±1.15 25.67±0.58 25.00±0.00 24.33±1. *△

表2 Au+NIR組293T細(xì)胞和FADU細(xì)胞不同納米金濃度時(shí)溫度變化情況（℃，±s）

表2 Au+NIR組293T細(xì)胞和FADU細(xì)胞不同納米金濃度時(shí)溫度變化情況（℃，±s）

注：*與相同時(shí)間、同類(lèi)15%、25%m Ab-EGFR／Au+NIR處理組比較，P＜0.001；△與相同濃度不同時(shí)間比較，P＜0.01；※與相同劑量濃度條件下m Ab-EGFR／Au+NIR處理組（表1）比較，P＜0.01

作用時(shí)間（分）293T細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)溫度15%納米金 25%納米金 35%納米金FADU細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)溫度15%納米金 25%納米金 35%納米金0 00 26.00±0.00 27.33±2.31 1 30.33±0.58 30.68±0.58 35.67±0.58 31.00±0.00 33.67±0.58 36.00±0.00 2 33.00±1.00 33.33±1.15 38.67±0.58 34.00±0.00 36.00±0.00 38.00±0.00 3 36.00±0.00 35.00±0.00 36.67±0.58 36.00±0.00 40.67±1.15 40.00±0.00 4 37.67±0.58 37.00±0.00 38.67±0.58 38.00±0.00 44.00±0.00 42.67±0.58 5 38.67±1.53 37.33±0.58 39.67±0.58 39.00±0.00 45.00±0.00 46.00±0.00 6 41.00±1.00△37.67±0.58△41.33±0.58*△41.33±1.15△※46.33±1.15△※47.33±0.58 25.67±0.58 28.00±2.00 25.67±0.58 26.00±0. *△※

表3 不同作用時(shí)間下各處理組293T細(xì)胞和FADU細(xì)胞溫度變化情況（℃，±s）

表3 不同作用時(shí)間下各處理組293T細(xì)胞和FADU細(xì)胞溫度變化情況（℃，±s）

注：*與表1及表2中相同時(shí)間比較，P＜0.01

作用時(shí)間（分）293T細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)溫度mAb-EGFR／Au Au mAb-EGFR NIR 空白對(duì)照FADU細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)溫度mAb-EGFR／Au Au mAb-EGFR NIR 空白對(duì)照0 24.02±0.15 24.08±0.34 24.00±0.30 24.02±0.50 24.00±0.40 24.00±0.15 24.05±0.58 24.00±0.76 24.02±0.06 24.00±1.49 1 24.05±0.87 24.00±0.59 24.34±0.32 24.23±0.09 24.50±0.85 24.43±0.76 24.27±0.39 24.13±1.50 24.06±0.79 24.30±0.87 2 24.09±0.35 24.10±0.40 24.10±0.31 24.00±0.04 24.79±1.23 24.13±0.15 24.09±0.60 24.11±0.90 24.45±0.54 24.20±1.59 3 24.05±0.12 24.07±0.61 24.00±0.76 24.56±0.46 24.70±0.40 24.00±0.13 24.23±0.03 24.20±1.32 24.47±0.25 24.00±2.02 4 24.03±0.45 24.35±0.46 24.14±0.56 24.08±0.08 24.00±0.89 24.08±0.16 24.18±0.47 24.23±1.67 24.43±1.36 24.30±1.67 5 24.23±0.33 24.42±0.43 24.23±0.34 24.34±0.78 24.00±1.67 24.41±0.20 24.10±0.75 24.50±0.75 24.45±0.73 24.60±1.10 6 24.20±0.21*24.40±0.56*24.30±0.98*24.35±0.95*24.10±1.58*24.33±0.20*24.00±0.23*24.50±1.42*24.52±1.32*24.34±1.97*

m Ab-EGFR功能化修飾的納米金棒對(duì)于下咽癌FADU細(xì)胞和293T細(xì)胞在近紅外激光的照射下都表現(xiàn)為照射時(shí)間越長(zhǎng)，溫度越高，照射時(shí)間為5至6分鐘時(shí)，溫度相對(duì)恒定（表1）；未經(jīng)m Ab-EGFR功能化修飾的納米金棒對(duì)于下咽癌FADU細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞293T細(xì)胞在近紅外激光的照射下也表現(xiàn)為照射時(shí)間越長(zhǎng)，溫度越高，照射5至6分鐘時(shí)溫度相對(duì)恒定（表2）；并且相同劑量條件下m Ab-EGFR功能化修飾的納米金棒對(duì)于下咽癌FADU細(xì)胞和293T細(xì)胞在近紅外激光的照射下與未經(jīng)m Ab-EGFR功能化修飾的納米金棒相比較產(chǎn)熱溫度更高（表1與表2比較）。未經(jīng)近紅外激光照射的納米金棒（m Ab-EGFR／Au）、單獨(dú)近紅外激光照射（NIR）、單克隆抗體（m Ab-EGFR）本身及空白對(duì)照組不會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生熱量，各處理組溫度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。

2.6 XTT法檢測(cè)m Ab-EGFR功能化修飾納米金棒光熱作用對(duì)FADU下咽癌細(xì)胞及293T細(xì)胞存活率影響 在m Ab-EGFR功能化修飾納米金棒光熱作用下FADU細(xì)胞的存活率明顯下降，且納米金濃度越高對(duì)FADU細(xì)胞的殺傷程度越大，與空白對(duì)照組比較，F(xiàn)ADU腫瘤細(xì)胞的存活率明顯降低（P＜0.001），濃度為15%組與25%組293T細(xì)胞存活率相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但35%納米金濃度對(duì)293T細(xì)胞殺傷明顯（P＜0.001）（表4）。下咽癌FADU細(xì)胞EGFR單克隆抗體處理組細(xì)胞增殖率較空白對(duì)照組明顯下降（P＜0.01），而m Ab-EGFR組293T細(xì)胞增殖率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），單純NIR處理?xiàng)l件下FADU及293T細(xì)胞的增殖率與空白對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明EGFR單克隆抗體對(duì)下咽癌細(xì)胞有一定殺傷協(xié)同效應(yīng)，對(duì)293T細(xì)胞無(wú)明顯殺傷作用，單獨(dú)NIR對(duì)FADU及293T細(xì)胞均無(wú)明顯殺傷作用（表5）。

表4 不同處理?xiàng)l件下293T細(xì)胞和FADU細(xì)胞在不同濃度納米金作用下的增殖率（%，±s）

表4 不同處理?xiàng)l件下293T細(xì)胞和FADU細(xì)胞在不同濃度納米金作用下的增殖率（%，±s）

注：*與15%、25%m Ab-EGFR／Au+NIR處理組比較，P＜0.001；△與表5中空白對(duì)照組數(shù)據(jù)比較，P＜0.001

處理?xiàng)l件293T細(xì)胞增殖率15%納米金 25%納米金 35%納米金FADU細(xì)胞增殖率15%納米金 25%納米金 35%納米金m Ab-EGFR／Au+NIR 1.13±0.03 1.07±0.06 0.69±0.01*△0.92±0.03 0.90±0.01 0.59±0.07*△Au+NIR 1.04±0.06 1.10±0.13 0.53±0.03 0.95±0.05 0.94±0.04 0.47±0.03 m Ab-EGFR／Au 1.15±0.06 1.00±0.03 0.68±0.05 1.03±0.05 0.77±0.08 0.47±0.04 Au 1.16±0.02 0.82±0.03 0.56±0.02 1.07±0.06 0.77±0.02 0.53±0.02

表5 其他處理?xiàng)l件下293T細(xì)胞和FADU細(xì)胞增殖率（%，±s）

表5 其他處理?xiàng)l件下293T細(xì)胞和FADU細(xì)胞增殖率（%，±s）

注：*與FADU細(xì)胞空白對(duì)照組比較，P＜0.01

其他處理?xiàng)l件293T細(xì)胞增殖率FADU 細(xì)胞增殖率m Ab-EGFR 1.11±0.02 1.05±0.07*NIR 1.21±0.01 1.44±0.01空白對(duì)照1.22±0.01 1.40±0.01

3 討論

納米金粒子具有與尺寸和形狀相關(guān)的可調(diào)光學(xué)特性。當(dāng)納米粒子直徑遠(yuǎn)小于激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)，某一頻率的電場(chǎng)將引起金屬自由電子穿越納米粒子時(shí)的相干振蕩，這種振蕩會(huì)導(dǎo)致電磁場(chǎng)中的吸收和散射增強(qiáng)，被稱為表面等離波子共振，而納米金的表面等離波子共振效應(yīng)能使納米金棒產(chǎn)生熱能，即納米金在近紅外激光下的光熱效應(yīng)。

納米金微粒能快速（大約1 ps）將吸收的光轉(zhuǎn)化為熱能，不同直徑的納米金顆粒具有吸收近紅外線發(fā)熱的特點(diǎn)，有研究使用抗體修飾中空納米金顆粒，增強(qiáng)納米金顆粒在腫瘤細(xì)胞的富集，然后采用紅外線照射，通過(guò)光熱療法殺滅腫瘤細(xì)胞［4］。經(jīng)近紅外激光照射后，納米金棒對(duì)從可見(jiàn)區(qū)到近紅外區(qū)的強(qiáng)吸收特性使得光能可以高效地轉(zhuǎn)換為熱能，因此可以在局部范圍進(jìn)行激光選擇性加熱，這非常適合作為分子或細(xì)胞的靶向治療。經(jīng)蛋白質(zhì)大分子修飾的納米金棒的共軛物種也會(huì)吸收連續(xù)波激光器發(fā)射出的近紅外低能量輻射，納米棒把吸收的光能轉(zhuǎn)換成大量的熱，這些瞬間散發(fā)的熱量足夠有效地轟擊腫瘤細(xì)胞而不會(huì)損傷周?chē)恼＜?xì)胞組織，從而達(dá)到使癌細(xì)胞凋亡的目的。采用這種納米金棒輔助激光熱作用方法，可對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行選擇性破壞，而不損害正常細(xì)胞。

國(guó)外一系列研究［5～8］表明，用抗EGFR抗體與納米金棒結(jié)合后，再與過(guò)表達(dá)EGFR的口腔鱗癌細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)納米金棒大量聚集于癌細(xì)胞膜表面；以820 nm波長(zhǎng)紅外光、4 W／cm2能量照射時(shí)，納米金棒吸收光能并以大量熱能的方式有效地傳遞給環(huán)境細(xì)胞，這些熱量甚至高到100℃以上，附著納米金棒的惡性細(xì)胞只需比良性細(xì)胞一半的激光能量就能被殺死。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用LDH法（乳酸脫氫酶法）證實(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中，功能化修飾的納米金棒光熱作用殺傷人咽部鱗癌的安全劑量為15%～25%，并且在此濃度劑量下對(duì)非腫瘤細(xì)胞沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性［9］。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用EGFR單克隆抗體修飾納米金棒靶向光熱作用于下咽癌FADU細(xì)胞株和2293T細(xì)胞株，可見(jiàn)納米金棒富集于細(xì)胞后通過(guò)近紅外激光照射（NIR）6 min后下咽癌FADU細(xì)胞和293T細(xì)胞均可以達(dá)到41～43℃，而且在照射5～6分鐘時(shí)溫度趨于穩(wěn)定，短時(shí)間內(nèi)納米金棒產(chǎn)生的能量能有效地殺傷下咽癌FADU細(xì)胞；吸光度為1.3時(shí)，濃度為35%的m Ab-EGFR功能化修飾納米金棒光熱作用在殺傷下咽癌細(xì)胞的同時(shí)對(duì)良性細(xì)胞也有損傷；但濃度為15%～25%的m Ab-EGFR功能化修飾納米金棒光熱作用能夠有效殺傷下咽癌細(xì)胞而對(duì)良性細(xì)胞損傷較小，與體外細(xì)胞毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果［9］相吻合，故認(rèn)為在體外實(shí)驗(yàn)中，濃度為15%～25%的m Ab-EGFR功能化修飾納米金棒光熱作用對(duì)下咽癌細(xì)胞具有明顯的靶向殺傷作用。

納米金具有很好的組織相容性，對(duì)機(jī)體無(wú)毒，而且納米金小于血管內(nèi)皮的間隙，能夠通過(guò)微血管和毛細(xì)血管進(jìn)入組織細(xì)胞中。功能修飾化的納米金棒具有較高的靶向性，可以在腫瘤組織內(nèi)停留聚集［10］，在惡性腫瘤治療和診斷方面開(kāi)拓了新領(lǐng)域，在生物成像、癌癥治療等方面已經(jīng)取得了較好的成績(jī)。納米金微粒與靶向抗體相結(jié)合，利用近紅外激光產(chǎn)生光熱效應(yīng)為腫瘤的靶向治療提供了新穎而有效的方法，今后將繼續(xù)深入探討其殺傷作用的相關(guān)基因與蛋白表達(dá)的變化，探索其殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制，為靶向治療咽喉部惡性腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 Magne N，Pivot X，Bensadoun RJ，et al.The relationship of epidermal growth factor receptor levels to the prognosis of unresectable pharyngeal cancer patients treated by chemo-radiotherapy［J］.Eur J Cancer，2001，37：2169.

2 Hoffman HT，Karnell LH，F(xiàn)unk GF，et al.The national cancer data base report on cancer of the head and neck［J］.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，1998，124：951.

3 Hoffman HT，Karnell LH，Shan JP，et al.Hypopharyngeal patient care evaluation［J］.Laryngoscope，1997，107：1005.

4 Bonner JA，Harari PM，Giralt J，et al.Radiotherapy plus cetuximab for squamous-cell carcinoma of the head and neck［J］.N Engl J Med，2006，354：567.

5 El-Sayed IH，Huang X，El-Sayed MA.Surface plasmon resonance scattering and absorption of anti-EGFR antibody conjugated gold nanoparticles in cancer diagnostics：applications in oral cancer［J］.Nano Letters，2005，5：829.

6 Huang X，El-Sayed IH，El-Sayed MA.Cancer cell imaging and photothermal therapy in the near-infrared region by using gold nanorods［J］.J Am Chem Soc，2006，128：2115.

7 Huang X，Jain PK，El-Sayed IH，et al.Determination of the minimum temperature required for selective photothermal destruction of cancer cells using immunotargeted gold nanoparticles［J］.Photochem Photobiol，2006，82：412.

8 El-Sayed IH，Huang X，El-Sayed MA.Selective laser photo-thermal therapy of epithelial carcinoma using anti-EGFR antibody conjugated gold nanoparticles［J］.Cancer Lett，2006，239：129.

9 張熒熒，何曉光，董守安，等.m Ab-EGFR功能化修飾的金納米棒靶向光熱作用對(duì)人咽鱗癌FADU細(xì)胞株和293T細(xì)胞株的細(xì)胞毒性分析［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2014，28：884.

10 Dipanjan P，Manojit P，Angana S.A facile synthesis of novel self-assembled gold nanorods designed for near-infrared imaging［J］.J Nanosci Nanotech nol，2010，10：8118.

（2014-05-30收稿）（本文編輯 李翠娥）

An Analysis of the Diversification of Cell Temperature of Photothermal Effects of Gold Nanorods Coated with mAb-EGFR on FADU Human Pharyngeal Squamous Cell Lines and Non-tumor Cells 293 T Cell Line

Zhang Yingying*，He Xiaoguang，Cong Linhai，Dong Shouan，Li Yuxiao，Zhong Ling，Wang Yu，Ding Yanli
（*The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming，650032，China）

Objective To study the cell temperature on photothermal effects of gold nanorods coated with m Ab-EGFR targeted on FADU human pharyngeal squamous cell lines and non-tumor cells（293T cell line）.Methods CTAB gold nanorods were synthesized to complete the functional modifications of EGFR monoclonal antibody，with a UV spectrophotometer and electron microscopy characterization.The cultured FADU hypopharyngeal cells and non-tumor cells 293 T cell lines were expressed by western blot EGFR statutory comparison of two cell lines，cells to swallow the gold nanorods were observed.Cell apoptosis was observed by Annexin-V-FLUOS and propidium iodide.Then we set different doses of gold nanoparticles concentration（15%，25%，and 35%）.After 6minutes＇near-infrared laser irradiation（λ＝808 nm），the temperature was recorded once every minute，and cell viability was detected by XTT assay.Results After six minutes＇near-infrared laser irradiation，the cell temperature was 41℃～43℃，with 15%～25%of gold nanorods.The cell killing effects on hypopharyngeal were significant.The 293T cells did not show any damaging effects（P＜0.05），whereas the concentration of gold nanoparticles in 35%of hypopharyngeal FADU cells and 293T cells had significant cytotoxicity（P＜0.05）.Conclusion There were significant cell killing effects with 15%～25%gold nanorods coated with m Ab-EGFR in the near-infrared laser irradiation six minutes（Cell temperatures of both cell lines were 41℃～43℃）on hypopharyngeal FADU cell but not on non-tumor cells.

m Ab-EGFR； Gold nanorods； Hypopharyngeal cancer FADU cell lines； Cell temperature

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.02.013

時(shí)間：2015-3-3 14：39

R739.6

A

1006-7299（2015）02-0170-06

△ 國(guó)家教育部博士點(diǎn)（博導(dǎo)類(lèi)）基金課題（20125317110004）

1 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院頭頸外科（昆明 650032）； 2 昆明貴金屬研究所

張熒熒，女，昆明人，博士研究生，講師，主要研究方向?yàn)檠屎砟[瘤。

何曉光（Email：hexg1018@163.com）

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20150303.1439.012.html