不同宮內(nèi)缺氧時(shí)程對(duì)胎鼠腦組織STAT3表達(dá)的影響

陳　滟　曹　兵　王國(guó)棟　楊恩彬　叢樹(shù)園　陳　普*

1.云南中醫(yī)學(xué)院，云南　昆明　650500；2.云南省第二人民醫(yī)院，云南　昆明　650200

不同宮內(nèi)缺氧時(shí)程對(duì)胎鼠腦組織STAT3表達(dá)的影響

陳滟1曹兵2王國(guó)棟1楊恩彬1叢樹(shù)園1陳普1*

1.云南中醫(yī)學(xué)院，云南昆明650500；2.云南省第二人民醫(yī)院，云南昆明650200

【摘要】目的：研究不同宮內(nèi)缺氧時(shí)間對(duì)胚胎大鼠腦組織信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3蛋白表達(dá)的影響。 方法：制備乏氧性缺氧動(dòng)物模型，從胎齡15d到16d連續(xù)宮內(nèi)缺氧2d，分別缺氧2、4、6、8、12h共5個(gè)不同時(shí)程，采用免疫組化檢測(cè)胚胎大鼠腦組織STAT3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：與對(duì)照組比較，缺氧2h胎鼠腦組織STAT3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，在缺氧6h達(dá)最高(P<0.05)；缺氧8h較對(duì)照組染色增強(qiáng)，但較缺氧6h表達(dá)減弱(P<0.05)；缺氧12h組與對(duì)照組相比STAT3表達(dá)降低(P<0.05)。結(jié)論：短時(shí)缺氧(缺氧2、4、6、8h)能增強(qiáng)胎鼠腦組織STAT3蛋白的表達(dá)，但缺氧時(shí)間較長(zhǎng)(缺氧12h)會(huì)降低STAT3蛋白的表達(dá)，說(shuō)明宮內(nèi)缺氧對(duì)胚胎腦組織的影響可能通過(guò)STAT3通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。

【關(guān)鍵詞】STAT3；缺氧；胚胎；腦組織

胎兒窘迫是胎兒宮內(nèi)缺氧危及胎兒健康和生命的綜合征，常發(fā)生在臨產(chǎn)或妊娠后期，是未生兒死亡的主要原因。神經(jīng)組織對(duì)缺氧較為敏感，胎兒窘迫可引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。研究表明，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal trnasducer and aetivator of tnarscription 3，STAT3)參與多種基因的表達(dá)和調(diào)控，并與其他轉(zhuǎn)錄因子一起形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與到胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程[1]。在局部腦缺血再灌注的研究中發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧可激活神經(jīng)元STAT3的表達(dá)[2]。陳良萬(wàn)等[3]研究缺血性腦損傷發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié)JAK2-STAT3可以減輕腦損傷。研究觀察宮內(nèi)不同缺氧時(shí)間對(duì)胚胎神經(jīng)組織STAT3蛋白表達(dá)的影響，以探討STAT3在胎兒窘迫腦損傷中的作用。

1材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑云南系健康成年雌性SD大鼠30只(體重250~300g)，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。STAT3免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物有限公司)。

1.2儀器泵吸式紅外二氧化碳檢測(cè)儀；JZ80-二氧化碳檢測(cè)儀；奧林巴士顯微鏡。

1.3動(dòng)物模型的建立將30只成年雌性大鼠分別與雄鼠配種，于第二日早晨發(fā)現(xiàn)雌鼠陰栓記為妊娠0d，至孕15d。將孕鼠隨機(jī)分為：對(duì)照組、缺氧2h組、缺氧4h組、缺氧6h組、缺氧8h組、缺氧12h組，每組各5只(每只孕鼠可得胎鼠5~8只，每小組均隨機(jī)選10只胎鼠)。將缺氧組各孕鼠放入裝有300ng石灰(可吸收CO2)的4000ml容量的玻璃缸內(nèi)，密閉瓶蓋(廣口瓶下端通過(guò)活塞連接氧氣袋，活塞與氧氣袋之間有約50ml容量的小氣囊)。玻璃缸內(nèi)還連接有測(cè)氧儀，使缸內(nèi)O2濃度維持在10%~11%。當(dāng)O2濃度降低時(shí)，通過(guò)活塞將小氣囊中氧氣緩慢擠壓入玻璃缸內(nèi)，維持O2濃度恒定。如此反復(fù)，直至孕鼠持續(xù)低張性缺氧達(dá)所需時(shí)程取出。孕16d相同操作至缺氧時(shí)間，取出復(fù)氧2h。然后將各孕鼠脫頸處死，快速剖腹取出胎鼠，取胎鼠腦放入10%甲醛固定。對(duì)照組孕鼠不缺氧直接取胎鼠腦組織固定。

1.4免疫組化每組每只孕鼠隨機(jī)選2只胎鼠腦組織作常規(guī)石蠟切片(冠狀切，片厚4μm)。選三張連續(xù)切片進(jìn)行HE染色和免疫組化染色。顯微鏡下觀察、照相、圖像分析。

2結(jié)果

2.1顯微觀察情況胎鼠腦組織STAT3免疫組織化學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒，主要分布在前腦泡和腦室的室管膜細(xì)胞；前腦泡分化為端腦的區(qū)域可見(jiàn)陽(yáng)性實(shí)心細(xì)胞條帶，并在腦泡邊緣可見(jiàn)陽(yáng)性神經(jīng)上皮細(xì)胞層；一些切片可在端腦內(nèi)見(jiàn)到陽(yáng)性細(xì)胞呈團(tuán)塊狀分布；眼泡也有陽(yáng)性表達(dá)。由圖1~6可知，各組間STAT3的陽(yáng)性表達(dá)差異較大。對(duì)照組室管膜細(xì)胞胞質(zhì)的STAT3陽(yáng)性表達(dá)較弱，缺氧2h組STAT3的陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組顏色明顯增強(qiáng)；缺氧4h組陽(yáng)性區(qū)域顏色與缺氧2h組差別不大，但面積增加；缺氧6h組STAT3的棕黃陽(yáng)性結(jié)果最深，而缺氧8h組STAT3的陽(yáng)性表達(dá)較缺氧6h組明顯下降，但與對(duì)照組比較差別不大；缺氧12h組幾乎沒(méi)有STAT3的表達(dá)。

2.2觀密度值情況由表1可知，與對(duì)照組比較，缺氧2h胎鼠腦組織STAT3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，在缺氧6h達(dá)最高(P<0.05)；缺氧2h組和缺氧4h組STAT3的蛋白表達(dá)無(wú)組間差異；缺氧6h組比缺氧4h組STAT3的表達(dá)增強(qiáng)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；缺氧8h較對(duì)照組染色增強(qiáng)，但較缺氧6h表達(dá)減弱(P<0.05)；缺氧12 h組與對(duì)照組比較，STAT3表達(dá)降低(P<0.05)。

表1 各組STAT3免疫組化陽(yáng)性O(shè)D值

組別OD組別OD對(duì)照組0.121±0.097缺氧6h組0.182±0.105△★缺氧2h組0.153±0.053△缺氧8h組0.132±0.087△▲缺氧4h組0.167±0.112△缺氧12h組0.099±0.023△●

注：與對(duì)照組比較，△P<0.05；與缺氧4h比較，★P<0.05；與缺氧6h比較，▲P<0.05；與缺氧8h比較，●P<0.05。

3討論

星懿展在研究靶向STAT3基因干擾對(duì)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞增值分化影響發(fā)現(xiàn)，抑制神經(jīng)干細(xì)胞中的STAT3基因可以降低神經(jīng)干細(xì)胞的增殖活性，提示STAT3參與與胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化。胎兒宮內(nèi)窘迫的神經(jīng)損傷與神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān)。本研究組早期研究宮內(nèi)缺氧對(duì)胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞的影響發(fā)現(xiàn)：宮內(nèi)缺氧3、6、9h能刺激神經(jīng)干細(xì)胞增殖，而宮內(nèi)缺氧12h減少神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量[4]。這與本實(shí)驗(yàn)STAT3的變化呈現(xiàn)一致性，缺氧2h、4h、6h、8h能增強(qiáng)胎鼠腦組織STAT3蛋白的表達(dá)，但缺氧12h會(huì)降低STAT3蛋白的表達(dá)。提示宮內(nèi)缺氧對(duì)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的影響可能通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3通路發(fā)揮作用，但兩者的相關(guān)性還需要進(jìn)一步的證實(shí)。哺乳動(dòng)物大腦發(fā)育過(guò)程中，大腦皮質(zhì)、紋狀體、基底前腦區(qū)和海馬區(qū)均能檢測(cè)到STAT3的表達(dá)，且大量定位于巢蛋白(nestin)陽(yáng)性的NSC中，與NSC的標(biāo)記物Nestin呈現(xiàn)時(shí)空共表達(dá)性[5]。STAT3表達(dá)的變化，除影響神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，還會(huì)影響神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，STAT3的激活能促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖[6]。敲除STAT3能夠促使神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，抑制其生成膠質(zhì)細(xì)胞的能力[7]。然而，成年海馬區(qū)神經(jīng)元再生依賴于STAT3的激活[8]，軸突損傷后STAT3的過(guò)表達(dá)激活可促進(jìn)神經(jīng)元的再生[9]。本研究為后續(xù)研究宮內(nèi)缺氧神經(jīng)組織STAT3變化與神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化關(guān)系；與神經(jīng)元的變化關(guān)系；與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的變化關(guān)系提供一定的研究思路。深入研究宮內(nèi)窘迫神經(jīng)損傷的STAT3分子作用機(jī)制，可加深對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)，為臨床治療提供新作用靶點(diǎn)，提供一定的研究基礎(chǔ)。

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The Influence of Intrauterine Hypoxia in Different Time on STAT3 of Rat Embryo Brain Tissue

CHEN Yan1CAO Bing2WANG Guodong1YANG Enbing1CONG Shuyuan1CHEN Pu1

1. Yunnan college of traditional Chinese medicine, Kunming 650500,China;

2.The Second People′s Hospital Of Yunnan Province, Kunming 650200,China

Abstract:Objective To study the effect of intrauterine hypoxia in different time on the expression of STAT3 in rat embryo Brain tissue. Methods Gestational age 15 to 16 days rats were used of intrauterine hypoxia animal models. And the time of hypoxia respectively were 2、4、6、8、12h in a day. The protein expression levels of STAT3 in the Brain tissue of rat embryos were detected by immunohistochemical. Results By comparing with the control group, the protein expression levels of STAT3 in the Brain tissue of rat embryos were increased from hypoxia 2h, reached the highest level at 6h and decreased at 12h(P<0.05). Conclusion Hypoxia 2、4、6h and 8h can enhance the expression of STAT3 in the Brain tissue of rat embryos. But hypoxia 12h reduce the expression of STAT3. STAT3 possibly plays an important action in Hypoxic ischemia encephalopathy.

Key words:STAT3；Hypoxia；Embryo；Brain Tissue

(收稿日期：2015.09.05)

【中圖分類號(hào)】R693

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2015)24-0013-03

作者簡(jiǎn)介：陳滟(1976-)，醫(yī)學(xué)碩士，講師，主要從事發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)的研究。通信作者：陳普(1978-)，男，漢族，云南宣威人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師。主要從事民族醫(yī)藥研究及實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作。E-mail:chenynkm@126.com