外源性一氧化碳釋放分子2對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究*

劉志剛，熊 敏，余化龍，曾 云(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院骨科研究所，湖北十堰 442000)

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外源性一氧化碳釋放分子2對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究*

劉志剛，熊 敏△，余化龍，曾 云(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院骨科研究所，湖北十堰 442000)

目的 探討外源性一氧化碳釋放分子2(CORM2)對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與相關(guān)機(jī)制。方法 將30只健康雄性Wistar大鼠分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組，每組各10只。實(shí)驗(yàn)組在造模前1 h尾靜脈注射外源性CORM2。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組采用相同的方法造模。對(duì)照組造模后1 h注射與實(shí)驗(yàn)組相同劑量的生理鹽水?？瞻捉M僅完成開腹和關(guān)腹操作，并術(shù)后1 h注射與實(shí)驗(yàn)組相同劑量的生理鹽水。在術(shù)后不同時(shí)間進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(Tarlov評(píng)分)、脊髓組織病理學(xué)檢查和白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測(cè)。結(jié)果 再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組Tarlov評(píng)分均高于對(duì)照組，但實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Tarlov評(píng)分均低于空白組(P<0.05)。缺血再灌注48 h后，對(duì)照組脊髓組織標(biāo)本可見損傷及壞死神經(jīng)元，表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮或溶解，細(xì)胞質(zhì)中的尼氏體消失；空白組脊髓組織標(biāo)本中可見正常神經(jīng)元，表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)呈多角形，細(xì)胞質(zhì)中可見尼氏體；實(shí)驗(yàn)組脊髓組織標(biāo)本中的神經(jīng)元壞死表現(xiàn)介于對(duì)照組和空白組之間。缺血再灌注48 h，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組IL-6、TNF-α表達(dá)水平均高于空白組，但實(shí)驗(yàn)組IL-6、TNF-α表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 外源性CORM2可抑制炎性因子的表達(dá)，對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

外源性一氧化碳釋放分子2； 脊髓缺血再灌注損傷； 白細(xì)胞介素-6； 腫瘤壞死因子-α

脊髓缺血是比較危重的疾病，可導(dǎo)致組織失活，乃至死亡[1]。在脊髓缺血的病理生理學(xué)發(fā)病過(guò)程中，對(duì)組織造成損傷的主要因素是血液再次灌注后，大量釋放的自由基所造成的嚴(yán)重細(xì)胞損傷[2]。由于脊髓的神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)缺血缺氧極為敏感，因此脊髓缺血再灌注損傷極易導(dǎo)致脊髓功能障礙和不可逆性脊髓神經(jīng)元遲發(fā)性死亡[3-4]。一氧化碳(CO)是一種生物信號(hào)分子，其活性受到血紅素氧合酶(HO)的影響。HO是內(nèi)源性CO的誘導(dǎo)酶，分為誘導(dǎo)型(HO-1)和結(jié)構(gòu)型(HO-2)[5]。在脊髓組織缺血再灌注損傷過(guò)程中，HO-1表達(dá)水平明顯升高，阻斷HO-1則顯著加重組織損傷，間接證實(shí)CO對(duì)于組織缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[6-7]。CO可以促使血管平滑肌舒張，降低細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制炎性細(xì)胞和血小板的聚集和黏附[8]。此外，CO可通過(guò)抑制核因子κB(NF-κB)信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)保護(hù)效應(yīng)，抑制炎性介質(zhì)局部聚集[9]。本研究探討了外源性一氧化碳釋放分子2(CORM2)對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與相關(guān)機(jī)制?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量220～260 g，由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 儀器與試劑 TB209312型臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckman公司，AB873011型組織機(jī)械勻漿機(jī)購(gòu)自上海瑞賽斯儀器有限公司。炎性因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京華英生物技術(shù)研究所，絲裂原活化蛋白激酶P38(MAPK P38)抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。經(jīng)去RNA酶處理的二乙基焦磷酰胺(DEPC)及Trizol試劑購(gòu)自北京賽百盛生物公司。轉(zhuǎn)錄試劑盒、核酸酶抑制劑及Taq酶購(gòu)自日本寶生物工程有限公司。所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用于動(dòng)脈結(jié)扎的0、4、10號(hào)愛惜康牌外科縫線購(gòu)自美國(guó)強(qiáng)生公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 將30只Wistar大鼠分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組，每組各10只。造模前1 h，實(shí)驗(yàn)組按照8 mg/kg的劑量尾靜脈注射濃度為40 mmol/L的外源性CORM2。對(duì)照組及空白組在造模前不進(jìn)行任何預(yù)處理。

1.3.2 動(dòng)物模型制作 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，仰臥固定。于左側(cè)助骨下緣助中線切口，切口長(zhǎng)度5 cm，依次切開皮膚、腹肌后入腹，找到左側(cè)腎后于腎門部位確定腎動(dòng)脈，沿動(dòng)脈游離至腹主動(dòng)脈；分別使用10、4、0號(hào)外科縫線結(jié)扎動(dòng)脈，結(jié)扎使用活結(jié)，留長(zhǎng)線頭于體外；依次關(guān)腹、縫皮后留置線頭。于術(shù)后30 min、45 min和1 h抽線松節(jié)。實(shí)驗(yàn)組大鼠造模后不給予任何處理。對(duì)照組大鼠術(shù)后1 h注射與實(shí)驗(yàn)組相同劑量的生理鹽水?？瞻捉M大鼠麻醉后僅完成開腹及關(guān)腹操作，術(shù)后1 h注射與實(shí)驗(yàn)組相同劑量的生理鹽水，不對(duì)脊髓及血管進(jìn)行操作。

1.3.3 觀察指標(biāo) (1)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠在松結(jié)后，即再灌注后6、24、48 h，空白組大鼠在術(shù)后6、24、48 h，參照Tarlov標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分并記錄評(píng)分結(jié)果。0級(jí)(0分)：無(wú)可察覺的后肢活動(dòng)；1級(jí)(1分)：有可察覺的微弱后肢活動(dòng)，但無(wú)法對(duì)抗重力；2級(jí)(2分)：后肢能對(duì)抗重力，但無(wú)法站立；3級(jí)(3分)：可正常站立、行走，但不能正常跳躍；4級(jí)(4分)：后肢功能完全恢復(fù)，能正常跳躍。(2)組織病理學(xué)檢測(cè)：在完成神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后處死大鼠，切除L2～L4椎板，暴露L3～L4節(jié)段硬膜囊，切斷周圍神經(jīng)根；分離脊髓組織，10%甲醛固定48 h，分節(jié)段石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后采用光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)正常神經(jīng)元數(shù)目，觀察神經(jīng)元損傷情況。(3)炎性因子檢測(cè)：取部分分離的脊髓組織，研磨、離心處理，提取細(xì)胞成分，給予刺激后檢測(cè)IL-6、TNF-α表達(dá)水平。IL-6、TNF-α檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 造模情況 在再灌注48 h后進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示，對(duì)照組組織標(biāo)本鏡下可見損傷及壞死神經(jīng)元，表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮或溶解，細(xì)胞質(zhì)中的尼氏體消失；空白組組織標(biāo)本鏡下可見正常神經(jīng)元，表現(xiàn)為細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)中可見尼氏體；實(shí)驗(yàn)組組織標(biāo)本壞死神經(jīng)元的表現(xiàn)介于對(duì)照組與空白組之間，鏡下可見部分神經(jīng)元的細(xì)胞核固縮或溶解，但結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰，部分細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中可見尼氏體。見圖1、2。

圖1 各研究組大鼠脊髓組織HE染色結(jié)果(400×)

圖2 各研究組大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞HE染色結(jié)果(5 000×)

2.2 神經(jīng)行為評(píng)分 實(shí)驗(yàn)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)Tarlov評(píng)分均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠各時(shí)間點(diǎn)Tarlov評(píng)分均低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Tarlov評(píng)分比較(分，

2.3 炎性因子表達(dá)水平 再灌注48 h后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組IL-6、TNF-α表達(dá)水平均高于空白組，且實(shí)驗(yàn)組IL-6、TNF-α表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠再灌注48 h后IL-6和TNF-α表達(dá)水平比較

3 討 論

脊髓缺血再灌注損傷是脊柱外科手術(shù)常見的創(chuàng)傷之一，其損傷機(jī)制尚未完全明確[10]。普遍認(rèn)為脊髓缺血再灌注損傷機(jī)制涉及炎性因子與趨化因子表達(dá)水平的變化，細(xì)胞內(nèi)外離子水平的變化，脊髓局部脂質(zhì)過(guò)氧化和自由基的產(chǎn)生等[11-12]。

本研究采用外源性CORM2作為CO供應(yīng)源，具有以下優(yōu)勢(shì)。(1)外源性CORM2在溶解于二甲基亞砜后，其羰基被取代并釋放CO，且CO釋放時(shí)間可以持續(xù)24 h以上[13-14]。采用外源性CORM2作為CO供應(yīng)源可確保在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)均有足量的CO供應(yīng)。(2)粉末狀外源性CORM2制劑更易于實(shí)現(xiàn)量化控制，更加精確。(3)采用液體制劑靜脈注射的方式釋放CO，比CO吸入給藥具有更高的安全性和可操作性，臨床價(jià)值也更加顯著。此外，與CO吸入給藥相比，靜脈注射外源性CORM2可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期小劑量給藥，不僅避免了使用呼吸機(jī)，方便了動(dòng)物模型的構(gòu)建，也不會(huì)損傷肝臟、腎臟，避免對(duì)研究結(jié)果造成影響[15]。

本研究以動(dòng)物模型為基礎(chǔ)，分析了外源性CORM2釋放的CO在大鼠脊髓缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用。CO可以通過(guò)環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。CO進(jìn)入細(xì)胞后，與細(xì)胞內(nèi)可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的血紅素基團(tuán)中的Fe結(jié)合，通過(guò)調(diào)節(jié)離子通道產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)。此外，CO可通過(guò)一氧化氮合成酶(NOS)-cGMP途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，同時(shí)降低誘導(dǎo)型NOS(iNOS)和HO-1表達(dá)水平，抑制iNOS和HO的破壞作用，間接保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，在不同再灌注時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠Tarlov評(píng)分均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠在不同再灌注時(shí)間點(diǎn)的Tarlov評(píng)分均低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；此外，組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，在缺血再灌注48 h后，對(duì)照組大鼠脊髓神經(jīng)元損傷及壞死較為明顯，空白組大鼠幾乎不發(fā)生神經(jīng)元損傷，而實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)元損傷表現(xiàn)介于對(duì)照組和空白組之間。

在缺血再灌注過(guò)程中，NOS-cGMP途徑發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，包括抑制細(xì)胞內(nèi)NF-κB的表達(dá)，降低ICAM-1等黏附因子的表達(dá)，減少炎性因子IL-6、TNF-α的釋放，以及促進(jìn)過(guò)氧化物的清除，從而減低氧自由基水平等。外界刺激信號(hào)可作用于細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并最終將信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，從而促進(jìn)IL-6、TNF-α等炎性因子的產(chǎn)生和釋放[16]。抑制炎性因子的產(chǎn)生，可降低組織內(nèi)多形核中性粒細(xì)胞的活化水平和聚集能力，避免組織結(jié)構(gòu)和功能損傷，實(shí)現(xiàn)組織保護(hù)作用。本研究中IL-6和TNF-α檢測(cè)結(jié)果顯示，在缺血再灌注48 h后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組IL-6、TNF-α水平均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但實(shí)驗(yàn)組IL-6、TNF-α水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明外源性CORM2可抑制IL-6、TNF-α的表達(dá)。雖然在缺血及再灌注后應(yīng)用外源性CORM2對(duì)組織具有一定的保護(hù)作用，但組織損傷已經(jīng)產(chǎn)生，因此CO的保護(hù)作用有所減弱。

綜上所述，外源性CORM2可抑制炎性因子的表達(dá)，因此對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

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Protective effects of exogenous carbon monoxide releasing molecules 2 in rat with spinal cord ischemia and reperfusion injury*

LIUZhi-gang,XIONGMin△,YUHua-long,ZENGYun

(InstituteofOrthopaedics,AffiliatedDongfengHospitalofHubeiMedicalCollege,Shiyan,Hubei442000,China)

Objective To investigate the protective effects of exogenous carbon monoxide releasing molecules 2 (CROM2) in rat with spinal cord ischemia and reperfusion injury.Methods A total of 30 healthy male Wistar rats were divided into experiment group,control group and blank group,with 10 rats in each group.Rats of experiment group were given exogenous CORM2 by intravenous injection 1 h before modeling.Same operation was performed in experiment group and control group to construct rat models.Rats in control group were injected the same dose of saline 1 h after the construction of models.Rat in blank group were given only abdominal operation without any other treatment,and were injected the same dose of saline 1 h after operation.At different time point of operation,evaluation of Tarlov scale,histopathology examination of myeloid tissue,and detection of interleukin-6(IL-6) and tumor necrosis factor-α(TNF-α) were performed.Results At different time point of reperfusion,Tarlov scores of experiment group were higher than control group,but those of the two groups were lower than blank group (P<0.05).At 48 h after ischemia-reperfusion,damage of neuron in control group was obvious,which was not found in blank group,and the characteristics of neuron damage in experiment group were between control group and blank group.At 48 h after ischemia-reperfusion,levels of IL-6 and TNF-α in experiment group and control group were significantly higher than blank group,while those in experiment group were significantly lower than control group (P<0.05).Conclusion Exogenous CORM2 could be with protective effects of spinal cord ischemia-reperfusion injury,which might be dependent on the inhibition of the releasing of inflammatory cytokines.

exogenous carbon monoxide releasing molecules 2; spinal cord ischemia-reperfusion injury; interleukin-6; tumor necrosis factor-α

湖北省十堰市科技局基金支持項(xiàng)目[十科發(fā)(2013)20號(hào)]。

劉志剛，男，副主任醫(yī)師/講師，碩士，主要從事骨科疾病相關(guān)研究?！?/p>

，E-mail：xiongm4203@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.009

A

1672-9455(2015)08-1048-03

2014-11-05

2014-12-10)