茶樹(shù)萜烯類香氣物質(zhì)合成相關(guān)酶研究進(jìn)展

張冬桃，孫君，葉乃興*，陳桂信

茶樹(shù)萜烯類香氣物質(zhì)合成相關(guān)酶研究進(jìn)展

張冬桃1，孫君2，葉乃興1*，陳桂信1

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015）

萜烯類化合物與茶葉香氣品質(zhì)密切相關(guān)，茶葉中橙花醇、芳樟醇、橙花叔醇、α-法尼醇、α-紫羅蘭酮、茶螺烯酮、石竹烯、古巴烯、柏木醇等萜烯類香氣物質(zhì)通過(guò)MVA途徑（甲羥戊酸途徑）和MEP途徑（2-C-甲基-D-蘚糖醇-4-磷酸途徑）合成，調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜，在很大程度上影響茶葉的品質(zhì)。本文綜述了茶葉萜烯類香氣物質(zhì)合成途徑中相關(guān)酶的研究進(jìn)展，探討該代謝途徑未來(lái)的重點(diǎn)研究方向。

茶葉香氣；萜烯類化合物；代謝途徑；酶

茶葉香氣是評(píng)價(jià)茶葉品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一，也是吸引消費(fèi)者和提高市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的重要因子。隨著國(guó)內(nèi)外茶葉市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)愈演愈烈，對(duì)茶葉品質(zhì)要求愈來(lái)愈高，茶葉香氣的研究日益受到關(guān)注。近年來(lái)，隨著香氣揮發(fā)物提取和檢測(cè)技術(shù)以及分子生物學(xué)、生物化學(xué)、生物信息學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，多種技術(shù)相結(jié)合使得香氣物質(zhì)代謝研究漸漸深入，與茶葉香氣物質(zhì)合成密切相關(guān)的萜烯類化合物代謝的研究取得了較大進(jìn)展，基本明確了萜烯類化合物的主要代謝途徑、中間產(chǎn)物、關(guān)鍵酶及其基因，許多關(guān)鍵代謝酶基因序列已經(jīng)得到克隆和分析[1]，為今后深入研究茶葉香氣形成機(jī)理奠定基礎(chǔ)。至今，關(guān)于茶葉中萜烯類化合物合成途徑中相關(guān)酶基因的綜述報(bào)道較少，本文對(duì)茶葉萜烯類化合物合成途徑及該途徑中相關(guān)酶基因的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，對(duì)深入研究茶葉香氣形成分子機(jī)制，特別是研究萜烯類化合物代謝分子機(jī)制提供一定參考。

1 茶葉香氣物質(zhì)研究現(xiàn)狀

目前，已通過(guò)各種現(xiàn)代分析儀器從茶葉中鑒定出700多種香氣成分，包含醇類、醛類、酮類、酯類、酚類、含氮化合物以及氧雜化合物等10余大類。茶葉香氣物質(zhì)按化學(xué)結(jié)構(gòu)劃分，可分為萜烯類及其衍生物、脂肪族類及其衍生物，芳香族衍生物，含氮、氧等雜環(huán)類及其他化合物[2]。

茶葉香氣成分?jǐn)?shù)百種，但決定茶葉香氣的特征成分較固定，保護(hù)好這些特征成分可提高茶葉的香氣品質(zhì)[3]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)影響茶葉香氣的因素進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)品種、栽培措施、環(huán)境條件、加工工藝、貯藏條件等因素都對(duì)茶葉香氣產(chǎn)生影響，特別是茶葉香氣前體物質(zhì)含量、香氣物質(zhì)間的轉(zhuǎn)化及組成比例和相關(guān)代謝酶活性變化情況[4]。

1.1 茶葉香氣合成途徑

茶葉香氣在很大程度上由芳樟醇、香葉醇、橙花醇、香草醇等單萜烯醇類化合物和苯甲醇、苯乙醇、水楊酸甲酯等芳香族化合物以及青葉醇等不飽和脂肪族化合物決定。茶葉香氣形成途徑主要有以下4條[5]：（1）兒茶素氧化作用及類胡蘿卜素氧化降解作用，兒茶素偶聯(lián)氧化形成鄰醌，鄰醌氧化氨基酸、醇、醛、類胡蘿卜素等形成多種香氣成分以及類胡蘿卜素氧化降解形成茶螺烯酮、紫羅蘭酮系等香氣物質(zhì)；（2）脂肪酸過(guò)氧化及降解作用，脂肪酸過(guò)氧化降解生成青葉醇、己烯醛等不飽和脂肪族醇、醛類化合物；（3）氨基酸的脫氨脫羧和美拉德反應(yīng)，氨基酸脫氨脫羧后形成相應(yīng)醛，以及與糖類等發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成具有焦糖香氣的物質(zhì)；（4）糖苷水解途徑，糖苷類香氣前驅(qū)體在糖苷類酶的作用下水解生成相應(yīng)的醇類[6]。其中，醇類香氣的糖苷水解途徑備受關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)[7-8]香氣前體化合物在茶鮮葉中是以單糖苷或雙糖苷形式存在，其中25%香氣前體物質(zhì)以β-葡萄糖苷形式存在。

1.2 茶葉加工對(duì)茶葉香氣物質(zhì)形成的影響

茶葉香氣是茶葉加工過(guò)程中受到熱學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)作用，葉細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生復(fù)雜的生理生化反應(yīng)形成的。茶葉加工對(duì)于茶葉香氣的影響極其重要，不同茶類加工工藝不同，酶促氧化程度不同，香型特征不同，香氣化合物也不同。

綠茶加工工藝不同，形成清香、栗香、豆香、花香等不同香型特征。炒青綠茶殺青時(shí)間長(zhǎng)，經(jīng)熱物理化學(xué)作用，萜烯類物質(zhì)種類增加含量提高，苯甲醇、香葉醇等高沸點(diǎn)香氣成分得以保留，多呈栗香或清香或豆香；蒸青綠茶殺青時(shí)間短，低沸點(diǎn)香氣成分含量較高，帶清香或花香[9]。烘青綠茶受熱作用比炒青綠茶小，清香顯，以二氫?？麅?nèi)酯，石竹烯，雪松烯，杜松烯等高沸點(diǎn)揮發(fā)性化合物為主[10]。

具甜香、糖香的紅茶品質(zhì)特征形成主要是揉捻和發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生酶促氧化作用。揉捻使糖苷酶與香氣前體物質(zhì)充分反應(yīng)，釋放萜烯醇類；而發(fā)酵使類胡蘿素由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)為游離態(tài)，不飽和脂肪酸在脂肪氧化酶作用下降解為小分子的醛、酮、酸等[11]。

悶黃是加工黃茶的關(guān)鍵工序，濕熱作用下多糖、蛋白質(zhì)水解形成單糖與氨基酸，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為香氣物質(zhì)[12]。陳香是黑茶特有的品質(zhì)風(fēng)格，曬青毛茶在渥堆過(guò)程由于濕熱作用，微生物代謝釋放胞外酶，發(fā)生酶促反應(yīng)和甲基化反應(yīng)，形成黑茶獨(dú)特的香氣[13]。萎凋是形成白茶品質(zhì)的關(guān)鍵工序，不飽和脂肪酸在酶的作用下降解為醇、醛、酮和酸類香氣化合物，己醛（蘋(píng)果香）、反-2-己烯醛（青葉香伴有果香）、順-3-己烯醇（青葉香）等香氣成分含量較高[14]。

具有花香的烏龍茶其香氣主要來(lái)源于加工過(guò)程中萜烯類和芳香醇類等配糖體的水解和脂肪酸、胡蘿卜素類的氧化降解，在曬青和做青過(guò)程中大量形成[15]。做青過(guò)程中，搖青使茶鮮葉破損，細(xì)胞組織機(jī)械損傷，內(nèi)部水分、氧氣、膜透性等條件改變，促進(jìn)多酚類的氧化，有利于酶活性的提高，令細(xì)胞液中的糖苷與糖苷水解酶充分接觸，加快糖苷態(tài)香氣前體物質(zhì)的釋放和水解，促進(jìn)倍半萜烯類、己烯酯類、順-茉莉酮、苯乙醛等香氣物質(zhì)的生成[16]，最終生成橙花叔醇、芳樟醇等具花果香的香氣物質(zhì)[17]。

2 茶樹(shù)萜烯類化合物研究現(xiàn)狀

自然界中萜類化合物超過(guò)30000種，不僅結(jié)構(gòu)具多樣性，且大多生理活性活躍[18]。它們不僅參與植物香氣的形成，而且在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)及其與環(huán)境的關(guān)系中起著重要的生態(tài)作用[19]。萜烯類化合物是甲戊二羥酸衍生的具有（C5H8）n通式的鏈狀或環(huán)狀的烯烴類衍生物，根據(jù)聚合程度分為單萜（n=2）、倍半萜（n=3）、二萜（n=4）、三萜（n=6）及多萜（n≥6）等，茶樹(shù)中主要萜烯類化合物見(jiàn)圖1。茶樹(shù)中萜烯類化合物，特別是揮發(fā)性單萜（C10H16）與倍半萜（C15H24），大多具有宜人的花果香氣[20]，例如，單萜中芳樟醇（鈴蘭香、木香）、香葉醇（玫瑰花香），以及倍半萜中的橙花叔醇（花木香、似玫瑰及蘋(píng)果香）等是茶葉的主要香氣成分[21]，很大程度上左右了茶葉香氣品質(zhì)。

近年來(lái)，有關(guān)萜烯類化合物代謝的研究取得了較大進(jìn)展，基本明確了整個(gè)代謝途徑過(guò)程。萜烯類物質(zhì)有著共同的前體物質(zhì)：異戊二烯基焦磷酸（Isopentenyl diphosphate，IPP）和3，3-二甲基烯丙基焦磷酸（Dimethylallyl pyrophosphale，DMAPP），其生物合成代謝途徑主要包括兩條（圖2），其中一條是存在于胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的甲羥戊酸途徑（mevaonate pathway，MVA），參與甾醇、倍半萜和三萜等次生代謝產(chǎn)物的生物合成；另一條是2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途徑（2-C-Methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway，MEP），主要參與單萜、二萜、類胡蘿卜素等的生物合成[22]。這兩個(gè)途徑中相關(guān)酶是合成香氣物質(zhì)的關(guān)鍵，其生理生化、分子生物學(xué)方面的研究對(duì)茶葉加工生產(chǎn)、遺傳育種、生物防治等方面具有重要實(shí)踐意義。

圖1 茶樹(shù)主要萜烯類化合物Fig.1 Major terpenes in Camellia sinensis

圖2 茶樹(shù)萜烯類化合物合成途徑Fig.2 Pathways associated with terpene synthesis in Camellia sinensis

3 茶樹(shù)萜烯類化合物代謝途徑中相關(guān)酶研究現(xiàn)狀

茶樹(shù)萜烯類化合物合成途徑中l(wèi)-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGR）是影響萜類代謝前體IPP及DMAPP的限速酶；單萜和倍半萜合成酶是揮發(fā)性萜類代謝途徑中的關(guān)鍵酶；糖基轉(zhuǎn)移酶與茶鮮葉中糖苷態(tài)香氣物質(zhì)的合成、積累有關(guān)；糖苷水解酶水解糖苷態(tài)香氣物質(zhì)，釋放香氣化合物，控制萜烯類化合物轉(zhuǎn)化形成揮發(fā)性萜類物質(zhì)[23]。

3.1 異構(gòu)酶類

DXR是MEP代謝途徑中的限速酶。DXR將5-磷酸脫氧木酮糖（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate，DXP）轉(zhuǎn)化為萜類合成的重要前體2-C-甲基-4-磷酸-4D-赤蘚糖醇，是MEP合成途徑中“碳流”分支點(diǎn)，是進(jìn)行有效調(diào)控的靶點(diǎn)，是MEP代謝途徑的關(guān)鍵步驟[24]。

異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（Isopentenyl diphosphate isomerase，IDI），催化IPP和DMAPP之間的同分異構(gòu)轉(zhuǎn)化，為產(chǎn)生法呢基焦磷酸和香葉基焦磷酸奠定物質(zhì)基礎(chǔ)[25]。IPP和DMAPP的縮合產(chǎn)物多次進(jìn)行聚合反應(yīng)，最終合成各種萜烯類化合物。劉敏等[26]研究發(fā)現(xiàn)，引入IDI提高了DMAPP的胞內(nèi)濃度，有效催化了異戊二烯和β-胡蘿卜素的生物合成，是下游代謝途徑的總閥門(mén)，影響萜類合成前體庫(kù)的代謝。

3.2 氧化還原酶類

HMGR是MVA代謝途徑中重要的關(guān)鍵酶，催化HMG-CoA形成甲羥戊酸，是MVA途徑中的限速酶，也是重要的調(diào)控位點(diǎn)[27]，對(duì)植物萜類物質(zhì)代謝有重要影響。但穩(wěn)定提高IPP和植物固醇的產(chǎn)量不能只靠基因的過(guò)量表達(dá)，還需要與該途徑中其他酶相互協(xié)調(diào)，才能有效提高終產(chǎn)物量。研究發(fā)現(xiàn)，泡囊叢枝菌根（Vesicalar-Arbuscular，VA菌根）共生可達(dá)到這一目的，它影響茶樹(shù)根系HMGR基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)相關(guān)激素代謝，影響茶樹(shù)根系的生長(zhǎng)[28]。

3.3 轉(zhuǎn)移酶類

乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶（Acetyl-CoA C-acetyltransferase，AACT），是MVA代謝途徑上的第一個(gè)關(guān)鍵酶，直接影響主要活性成分的合成，催化蛋白質(zhì)?；腿ヵ；?，使兩分子乙酰輔酶A縮合為乙酰乙酰輔酶A，是真核生物進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾最普遍的方式，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物活性及其基因表達(dá)，對(duì)茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用[29]。

3.4 水解酶類

茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育次級(jí)代謝產(chǎn)物，如單萜烯醇、芳香族醇和不飽和脂肪族醇等揮發(fā)性物質(zhì)大多以糖苷形式存在，且以櫻草糖苷和葡萄糖苷為主，加工過(guò)程中糖苷類香氣前體物質(zhì)被內(nèi)源糖苷酶水解，與糖苷合成、水解密切相關(guān)的酶類主要有β-櫻草糖苷酶、β-葡萄糖苷酶I（β-glucosidase I）、β-葡萄糖苷酶II（β-glucosidase II）等，釋放出的揮發(fā)性苷元是茶葉香氣的物質(zhì)基礎(chǔ)[30-31]。光照、溫濕度等條件引起糖苷類香氣前體物質(zhì)和糖苷酶活性差異，造成不同季節(jié)茶葉的香氣成分存在差異，春茶和秋茶花香濃郁，而夏暑茶花香低淡[32]。

在殺青葉中加入葡萄糖苷酶，能產(chǎn)生芳樟醇、香葉醇，使殺青葉散發(fā)宜人的香氣，而β-葡萄糖苷酶抑制劑（Hg及葡萄糖酸內(nèi)酯）可以抑制茶鮮葉中芳樟醇和香葉醇的生成[33-34]。在紅茶揉捻（切）、發(fā)酵期間添加外源酶，如β-糖苷酶、蛋白質(zhì)酶、纖維素酶等可促進(jìn)不溶性的大分子物質(zhì)分解，變“廢”為寶，高沸點(diǎn)香氣物質(zhì)增加，低沸點(diǎn)香氣物質(zhì)大幅度降低，明顯改善紅茶香氣[35-36]。目前對(duì)β-葡萄糖苷酶和β-櫻草糖苷酶的研究已從生理生化水平逐步向分子水平發(fā)展，已完成分離純化[33]、活性測(cè)定[37]、在加工過(guò)程中的變化[38]、不同種質(zhì)資源之間的差異[39]、基因克隆和生物信息學(xué)分析以及原核表達(dá)[40]等。

3.4.1 β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶，廣泛存在于自然界中，動(dòng)植物、微生物中[41]。Motoko等[42]首次證實(shí)了β-葡萄糖苷酶參與茶葉香氣的釋放，100 g茶鮮葉中含有20.8個(gè)活力單位的β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶將纖維素二糖和纖維素寡糖水解成葡萄糖，同時(shí)還可水解香葉醇、芳樟醇等單萜烯醇類芳香物質(zhì)[31,37]，以及對(duì)硝基苯β-D-半乳糖和β-D-木糖苷[43]。李葉云[44]推測(cè)茶樹(shù)中β-葡萄糖苷酶為單體酶，用電泳和快速蛋白液相色譜（Fast protein liquid chromatography，F(xiàn)PLC）測(cè)得酶分子量。茶鮮葉中β-葡萄糖苷酶最佳提取條件為添加與鮮葉等重的交聯(lián)聚維酮（PVPP）和 0.1 mol·L-1、pH=6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液以及2～2.5 mol·L-1的甘油[45]。

3.4.2 β-櫻草糖苷酶

櫻草糖苷酶是另一個(gè)參與茶樹(shù)糖苷態(tài)香氣前體釋放的重要糖苷水解酶，活性高于葡萄糖苷酶，茶樹(shù)體內(nèi)的β-櫻草糖苷酶是雙糖苷水解酶，水解β-櫻草糖苷鍵釋放出櫻草糖苷[46]。當(dāng)pH=5.0，T=50℃時(shí)β-櫻草糖苷酶活性最高，聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE法）測(cè)得其分子量為61kD，等電點(diǎn)pI=9.4[8]。茶樹(shù)經(jīng)茉莉酸甲酯處理，β-櫻草糖苷酶在葉片中的表達(dá)量增加3倍，極顯著高于未經(jīng)處理的空白對(duì)照[47]。

茶樹(shù)β-櫻草糖苷酶的功能、提取方法和酶活性測(cè)定方法等尚不穩(wěn)定，需進(jìn)一步進(jìn)行深入研究，為今后研究櫻草糖苷酶，研究茶葉萜烯類化合物香氣物質(zhì)、茶葉香氣分子機(jī)制等奠定基礎(chǔ)。

3.5 合成酶類

植物單萜物質(zhì)，主要在質(zhì)體中由前體物質(zhì)香葉基焦磷酸（Geranyl diphosphate，GPP）經(jīng)單萜合成酶催化生成；而植物倍半萜物質(zhì)，主要在細(xì)胞質(zhì)中由前體物質(zhì)法尼基焦磷酸（Famesyl diphosphate，F(xiàn)PP）經(jīng)倍半萜合成酶催化生成[48]。法呢基焦磷酸合酶（Farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PS）存在于很多植物中，異戊二烯基焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸在FPS的作用下生成FPP，系統(tǒng)進(jìn)化模式分析表明，親緣關(guān)系相近的物種，F(xiàn)PS酶具有保守氨基酸殘基，F(xiàn)PS酶基因可作為理想的分子標(biāo)記基因，用于植物分類、進(jìn)化的研究[49]。

茶樹(shù)萜烯類合成酶[50]中單萜合成酶主要有：月桂烯合成酶（Myrcene synthase）、芳樟醇合成酶（Linalool synthase，LIS）、反式β-羅勒烯合成酶（β-Ocimene synthase，β-OCS）、香葉烯合成酶（Myrcene synthase，MYS）、檸檬烯合成酶（Limonene synthase，LIM）、水芹烯合成酶（Phellandrene synthase，PHS）、香葉醇/香茅醇乙?；D(zhuǎn)移酶（Geraniol/Citronellol acetylase）等；倍半萜合成酶主要有：大根香葉烯合成酶（Germacrene D synthase，GES）、法尼烯合成酶（Farnesene synthase，F(xiàn)AS）；單萜/倍半萜合成酶主要有：橙花叔醇/芳樟醇合酶1（Nerolidol/Linalool synthase-1，NES/LIS-1）；倍半萜/二萜雙合成酶主要有：橙花叔醇/香葉基芳樟醇合成酶（Nerolidol/Geranyl linalool synthase，NES/GLS）。

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉生物技術(shù)與生物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到相關(guān)萜類合成酶部分序列，通過(guò)基因序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)一些基因序列與其它植物的萜類合成酶基因相似度很高，其中芳樟醇/橙花叔醇合成酶（Linalool/Nerolidol synthase，LIS/NES）基因全長(zhǎng)已被克隆登錄[51]，為深入研究茶樹(shù)單萜合成酶基因奠定基礎(chǔ)，以及從基因水平研究調(diào)控茶葉香氣釋放機(jī)理提供重要保障。

4 茶樹(shù)萜烯類化合物合成途徑相關(guān)酶基因的研究現(xiàn)狀

茶樹(shù)基因組大小約4.0 Gbp，是擬南芥基因組大小的近40倍，水稻的近7倍[52]。茶樹(shù)是多年生木本、常異交植物，部分為三倍體植株，給基因組測(cè)序帶來(lái)難題，目前茶樹(shù)全基因組測(cè)序尚未完成，但2014年葉曉倩等[53]完成了國(guó)內(nèi)首次茶樹(shù)葉綠體全基因組157085bp（GenBank:KF562708.1）的測(cè)序工作，為茶樹(shù)品種鑒定奠定良好基礎(chǔ)，雖研究起步較晚，但取得了顯著進(jìn)展。通過(guò)同源探針篩選獲得了許多茶樹(shù)基因，如脂氫過(guò)氧化物裂解酶基因（Hydroperoxide lyase，HPL）[54]、水楊酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶基因（Salicylic acid carboxyl methltransferase，SAMT）[55]、苯丙氨酸基因解氨酶基因（Phenylalanineammonialyase，PAL）[56]、咖啡因合成酶基因（Caffeine synthase，CS）[57]、查爾酮合成酶1基因（Chalcone synthase1，CHS1）、CHS2基因、CHS3基因[58]、脂氧合酶1基因（Lipoxygenase 1，LOX1）[59]、LOX2基因[60]、LOX3基因[61]、萜類代謝途徑上相關(guān)基因[23,62-64]等。而FPS（專利號(hào)：201210239772.1）、DXR（專利號(hào)：201210239518.1）、β-Glu（專利號(hào)：CN201310177923.X）、CsLIS/NES（專利號(hào)：201310070031.X）等基因及其應(yīng)用均已被申請(qǐng)專利。

茶樹(shù)萜烯類化合物代謝途徑中相關(guān)基因的分子生物學(xué)研究，為茶葉香氣形成的分子機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。搜索互聯(lián)網(wǎng)GenBank、NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)以及論文文獻(xiàn)獲得整理部分茶樹(shù)萜烯類代謝途徑中相關(guān)基因的研究情況，見(jiàn)表1。

表1 茶樹(shù)萜烯類代謝途徑中相關(guān)基因的研究情況Table 1 Research on genes relating to terpene metabolic pathways in Camellia sinensis

4.1 異構(gòu)酶基因

2013年徐燕[62]克隆了DXR基因，進(jìn)行了分子生物學(xué)信息分析，并采用熒光定量法研究這些基因在不同茶樹(shù)品種、不同萎凋時(shí)間以及不同紫外線照射時(shí)間的表達(dá)差異，研究發(fā)現(xiàn)DXR基因的表達(dá)與茶葉的失水脅迫具有顯著相關(guān)性，不同品種之間、不同萎凋時(shí)間DXR基因的表達(dá)差異明顯，而紫外線照射的影響較弱。

項(xiàng)威[63]根據(jù)課題組前期獲得的茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果獲得IDI基因部分序列片段，有待進(jìn)一步克隆研究，進(jìn)行前體飼喂研究發(fā)現(xiàn) IDI基因的表達(dá)量不受前體乙酰輔酶A的刺激影響，具體原因有待進(jìn)一步研究分析。

4.2 氧化還原酶基因

徐燕[62]克隆了HMGR基因家族中I類的茶樹(shù)HMGR基因，研究得到其分子式為C2804H4484N762O853S31，蛋白分子量約63.5kD，等電點(diǎn)（pI）為6.51。采用SSH技術(shù)分析VA菌根處理對(duì)福鼎大白茶根系的影響，獲得HMGR基因全長(zhǎng)序列，發(fā)現(xiàn)生物性和非生物性脅迫對(duì)HMGR基因表達(dá)有很大影響[28]。而茶樹(shù)HMGR1和HMGR2的蛋白均為疏水性蛋白，分別與擬南芥、煙草和番茄遺傳距離相近[72]。2015年韓興杰等[73]通過(guò)同源克隆技術(shù)克隆登錄了HMGR1基因的全長(zhǎng)cDNA，命名為 CsHMGR1，分析發(fā)現(xiàn)其N-端序列差異較大，而催化活性區(qū)域的C-端相當(dāng)保守，共含1個(gè)磷酸化位點(diǎn)、2個(gè)跨膜區(qū)、HMG-CoA 結(jié)合位點(diǎn)和NADPH結(jié)合位點(diǎn)、4個(gè)保守的催化活性殘基。

4.3 轉(zhuǎn)移酶基因

Wei Xiang等[74]克隆了茶樹(shù)AACT 基因全長(zhǎng)序列，編碼408個(gè)氨基酸，與油柿中的AACT蛋白質(zhì)序列同源性高達(dá)94%，分析預(yù)測(cè)定位不在細(xì)胞質(zhì)或質(zhì)體中，而在其他亞細(xì)胞空間。而愈傷組織轉(zhuǎn)化試驗(yàn)因轉(zhuǎn)化效率低等問(wèn)題僅獲得了少數(shù)轉(zhuǎn)基因愈傷組織，對(duì)愈傷組織和葉圓片分別飼喂前體藥物，基因在愈傷組織中的表達(dá)量明顯比葉圓片的高，轉(zhuǎn)錄水平受到代謝底物的正調(diào)控。

4.4 水解酶基因

趙麗萍等[75]利用EST計(jì)劃（植物基因組表達(dá)序列標(biāo)簽）得到了1680個(gè)基因片段，制備了全世界首張茶樹(shù)cDNA芯片，成功檢測(cè)到了2個(gè)茶葉香氣基因：β-葡萄糖苷酶基因以及β-櫻草糖苷酶基因。李遠(yuǎn)華[76]研究茶樹(shù)β-葡萄糖苷酶基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析、原核表達(dá)、該酶基因mRNA的表達(dá)和定位研究，發(fā)現(xiàn)其集中分布在細(xì)胞核內(nèi)，部分定位于葉片表皮，柵欄、海綿組織中[77]，成功構(gòu)建的β-葡萄糖苷酶體外表達(dá)載體，顯示不同品種表達(dá)強(qiáng)度不同，不同季節(jié)表達(dá)信號(hào)強(qiáng)度為春梢＞秋梢＞夏梢[78]，為研究茶葉香氣形成機(jī)理與調(diào)控奠定基礎(chǔ)，特別對(duì)研究不同品種、不同季節(jié)對(duì)茶葉香氣的影響有重要意義。趙麗萍等[79]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)新梢不同葉位的β-葡萄糖苷酶基因和β-櫻草糖苷酶基因表達(dá)水平存在差異，β-葡萄糖苷酶基因表達(dá)水平為第四葉＞第三葉＞第五葉＞第二葉＞一芽一葉，葉片成熟度增加基因表達(dá)上調(diào)，第四葉達(dá)到頂峰，而β-櫻草糖苷酶基因表達(dá)水平則隨著葉片成熟度的增加表達(dá)逐漸降低。與陳亮等[80]的研究結(jié)果有所差異，但都表明了一定成熟度的茶鮮葉其糖苷酶活性較高，糖苷香氣前體物質(zhì)更易轉(zhuǎn)化為茶葉萜烯類香氣物質(zhì)，同時(shí)也為深入研究不同采摘標(biāo)準(zhǔn)影響茶葉香氣奠定了基礎(chǔ)。

2014年Ying Zhou等[81]首次在茶樹(shù)花中發(fā)現(xiàn)并分離4個(gè)苯乙醇共軛糖苷：（R）-苯乙醇-吡喃型櫻草糖苷（(R)-1PE-Pri）、(S)-1PE-Pri和?-苯乙醇-吡喃型葡萄糖苷（(R)-1PE-Glu）、(S)-1PE-Glu，研究發(fā)現(xiàn)苯乙醇櫻草糖苷的濃度在茶花生長(zhǎng)的每一階段都低于苯乙醇葡萄糖苷，但在大腸桿菌中重組的β-櫻草糖苷酶蛋白其水解作用高于天然的，苯乙醇共軛糖苷酶難以從茶樹(shù)花中水解釋放苯乙醇。而Hiromichi Saino[82]確定了晶體結(jié)構(gòu)的櫻草糖苷配合體，確定了3個(gè)活性部位subsites-1，subsites-2，和subsites-3，揭示活性部位的構(gòu)架是底物專一特異性的原因，發(fā)現(xiàn)subsites-1和2主要接受氫鍵，而subsites-3接受各種芳香苷配基，但櫻草糖苷酶不能識(shí)別色氨酸糖苷配基，是特殊的二糖脒抑制劑。

4.5 合成酶基因

賀志榮[51]利用課題組前期獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆并登錄茶樹(shù)芳樟醇/橙花叔醇合成酶CsLIS/NES基因的全長(zhǎng)，進(jìn)行生物信息學(xué)分析、原核表達(dá)、煙草轉(zhuǎn)化、亞細(xì)胞定位等研究，離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該基因具催化生成芳樟醇和橙花叔醇雙功能，在茶樹(shù)上卻主要催化生成芳樟醇，難以檢測(cè)到（E）-橙花叔醇，是催化產(chǎn)生芳樟醇的關(guān)鍵基因，并且茶樹(shù)嫩葉表達(dá)量高于老葉，豐度變化與茶樹(shù)中游離態(tài)和糖苷態(tài)芳樟醇的一致，對(duì)茶葉香氣品質(zhì)有直接的影響，為以后深入研究茶樹(shù)單萜、倍半萜合成酶基因，為進(jìn)一步研究催化生成橙花叔醇的酶基因提供借鑒。

徐燕[62]以福鼎大白茶作為實(shí)驗(yàn)材料，獲得了茶樹(shù)萜類代謝途徑上FPS這3個(gè)關(guān)鍵酶基因的全長(zhǎng)，還獲得了牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因

（Geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPS）、5-磷酸脫氧木酮糖合成酶基因（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS）和LIS基因的3'端序列，發(fā)現(xiàn)在不同品種、不同萎凋時(shí)間各個(gè)基因的表達(dá)強(qiáng)度不同，與茶樹(shù)品種抗性、茶葉品質(zhì)、萜類物質(zhì)的積累轉(zhuǎn)化是否存在關(guān)聯(lián)有待進(jìn)一步深入研究。

項(xiàng)威[63,74]克隆了茶樹(shù)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase，HMGS）、4-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸合酶（4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate synthase，HDS）基因和法呢基焦磷酸合酶基因（Farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PPS）的全長(zhǎng)序列，推測(cè)其蛋白產(chǎn)物分別有464、741、341個(gè)氨基酸單位組成，與其他植物最高同源性分別為86%、100%和90%。分析預(yù)測(cè)分別定位在分泌系統(tǒng)或其他亞細(xì)胞空間、質(zhì)體或其他亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中、在除葉綠體、線粒體外的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和分泌途徑中。對(duì)獲得的少數(shù)愈傷組織和葉圓片分別飼喂前體藥物，發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因的表達(dá)在不同程度上受到代謝底物的調(diào)控，其原因有待進(jìn)一步研究。

5 展望

近年來(lái)，茶樹(shù)基因的分離、克隆、表達(dá)等分子生物學(xué)研究已取得顯著進(jìn)展，但與草本植物、園藝植物相比還有很大差距，數(shù)量較少，研究的廣度和深度都不夠，利用分子生物學(xué)對(duì)茶樹(shù)育種、生產(chǎn)、加工等實(shí)際應(yīng)用尚在起步實(shí)驗(yàn)階段，科研成果未能轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。

茶葉萜烯類代謝途徑與茶葉香氣形成密切相關(guān)，研究萜烯類代謝途徑中的相關(guān)酶基因具有重要意義。近年來(lái)，對(duì)于萜烯類代謝途徑相關(guān)酶基因在不同茶樹(shù)品種、不同成熟度葉片、組織（葉片、嫩梢、根系）、不同季節(jié)以及紫外照射時(shí)間處理等時(shí)空表達(dá)特性進(jìn)行了分析研究，并在細(xì)胞組織機(jī)械損傷、高溫、低溫、凍害、寒害、病蟲(chóng)害等脅迫條件下進(jìn)行定量表達(dá)研究，探究基因?qū)γ{迫因子的響應(yīng)規(guī)律；另外，結(jié)合酶活力大小與萜烯類物質(zhì)積累情況進(jìn)行分析，探究基因時(shí)空表達(dá)與脅迫因子、萜烯類香氣物質(zhì)積累的關(guān)系，為探明茶葉香氣形成分子機(jī)理，為改善茶園管理、茶葉加工等理論技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

探明茶葉香氣形成機(jī)理，對(duì)于茶樹(shù)品種創(chuàng)新、抗性育種、高香茶產(chǎn)品的研制都具有重要理論意義及應(yīng)用價(jià)值。未來(lái)可進(jìn)一步補(bǔ)充、完善香氣物質(zhì)代謝合成途徑相關(guān)基因，特別是關(guān)鍵酶基因的分離、克隆、生物信息學(xué)分析、時(shí)空表達(dá)，構(gòu)建表達(dá)載體、原核表達(dá)、分離克隆啟動(dòng)子、亞細(xì)胞定位、過(guò)量表達(dá)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、煙草轉(zhuǎn)化或茶樹(shù)植株轉(zhuǎn)化等獲得轉(zhuǎn)基因植株，如高香型、高氨基酸、低咖啡介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化到茶樹(shù)效率低下的瓶頸。這些將為茶樹(shù)遺傳育種、茶葉加工、改善茶葉香氣品質(zhì)等提供廣闊的發(fā)展空間和應(yīng)用前景。

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Research Progress of Enzymes Associated with Terpene Synthesis in Camellia sinensis

ZHANG Dong-tao1，SUN Jun2，YE Nai-xing1*，CHEN Gui-xin1
（1. College of Horticulture，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science at Universities in Fujian，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China; 2. Tea Research Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)u’an，F(xiàn)ujian 355015，China）

Terpenes are closely related to the tea aroma. The aromatic substances, such as nerol, linalool, nerolidol, α-farnesol, α-ionone, theaspirone, caryophyllene, copaene, cedrol, etc. are synthesized through the mevaonate and 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathways in the plant. The complex regulating mechanisms of the process greatly impact the tea quality. This paper reviews the current research and development on the related enzymes, which are responsible for the synthesis of the aromatic terpenes in the tea plants in the pathways. A discussion focusing on future directions for studies is also presented.

tea aroma; terpenes; metabolic pathway; enzyme

S571.1

A

2015-04-07 初稿；2015-06-09 修改稿

福建省農(nóng)業(yè)高校產(chǎn)學(xué)合作科技重大項(xiàng)目（2013N5009）；福建省“2011協(xié)同創(chuàng)新中心”中國(guó)烏龍茶產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心（培育）專項(xiàng)（2013-51）。

張冬桃（1990-），女，碩士研究生，主要從事茶樹(shù)種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用研究。

*通訊作者：葉乃興（1963-），男，教授，研究生導(dǎo)師，主要從事茶樹(shù)栽培育種與資源利用研究 Email：ynxtea@126.com