葡聚糖微球在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用

張　健，李明生，靳冬武，張　磊，馬忠仁,3，馮玉萍*

(1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 甘肅蘭州730030; 2.西北民族大學(xué) 生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室, 甘肅蘭州730030; 3.甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心, 甘肅蘭州730030)

葡聚糖微球在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用

張健1,2，李明生2,3，靳冬武1，張磊1，馬忠仁1,2,3，馮玉萍1,2*

(1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 甘肅蘭州730030; 2.西北民族大學(xué) 生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室, 甘肅蘭州730030; 3.甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心, 甘肅蘭州730030)

[摘要]葡聚糖微球自開發(fā)以來，已廣泛地應(yīng)用于組織工程、細(xì)胞培養(yǎng)、蛋白分離純化等方面.其既可以作為藥物的控釋載體，又可以作為種子細(xì)胞擴增培養(yǎng)的載體.目前，在生物制藥領(lǐng)域下游分離純化技術(shù)越來越受到關(guān)注的背景下，作為柱層析凝膠和分離層析介質(zhì)的葡聚糖微球也越來越受到科學(xué)家的青睞.文章對葡聚糖微球自研究以來的重大歷史性突破及當(dāng)代科學(xué)前沿的應(yīng)用成果加以總結(jié)和介紹，著重介紹了葡聚糖微球在醫(yī)藥、疫苗開發(fā)、凝膠層析三個方面的應(yīng)用現(xiàn)狀.

[關(guān)鍵詞]葡聚糖微球；藥物控釋；細(xì)胞培養(yǎng)；分離純化

葡聚糖是以葡萄糖為基本組成單位的多糖.根據(jù)D-葡萄糖殘基結(jié)合方式的不同而分為多種，在自然界的動植物及微生物中均廣泛分布.其中代表性的有細(xì)菌的多縮葡萄糖、褐藻類的海帶多糖(laminarin)、地衣類的木聚糖(xylan)、高等植物的纖維素(cellulose)、直鏈淀粉(amylose)、支鏈淀粉(amylopoectin)、動物的糖原(glycogen)等.葡聚糖分子量相對較高，肉眼可見白色粉末狀，在水中具有較強的右旋特性.其結(jié)構(gòu)多為D-葡萄吡喃糖以α，1→6鍵連接，極少可見1→2、1→3、1→4鍵的連接，可作為血漿的替代品.葡聚糖無毒性且具有良好的生物黏附性、生物相容性、生物降解性和膠凝特性，因此是良好的微球制備原料，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，對其開發(fā)研究具有重要的理論與實際意義.

葡聚糖微球是以葡聚糖為原料，經(jīng)適當(dāng)?shù)墓に嚶肪€制成.在細(xì)胞培養(yǎng)方面,自Van Wezel[1]將DEAE-Sephadex A 50第一次作為細(xì)胞培養(yǎng)用微載體應(yīng)用于貼壁細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)以來，國際市場上研發(fā)、出售的微載體種類已多達十幾種.目前常用的商品化微載體大致有三種:CytodexTM，Cytopore和Cytoline[2].CytodexTM是以葡聚糖為原料制備的適合細(xì)胞生長的微載體，并已廣泛應(yīng)用于動物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)等細(xì)胞工程領(lǐng)域.在蛋白質(zhì)分離純化方面，以葡聚糖微球為基礎(chǔ)，已經(jīng)開發(fā)出適合柱層析Sephadex系列的交聯(lián)葡聚糖凝膠及DEAE-Sephadex A、QAE-Sephadex A等分離層析介質(zhì).在醫(yī)用方面,自20世紀(jì)40年代，由Pillemer[3]博士首次發(fā)現(xiàn)并報道酵母細(xì)胞壁有一種物質(zhì)具有提高免疫力的作用.經(jīng)過Diluzio博士進一步研究并從面包酵母中分離出β-葡聚糖開始，人們對其研究不斷深入.目前,葡聚糖已廣泛地應(yīng)用于藥物控釋載體、人工肝細(xì)胞研發(fā)和組織修復(fù)等方面.

1葡聚糖微球的制備及改性方法

葡聚糖是一類天然非動物原性的高分子聚合物，以聚合物微源料的微球常常將其制成O/W、W/O等乳液后，采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM行固化.常用的方法包括乳化交聯(lián)、反省懸浮聚合、包埋、噴霧干燥、微流動聚焦等.而葡聚糖多采用前三種方法，進行微球的制備.

1.1　反相懸浮聚合法

該方法是制備葡聚糖多孔微球的一種常用方法.首先,將葡聚糖單體分子溶解于水或堿液中，然后勻速加入到含有乳化劑的均勻有機油相中，攪拌一段時間，使葡聚糖分子快速均勻地分散，隨后加入交聯(lián)劑.在堿性條件下，葡聚糖分子上的糖羥基可與交聯(lián)劑中的某些官能團發(fā)生反應(yīng)，從而形成網(wǎng)狀交聯(lián)產(chǎn)物，在分散劑的作用下聚合成凝膠多孔結(jié)構(gòu)，最終形成葡聚糖多孔微球.分散劑的作用主要是更好地降低水相與油相分子之間的表面張力，防止乳滴之間的聚合作用，使水相分子在油相中更好地均勻分散[4].包建民[5]等通過反相懸浮聚合的原理制備了葡聚糖凝膠微球，將所制葡聚糖微球通過脂質(zhì)體與藥物分離實驗來測定其凝膠分離性能.結(jié)果表明,所制交聯(lián)葡聚糖凝膠微球具有良好的球形度、分散性以及吸水溶脹性，并具有優(yōu)良的凝膠過濾分離性能.

1.2　乳化交聯(lián)法

乳化交聯(lián)法是微球制備中常用的一種方法，主要是通過機械攪拌乳化的方式制備成O/W、W/O、O/W/W、W/O/W型乳液，再通過物理或化學(xué)方法進行交聯(lián)固化，從而得到微球.乳化交聯(lián)法合成葡聚糖微球是將用堿液溶解好的葡聚糖溶液勻速加入含有表面活性劑和分散介質(zhì)的溶液中，形成油包水微乳液體系.表面活性劑使得粒子均勻分散于反應(yīng)介質(zhì)體系中.當(dāng)加入交聯(lián)劑時，葡聚糖分子可與交聯(lián)劑發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，從而形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的微球.CytodexTM系列微載體就是采用此種方法制備，是目前細(xì)胞培養(yǎng)用微載體中的主流商品化的微載體，如圖1所示.

圖1Cytodex-1掃描電鏡圖圖2葡聚糖微載體細(xì)胞培養(yǎng)圖

1.3　包埋法

包埋法是制備磁性高分子微球最早的一類方法,它是將磁性粒子分散于高分子溶液中,通過霧化、絮凝、沉積、蒸發(fā)等手段制得磁性高分子微球[6].其磁性粒子(磁核)與外殼層的結(jié)合主要通過范德華力(包括氫鍵)、磁粒表面的金屬離子與高分子鏈的螯合作用以及磁性粒子表面功能基與高分子殼層功能基形成的共價鍵.天然高分子磁性微球均采用這種方法制備.目前，市場上應(yīng)用最廣的葡聚糖微球類的核磁共振成像對比劑Feridex I.V.TM (Advanced Magnetic, Cambridge, MA, USA)就是采用包埋法將核心為20 nm氧化鐵，外包60 nm葡聚糖的磁性顆粒，并已完成了前期的臨床試驗[7].

1.4　改性方法

盡管葡聚糖微球在諸多領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景，但是由于它表面的功能基團單一，無法滿足各領(lǐng)域的需求，因此人們紛紛對其表面進行改性，使葡聚糖微球表面含有不同的功能基團. 目前主要的改性方法包括共混改性、共聚改性、分子修飾改性等[8].葡聚糖由于其表面的多羥基機構(gòu)，使其具有羧化、醛化等多種化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)過不同功能基團的改性，可以適用于分離純化、離子交換層析、細(xì)胞培養(yǎng)、藥物控釋等多種領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景.目前市場銷售的改性后的葡聚糖微球主要是由美國GE公司銷售的Sephadex系列葡聚糖凝膠微球和Cytodex系列微載體.對于葡聚糖微球的改性主要方法為分子修飾改性方法.通常采用DEAE(2-二乙氨基氯乙烷鹽酸鹽)對葡聚糖微球上的羥基進行取代反應(yīng)，使之帶上正電荷.Van Wezel[1]在1967年就首次成功進行了DEAE與Sephadex A-50的改性實驗，從而使帶負(fù)電的葡聚糖微球改性成為適合細(xì)胞生長的正電荷微球，為細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ).

2葡聚糖微球在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

2.1　疫苗研發(fā)上的應(yīng)用

利用葡聚糖微球制備相應(yīng)的細(xì)胞載體技術(shù)已經(jīng)相對成熟，但是在國內(nèi)，大規(guī)模的應(yīng)用還是存在一定問題，限制了我國葡聚糖微球制備技術(shù)在疫苗產(chǎn)業(yè)中的發(fā)展.如何開發(fā)具有國內(nèi)自主知識產(chǎn)權(quán)及安全、可靠、穩(wěn)定的大規(guī)模生產(chǎn)工藝是目前的研究重點.

2.1.1細(xì)胞培養(yǎng)上的應(yīng)用

1962年，CaPstiok等[9]對BHK細(xì)胞的研究工作為現(xiàn)代動物細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ).隨著生物技術(shù)的不斷革新，如何進行細(xì)胞的高密度培養(yǎng)，成為了各國學(xué)者關(guān)注的焦點.1967年，Van Wezel[1]首次提出了“微載體”培養(yǎng)細(xì)胞的概念，并用DEAE-Sephadex A-50作為微載體，成功地進行了細(xì)胞的高密度培養(yǎng).經(jīng)過不斷的改進，目前國內(nèi)外除了傳統(tǒng)的纖維素、塑料、明膠、玻璃和葡聚糖幾大類微載體外,國外又相繼開發(fā)出多種高分子有機材料的微載體,如液體微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、藻酸鹽凝膠微載體等[10].國外一些大的疫苗企業(yè)早已經(jīng)廣泛地使用微載體技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞.由于國內(nèi)微載體研究較晚，至今無大規(guī)模商品化，限制了我國疫苗企業(yè)的發(fā)展.

葡聚糖微載體無毒性且具有良好的生物黏附性、生物相容性、生物降解性和膠凝特性，因此是良好的微載體制備原料.此外，葡聚糖微載體屬于非動物源性材料，與明膠微載體相比，在生物制藥領(lǐng)域具有更加廣泛的應(yīng)用前景，對其的開發(fā)研究具有重要的理論與實際意義.

2.1.2商品化及組織工程學(xué)上的應(yīng)用

葡聚糖微載體商品化最早出現(xiàn)于上世紀(jì)80年代，由Famarcia公司開發(fā)的Cytodex系列[11].目前，固體微載體被廣泛應(yīng)用,包括實心微載體和大孔微載體.Cytodex系列微載體屬于固體微載體中的實心微載體.此種微載體對細(xì)胞在微球表面吸附、鋪展和病毒感染細(xì)胞等方面有較好作用[12],有利于放大過程中球轉(zhuǎn)球的接種工藝的實施[13].其中Cytodex1、Cytodex2由于其表面的特殊小電荷分子，使其更適合細(xì)胞的吸附和生長[14]；Cytodex3的表面則覆蓋有一層膠原蛋白，使其與機體內(nèi)環(huán)境更加接近[14].Cytodex系列微載體的優(yōu)點是細(xì)胞在微載體上可長時間培養(yǎng)，并且其貼壁生長速度較一般微載體要快，但與大孔微載體相比，其比表面積和可獲得的細(xì)胞濃度相對較小,細(xì)胞在攪拌過程中易受流動剪切力等動力學(xué)因素破壞[14].

2.2　分離純化上的應(yīng)用

無論是天然產(chǎn)物還是通過生物技術(shù)手段制得的產(chǎn)品，對于目標(biāo)產(chǎn)物都要進行提取分離和純化.作為天然多糖類的葡聚糖是應(yīng)用最早、最廣泛的一種.它含有豐富的羥基，因此具有良好的親水性能，可進行多種多樣的化學(xué)反應(yīng).作為天然的植物性源料，葡聚糖與生物大分子具有很好的相容性，從而可以提高目標(biāo)產(chǎn)物的活性回收率.

2.2.1凝膠層析上的應(yīng)用

在凝膠過濾層析方面，應(yīng)用最廣的是交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex).首見于20世紀(jì)80年代中期，被作為一種優(yōu)良的固體吸附劑，廣泛用于色譜分離,固相吸附及分析等領(lǐng)域[15]；在生物化學(xué)中則廣泛用于蛋白質(zhì)、核酸、酶和多糖類高分子物質(zhì)的分離, 是生物大分子分離純化技術(shù)中不可缺少的一類介質(zhì)[15].交聯(lián)葡聚糖凝膠作為分子篩的介質(zhì)，根據(jù)目標(biāo)分離產(chǎn)物的直徑進行過篩，極少涉及表面吸附問題[15].目前,商品化的葡聚糖凝膠主要是GE公司銷售的Sephadex系列.根據(jù)交聯(lián)度的不同可以形成孔徑不同的G型凝膠系列.孔徑較小的凝膠適用于脫鹽或肽及其他小分子；孔徑大的則適用于蛋白質(zhì)和其他大分子的分離[17].對于分子量在100萬以上的生物分子，一般不采用此種凝膠分離.目前市場上還開發(fā)出了用于DNA或低聚核苷酸的Sephadex.

曾家豫[18]等利用G-25、G-50、G-75、G-100、G-125的Sephadex，對纖維素酶粗酶液進行分離.結(jié)果表明5種葡聚糖凝膠中G-75具有良好的分離效果，其回收率可以提高到41.6%，比活力可以提高到原來的4.9倍.張慧麗[19]等用Sephadex LH-20層析法對人參粗品進行兩次分離純化，再用Sephadex LH-20柱進一步純化，得到人參皂苷Re，收率58.6%，純度96.2%.該法簡化了傳統(tǒng)的分離方法對樣品的復(fù)雜處理，克服了層析柱中原介質(zhì)不能重復(fù)利用及再生繁瑣的弊端，具有省時、省力的優(yōu)點[20].

2.2.2離子交換層析上的應(yīng)用

在離子交換層析方面， G 類交聯(lián)葡聚糖凝膠上引入二乙氨基乙基可以制得弱堿性陰離子交換劑-二乙氨基乙基葡聚糖凝膠( DEAE- Sephadex A) .在 G 類交聯(lián)葡聚糖凝膠上引入二乙基-(2-羥丙基) 氨基乙基可以制得強堿性陰離子交換劑-季銨乙基交聯(lián)葡聚糖膠 A( QAE-Sephadex A)[16].如果引入羧甲基可制得弱酸性陽離子交換劑-羧甲基交聯(lián)葡聚糖凝膠，此類交換劑既具有離子交換的性質(zhì), 又具有 G 類葡聚糖凝膠的優(yōu)點[21].引入磺酸乙基、磺酸丙基可制得強酸性陽離子交換劑-SE-葡聚糖凝膠C-25、SP-葡聚糖凝膠C-25[16].在葡聚糖凝膠 G-25上引入羥丙基可制得既具有親水性, 又具親脂性的交聯(lián)葡聚糖凝膠LH-20[22].

杭長標(biāo)[23]等用DEAE-Sephadex A-50對門冬酰胺酶進行了分離純化，結(jié)果表明DEAE-Sephadex A-50與Sephadex G-150柱層析相比，一次純化的收率可以達到85%以上，純度在98%左右，可以很好地滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求，有效提高了層析收率、產(chǎn)品純度和合格率.

2.3　醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

目前，微球在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用主要包括靶向應(yīng)用、栓塞治療、緩控釋應(yīng)用等[24].葡聚糖因其具有較好的生物相容性和可降解性，所以在藥物控釋及栓塞治療方面具有其獨特優(yōu)勢，現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于生物技術(shù)和醫(yī)藥等很多領(lǐng)域[25].

2.3.1藥物控釋

經(jīng)過適當(dāng)?shù)墓に嚕梢詫⑵暇厶前谒幬锼闹苤瞥芍睆綖閹孜⒚椎綆装傥⒚椎奈⑿∏驙顚嶓w.此種方法的優(yōu)點在于：①掩蓋藥物的不良?xì)馕?從而提高患者用藥的順應(yīng)性.②載緩慢溶解釋放和定向植入，長時間穩(wěn)定地釋放藥物.③靶向作用，以維持局部藥物的濃度.④減少用藥量,延長了藥物作用時間,減少給藥次數(shù).⑤有效減少了不良反應(yīng)的發(fā)生.

綜上所述，將藥物制成微球劑型,既起到靶向的作用,又達到緩釋的目的，具有重要的臨床應(yīng)用價值.Sophie R.Van Tomme[26]等通過混合分散帶相反電荷的交聯(lián)葡聚糖微球制備了一種適用于藥物傳遞和組織工程應(yīng)用的凝膠.這種體系最重要的應(yīng)用是作為藥物活性蛋白的基體.J.A. Cadee[27]等采用皮下注射的方式，考察了葡聚糖微球進入大鼠體內(nèi)后，其粒徑、初始含水量和甲基丙烯酸酯取代度等對組織反應(yīng)的影響.通過 6 周觀察表明，非降解性和降解性的葡聚糖微球都表現(xiàn)出很好的耐性，在藥物傳輸系統(tǒng)中具有較大的潛在應(yīng)用價值.

2.3.2臨床上的應(yīng)用

臨床上，由于葡聚糖微球具有粒徑均一、狀態(tài)穩(wěn)定、表面無褶皺且不易破碎等特點,因此可以作為永久末梢性栓塞劑[28].目前，用于臨床研究和治療的葡聚糖栓塞劑是干燥的葡聚糖Sephadex G-50 微球用生理鹽水充分溶脹的葡聚糖微球懸液[29].張福成等采用下凝膠色譜法檢測溶脹性的方法，對葡聚糖栓塞微球的穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，高壓滅菌、室溫長期放置及在患者體內(nèi)，其溶脹體積均會保持一定的穩(wěn)定性，不會發(fā)生后續(xù)溶脹而損傷血管組織，從而保證了該制劑栓塞范圍的準(zhǔn)確性和使用的安全性[30].楊東強[31]等通過建立兔 VX2肝移植瘤動物模型，使用葡聚糖微球和碘化油栓塞劑對新西蘭大白兔進行介入栓塞治療，觀察兔子的生存時間、肝功能及 CT 灌注值變化，發(fā)現(xiàn)葡聚糖微球組平均生存時間比碘化油組有所延長，說明其介入治療效果上，葡聚糖微球組優(yōu)于碘化油組.兩個治療組相比，空白對照組的平均生存時間明顯延長，說明介入治療對腫瘤有明顯的治愈效果.

3結(jié)論

近年來，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，利用微載體進行動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)已經(jīng)成為了一種發(fā)展趨勢.微載體在國外已經(jīng)實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，一些大的疫苗企業(yè)已經(jīng)廣泛地使用生物反應(yīng)器進行動物細(xì)胞的微載體大規(guī)模培養(yǎng).在國內(nèi)，生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)技術(shù)主要采用進口微載體.因此開發(fā)國產(chǎn)化的微載體勢在必行.在分離純化方面，雖然以葡聚糖微球為基礎(chǔ)的層析介質(zhì)已經(jīng)開發(fā)出來，但是相應(yīng)的技術(shù)手段還不成熟，距離大規(guī)模的生產(chǎn)還有一定距離，亟需科研人員的努力探索.在醫(yī)藥方面，加速臨床類的葡聚糖微球的開發(fā)已成為科學(xué)家研究的重點，安全、可靠、穩(wěn)定的葡聚糖微球在臨床上越來越受到關(guān)注.葡聚糖是一類天然的高分子物質(zhì)，對人體無毒害作用，但是經(jīng)過化學(xué)方法后，其安全性還有待進一步的驗證.所以，在臨床應(yīng)用方面開發(fā)更穩(wěn)定、更高效、更安全的葡聚糖類微球，將是未來研究的重點.

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Dextran microspheres used in the biomedical field

ZHANG Jian1, 2, LI Ming-sheng2, 3, JIN Dong-wu1, ZANG Lei1,

MA Zhong-ren1, 2, 3, FENG Yu-ping1, 2*

(1. Life Science and Engineering College of Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030, China; 2. Key Laboratory of Bioengineering & Biotechnology of State Ethnic Affair Commission, Northwest University For Nationalities, Lanzhou 70030, China; 3. Engineering Technology Research Center for Animal Cell of Gansu Province, Lanzhou 730030, China)

[Abstract]Dextran microspheres has been widely used in tissue engineering, cell culture, protein separation and purification and others since it was developed. Dextran microspheres can be used as controlled release drug carriers and seed cells amplified carrier culture. Currently, the downstream separation and purification technology of biopharmaceuticalin became more and more attention, so as the column chromatography and gel chromatography separation medium of dextran microspheres have also been more and more scientists attention. This article summarized and introduced to the major historic breakthrough of dextran microspheres and the applications of the results of contemporary scientific frontier after its first development. The article also focused on the three aspects application status of dextran microspheres in medicine, vaccine development and gel chromatography. Finally, the paper summarized and predicted the applications of dextran microspheres in the biomedical field.

[Key words]Dextran; Ccontrolled drug delivery; Cell culture; Separation and purification

[作者簡介]張健(1988—),男,黑龍江哈爾濱人,碩士研究生,主要從事生物材料的開發(fā)與應(yīng)用方面的研究.

[通訊作者]*

[基金項目]西北民族大學(xué)研究生科研(實踐)創(chuàng)新項目資助(Yxm2014189);教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”項目(IRT13091);國家外專項目(GDW20146200235);蘭州市人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(2014-RC-50).

[收稿日期]2015-08-20

[中圖分類號]Q81

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]1009-2102(2015)03-0027-06