HPLC-ELSD 法對多烯磷脂酰膽堿膠囊含量和有關(guān)物質(zhì)檢測的研究

劉婉君，黃 芃，劉曉紅，徐 璐

(沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016)

HPLC-ELSD 法對多烯磷脂酰膽堿膠囊含量和有關(guān)物質(zhì)檢測的研究

劉婉君，黃 芃，劉曉紅，徐 璐*

(沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016)

目的建立多烯磷脂酰膽堿膠囊中多烯磷脂酰膽堿含量及其有關(guān)物質(zhì)溶血磷脂酰膽堿的限度檢查方法。方法采用正相色譜系統(tǒng)串聯(lián)蒸發(fā)光散射檢測器按照梯度洗脫程序?qū)Χ嘞┝字Ｄ憠A進行檢測。結(jié)果多烯磷脂酰膽堿在94～1128 μg·mL-1范圍內(nèi)回歸方程r2≥0.95；平均回收率為99%，RSD為1.7%；溶血磷脂酰膽堿在42～182 μg·mL-1范圍內(nèi)回歸方程r2≥0.95；多烯磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿的平均回收率分別為為 99.13%和 93.79%，RSD為 1.64%和1.42%；多烯磷脂酰膽堿及溶血磷脂酰膽堿的檢測限分別為19 μg·mL-1和21 μg·mL-1；定量限分別為94 μg·mL-1和42 μg·mL-1。儀器精密度RSD%≤2.0%。三批市售膠囊中主藥含量分別為97.2%、100.07%和96.9%，磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇及磷脂酸未檢出。結(jié)論 所建立的方法可準確地測定膠囊中多烯磷脂酰膽堿的含量并用于溶血磷脂酰膽堿的限度檢查。

藥劑學；HPLC-ELSD；多烯磷脂酰膽堿；含量測定

多烯磷脂酰膽堿是從大豆中分離提取的一種磷脂，具有使受損的肝功能和酶活力恢復正常、調(diào)節(jié)肝臟的能量平衡、促進肝組織再生、將中性脂肪和膽固醇轉(zhuǎn)化成容易代謝的形式、穩(wěn)定膽汁等生理功能[1-3]。當患肝臟疾病時肝臟的代謝活力受到嚴重損傷，而容易吸收利用的高能多烯磷脂酰膽堿在化學結(jié)構(gòu)上與重要的內(nèi)源性磷脂一致，它們主要進入肝細胞，并以完整的分子與肝細胞膜及細胞器膜相結(jié)合，另外，可分泌入膽汁，起到保肝護肝的作用。

由于多烯磷脂酰膽堿極性較大且紫外吸收為末端吸收，所以采用正相色譜連接蒸發(fā)光散射檢測器，以梯度洗脫的方式進行檢測分析[4-7]。本法中主藥和有關(guān)物質(zhì)的檢測靈敏度大大提高，系統(tǒng)適用性好，專屬性強，然而蒸發(fā)光散射檢測器檢測樣品時，樣品濃度跟峰面積不成線性，因此本文中以一元二次回歸方程計算含量。在本試驗條件下測定多烯磷脂酰膽堿膠囊的含量及其有關(guān)物質(zhì)的檢測限度，尤其是需要嚴格控制限度的雜質(zhì)溶血磷脂酰膽堿，可獲得滿意的結(jié)果[8-9]。

1 儀器與試藥

HITACHI 高效液相色譜儀；丙二醇鍵合硅膠色譜柱（Unitary Diol，4.6 mm×250 mm，5 μm，100A），Model 200es ELSD蒸發(fā)光散射檢測器；AR1140電子天平。

多烯磷脂酰膽堿（自制）；溶血磷脂酰膽堿（純度≥99%，Sigma-Aldrich）；磷脂酰乙醇胺（TLC純度≥98%，Sigma-Aldrich）；磷脂酰肌醇（TLC純度～50%，Sigma-Aldrich）；磷脂酸（純度≥ 99%，Sigma-Aldrich）；多烯磷脂酰膽堿膠囊（賽諾菲-安萬特）；正己烷、異丙醇（色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司化工分工公司）；三乙胺（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；冰醋酸（分析純，天津博迪化工股份有限公司）；重蒸水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：丙二醇鍵合硅膠色譜柱（Unitary Diol，4.6 mm×250 mm，5 μm，100A）；流動相：A)正己烷-異丙醇-冰醋酸-三乙胺（體積比為814:170:15:0.8），B)異丙醇-水-冰醋酸-三乙胺（體積比為844:140:15:0.8）；檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器，蒸發(fā)室溫度45oC；漂移管溫度50oC；柱溫：55oC；進樣量：20 μL。梯度洗脫的條件見表1。

Table 1 Gradient elution condition表1 梯度洗脫條件

試驗表明多烯磷脂酰膽堿主峰與溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸分離度良好（見圖1）。

2.2 多烯磷脂酰膽堿膠囊含量測定及其方法學研究

精密稱取多烯磷脂酰膽堿94.1 mg置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解稀釋至刻度，即得940 μg·mL-1多烯磷脂酰膽堿儲備液1；精密稱取溶血磷脂酰膽堿9.1 mg置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解稀釋至刻度，即得182 μg·mL-1溶血磷脂酰膽堿儲備液2；精密稱取磷脂酰乙醇胺24.25 mg置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解稀釋至刻度，即得485 μg·mL-1磷脂酰乙醇胺儲備液3；精密稱取磷脂酰肌醇29.35 mg置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解稀釋至刻度，即得587 μg·mL-1磷脂酰肌醇儲備液4；精密稱取磷脂酸34.05 mg置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解稀釋至刻度，即得681 μg·mL-1磷脂酸儲備液5。

2.2.1 專屬性

Fig. 1 Chromatogram of impurities (a.phosphatidic acid, b.phosphatidyl ethanolamine, c.polyene phosphatidyl choline, d.phosphatidylinositol, e. lyso-phosphatidylcholine)圖1 混合雜質(zhì)的色譜圖（a.磷脂酸b.磷脂酰乙醇胺c.多烯磷脂酰膽堿d.磷脂酰肌醇e.溶血磷脂酰膽堿）

Fig. 2 Chrom otograms of phosphatidic acid (a), phosphatidyl ethanolamine(b), polyene phosphatidyl choline(c), phosphatidylinositol (d), lyso-phosphatidylcholine (e)圖2 a. 磷脂酸 b. 磷脂酰乙醇胺 c. 多烯磷脂酰膽堿 d. 磷脂酰肌醇 e. 溶血磷脂酰膽堿的色譜圖

精密量取儲備液1～5各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖如圖2所示。取膠囊內(nèi)容物適量（2份），分別置于光照（4500 lx±500 lx）、高溫（60oC）烘箱內(nèi)放置一段時間后，以甲醇溶解。另取膠囊內(nèi)容物適量（3份），分別加入含1 mol·L-1HCl、NaOH、H2O2的甲醇適量，搖勻，調(diào)節(jié)pH至中性。對光照、高溫、酸、堿和氧化破壞樣品溶液分別進行色譜分析。結(jié)果顯示（圖 3），在上述條件下的強烈破壞后，所得色譜峰中多烯磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿仍有較好分離。

Fig. 3 Chromatograms of commercially available capsule (a), and the capsules destroyed by acid (b), alkali (c), oxidation (d), heat (e), and light (f)圖3 a. 市售膠囊 b. 酸破壞 c. 堿破壞 d. 氧化破壞 e. 熱破壞 f. 光照破壞的色譜圖

2.2.2 定量限與檢測限

分別精密量取儲備液1、2適量，進行稀釋，進樣至色譜圖中信號噪音比值（S/N）為10時即為定量限。S/N為3時即為檢測限。多烯磷脂酰膽堿的檢測限和定量限分別為19 μg·mL-1和94 μg·mL-1，溶血磷脂酰膽堿的定量限和檢測限分別為21 μg·mL-1和42 μg·mL-1。

2.2.3 精密度

2.2.3.1 進樣精密度

取多烯磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿標準曲線制備下的中間點，及儲備液3、4、5分別重復進樣6次，以峰面積進行精密度考察，測得多烯磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇以及磷脂酸的精密度RSD（%）分別為1.95%、1.86%、1.89%、1.89%和1.94%。結(jié)果表明，

各物質(zhì)的進樣精密度良好。

2.2.3.2 重現(xiàn)性

分別制備6份多烯磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿溶液，進各樣一次，以峰面積進行重現(xiàn)性考察，測得多烯磷脂酰膽堿的重現(xiàn)性RSD為1.88%，溶血磷脂酰膽堿的重現(xiàn)性RSD為1.97%。結(jié)果表明，該方法的重現(xiàn)性良好。

2.2.4 標準曲線

2.2.4.1 多烯磷脂酰膽堿標準曲線

分別精密量取0.5、2、3.5、5.0、6.0 mL儲備液1至10 mL容量瓶中，配制質(zhì)量濃度分別為94、376 、658 、940 、1128 μg·mL-1的系列溶液。分別取20 μL注入液相色譜儀，以峰面積對濃度進行一元二次回歸方程擬合，結(jié)果見圖4a。

2.2.4.2溶血磷脂酰膽堿標準曲線

分別精密量取儲備液2適量進行稀釋，配制濃度分別為42 、70 、112 、141 、182 μg·mL-1的系列溶液。分別取20 μL注入液相色譜儀，以峰面積對濃度進行一元二次回歸方程擬合，結(jié)果見圖4b。

Fig. 4 Sstandard curve of（a）polyene phosphatidyl choline and（b）lyso-phosphatidyl choline圖4 多烯磷脂酰膽堿及溶血磷脂酰膽堿標準曲線

2.2.5 回收率

2.2.5.1 多烯磷脂酰膽堿回收率

精密稱取多烯磷脂酰膽堿適量，加入空白輔料，甲醇溶解稀釋制成低、中、高3個濃度的供試品溶液。各個濃度樣品分別各進3針，按含量測定項下的測定方法測定供試品溶液中多烯磷脂酰膽堿的含量，并計算RSD%值，結(jié)果表明該法測定回收率良好。計算結(jié)果見表2。

Table 2 Recoveries of polyene phosphatidyl choline表2 多烯磷脂酰膽堿回收率結(jié)果

2.2.5.2 溶血磷脂酰膽堿回收率

將多烯磷脂酰膽堿膠囊供試品溶液注入液相色譜儀，測得其中所含溶血磷脂酰膽堿濃度，以此為本底。根據(jù)峰面積代入溶血磷脂酰膽堿標曲求得本底中溶血磷脂酰膽堿含量為1.29%。精密稱取溶血磷脂酰膽堿適量，加入至本底溶液中，制成低、中、高3個濃度的供試品溶液。各個濃度樣品分別各進3針，按含量測定項下的測定方法測定供試品溶液中溶血磷脂酰膽堿的含量，并計算RSD%值，結(jié)果表明該法測定回收率良好。計算結(jié)果見表3。

Table 3 Recoveries of lyso-phosphatidyl choline表3 溶血磷脂酰膽堿回收率結(jié)果

2.2.6 溶液穩(wěn)定性

將儲備液1放置于室溫條件下，分別在0 、2 、4 、6 、8 、12 h時間點進樣，計算各時間點多烯磷脂酰膽堿及溶血磷脂酰膽堿含量變化,結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，樣品在室溫條件下放置不穩(wěn)定，需臨用新制。

Table 4 Stability of the solutions表4 溶液穩(wěn)定性

2.3 多烯磷脂酰膽堿膠囊含量測定

取磷脂酰膽堿對照品及多烯磷脂酰膽堿膠囊3批，按限度檢查測定方法，用各峰面積帶入擬合的回歸方程計算各批膠囊中多烯磷脂酰膽堿的含量所占膠囊標示量的比值，結(jié)果3批（批號:3JD054、3JD069、3JD110）的限度檢查（標示量%）分別為97.2%、100.07%、96.9%。

2.4 多烯磷脂酰膽堿有關(guān)物質(zhì)限度檢查

2.4.1 溶血磷脂酰膽堿限度檢查

取溶血磷脂酰膽堿對照品及多烯磷脂酰膽堿膠囊3批，按限度檢查測定方法，用各峰面積帶入擬合的回歸方程計算各批膠囊中溶血磷脂酰膽堿的含量所占多烯磷脂酰膽堿膠囊標示量的比值，結(jié)果3批（批號:3JD054、3JD069、3JD110）的限度檢查（標示量%）分別為1.21%、1.26%、1.17%。

2.4.2 磷脂酰乙醇胺限度檢查

取磷脂酰乙醇胺對照品及多烯磷脂酰膽堿膠囊3批，按限度檢查測定方法，結(jié)果本品中磷脂酰乙醇胺未檢出。

2.4.3 磷脂酰肌醇限度檢查

取磷脂酰肌醇對照品及多烯磷脂酰膽堿膠囊3批，按限度檢查測定方法，結(jié)果本品中磷脂酰肌醇未檢出。

2.4.4 磷脂酸限度檢查

取磷脂酸對照品及多烯磷脂酰膽堿膠囊3批，按限度檢查測定方法，結(jié)果本品中磷脂酸未檢出。

3 討論

由于多烯磷脂酰膽堿紫外吸收波長為205 nm，末端吸收嚴重，易受輔料、溶劑等干擾，影響檢測，且其平均分子量為 800，故選擇靈敏度較高的蒸發(fā)光散射檢測器。蒸發(fā)光散射檢測器是通用型檢測器，可以檢測沒有紫外吸收的有機物質(zhì)。

使用蒸發(fā)光散射檢測器檢測樣品時，樣品濃度跟峰面積不成簡單線性，分別取自然對數(shù)后方成線性關(guān)系。本文中多烯磷脂酰膽堿取自然對數(shù)后得到的標準曲線回歸方程為 A=1.23c+2.73，相關(guān)系數(shù) r=0.999；溶血磷脂酰膽堿取自然對數(shù)后得到的標準曲線回歸方程為 A=1.13c+2.70，相關(guān)系數(shù)r=0.999。本文中采用一元二次回歸方程進行擬合，回歸方程相關(guān)系數(shù)滿足 r2≥0.95，可對多烯磷脂酰膽堿及溶血磷脂酰膽堿進行定量分析，計算準確且簡便。由于購買對照品純度不足，專屬性試驗單一雜質(zhì)溶液所得圖譜中出現(xiàn)多個色譜峰，根據(jù)磷脂酸、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇的相對保留時間依次為0.46、0.88和1.15，獲得各物質(zhì)峰保留時間和出峰位置。

本試驗通過不斷摸索調(diào)節(jié)，改變了流動相比例、檢測器溫度、柱溫等條件以獲得較高靈敏度、良好峰形和良好分離度。經(jīng)過方法學驗證試驗表明該方法系統(tǒng)適用性良好，專屬性強，精密度及重現(xiàn)性良好，且具有良好的準確度。

4 結(jié)論

采用HPLC-ELSD法可以對多烯磷脂酰膽堿膠囊進行含量測定和有關(guān)物質(zhì)檢查。方法準確可靠，靈敏度高，重現(xiàn)性好，操作簡便。

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Study on content and related substances of the polyene phosphatidyl choline capsules by HPLC-ELSD

LIU Wan-jun, HUANG Peng, LIU Xiao-hong, XU Lu*
(School of Pharmacy,Shenyang pharmaceutical university, Shenyang110016, China)

ObjectiveTo develop a method for the related substances detection and content determination of polyene phosphatidyl choline capsules.MethodsAn evaporative light-scattering detector combined with normal phase chromatographic system was applied in analysing polyene phosphatidyl choline under gradient elution condition.ResultsA good regression relationship was achieved for polyene phosphatidyl choline in the range of 94～1128 μg·mL-1, and for lyso-phosphatidyl choline in the range of 42～182 μg·mL-1.The average recoveries of polyene phosphatidyl choline and lyso-phosphatidyl choline were 99.13% and 93.79%, respectively. The detection limits of polyene phosphatidyl choline and lyso-phosphatidyl choline were 19 μg·mL-1and 21 μg·mL-1, respectively. Quantification limits of polyene phosphatidyl choline and lyso-phosphatidyl choline were 94 μg·mL-1and 42 μg·mL-1, respectively.ConclusionsThis method can be used in analyzing the related substances of polyene phosphatidyl choline qualitatively and quantitatively.

pharmaceutics; HPLC-ELSD; polyene phosphatidyl choline; content determination

R 94

; A

(本篇責任編輯：時碩坤)

（2015）01-0035-10

10.14146/j.cnki.cjp.2015.01.004

2014-04-16

劉婉君（1989-），女（漢族），河北保定人，碩士研究生，Tel.15040267327, E-mail lwj07106315@ aliyun.com；*

：徐璐（1974-），女（漢族），遼寧沈陽人，副教授，博士，碩士生導師，主要從事物理化學研究。Tel. 024-23986325，E-mail xulu1974@hotmail.com。;