環(huán)境中抗藥基因水平轉移研究進展

劉苗苗，楊敏，張昱，姚宏

1. 北京交通大學土木建筑工程學院市政環(huán)境工程系 水中典型污染物控制與水質保障北京市重點實驗室，北京 100044 2. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境水質學國家重點實驗室，北京 100085

環(huán)境中抗藥基因水平轉移研究進展

劉苗苗1，楊敏2,*，張昱2，姚宏1

1. 北京交通大學土木建筑工程學院市政環(huán)境工程系 水中典型污染物控制與水質保障北京市重點實驗室，北京 100044 2. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境水質學國家重點實驗室，北京 100085

抗藥基因是一種新型環(huán)境污染物，一旦被致病菌獲得，將導致抗生素的臨床使用失效，從而危害公共健康。抗藥基因可通過轉移因子在細菌間傳播，加劇抗藥基因的擴散效應，提升了環(huán)境健康風險性，因此抗藥基因水平轉移受到了越來越多的關注。本文介紹了抗藥基因水平轉移的分子機制，總結了不同環(huán)境中各種抗藥基因水平轉移途徑的研究現(xiàn)狀，并對該領域將來的研究方向提出了展望，以期為環(huán)境中抗藥基因的調(diào)查評估、污染控制及合理管理提供理論參考。

抗藥基因；水平轉移；質粒；整合子；噬菌體

自19世紀40年代青霉素首次被發(fā)現(xiàn)并成功使用以來，抗生素對疾病治療和人類健康起到了極大的促進作用[1]。但隨著抗生素的大量生產(chǎn)及使用，其在環(huán)境中的殘留水平逐漸升高，對細菌形成了選擇壓力，由此顯著促進了抗藥性的產(chǎn)生和傳播[2]。抗藥性一旦被致病菌獲得，會導致抗生素臨床治療失效，嚴重威脅人類健康。迄今為止，已在致病菌(如金黃葡萄球菌)中頻繁發(fā)現(xiàn)抗藥基因，并且許多細菌具有多重抗藥性，甚至進化成對已有抗生素均具有抗藥性的超級細菌[3]。據(jù)美國疾病控制研究中心統(tǒng)計，美國每年至少有2 000 000人受到抗藥菌感染，其中至少23 000人死于這些感染(http://www.cdc.gov/drugresistance/)。

細菌抗藥性通過抗藥基因來實現(xiàn)遺傳表達?？顾幓蚓幋a具有特殊功能的蛋白質，并通過修飾抗生素與核糖體的結合位點、泵出抗生素、或改變抗生素結構等途徑使抗生素失去抑菌作用。細菌主要通過3種方式獲得抗藥性：從環(huán)境或其他細菌中通過水平轉移因子(如質粒、整合子、基因盒、轉座子、病毒等)獲得抗藥基因；在抗生素及其他物質(如重金屬、殺蟲劑、納米材料等)的選擇作用下產(chǎn)生抗藥性；在遺傳過程中細菌自身發(fā)生基因突變[2]。其中抗生素及其他選擇壓力可以促進抗藥基因的水平轉移和基因突變，但其中基因突變的發(fā)生概率較低。在過去的70年當中，抗藥基因出現(xiàn)頻率大幅增加的主要原因是在殘留抗生素的選擇作用下，水平轉移促進了抗藥基因的傳播和增殖[2]。

水平轉移是指抗藥基因通過接合、轉化、轉導等途徑在細菌和細菌之間、環(huán)境和細菌之間、病毒和細菌之間傳播，最終導致更多細菌獲得抗藥性[4]。水平轉移使抗藥基因的傳播突破了生物遺傳的種屬保守限制，抗藥基因可在同種屬細菌之間轉移，也可以在親緣關系較遠的環(huán)境細菌和致病菌、或革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌之間傳播[3]。致病菌中的抗藥基因很可能來自環(huán)境細菌，臨床上發(fā)現(xiàn)的氨基糖苷類、萬古霉素類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類抗藥基因均和環(huán)境中的抗藥基因存在直接聯(lián)系[5]。常見致病菌中由質粒攜帶的β-內(nèi)酰胺類抗藥基因CTX-M 可以溯源到環(huán)境中的Kluyvera spp.菌屬(克魯沃菌屬，屬于腸桿菌科，γ-變形菌綱)[6]。在臨床上分離到的具有環(huán)丙沙星抗藥性的Klebsiella pneumonia (克雷伯氏肺炎球菌)中發(fā)現(xiàn)，其質粒上攜帶的喹諾酮類抗藥基因(qnr 基因)能追溯到幾種水生環(huán)境細菌[7-8]。致病菌水平轉移促進抗藥基因的擴散和增殖，提升了環(huán)境健康風險，因此環(huán)境中抗藥基因的水平轉移受到了科學家們的廣泛關注。

1 抗藥基因水平轉移的途徑、機制及相關基因元件

幾乎所有的功能基因都能進行水平轉移[9]。介導抗藥基因水平轉移的轉移因子主要包括質粒、整合子、轉座子和噬菌體?？顾幓蛩睫D移的途徑主要有3種，分別為接合、轉化和轉導(見圖1)[3]。其中，接合涉及到受體細菌和供體細菌之間的生理接觸，需要在細胞之間形成通道以供抗藥基因傳遞，抗藥基因能通過接合在不同界的生物之間進行遺傳物質傳遞，如細菌和植物之間，以及細菌和酵母菌之間，這種轉移方式主要通過可轉移的或可移動的質粒實現(xiàn)；轉化是指從環(huán)境中吸收游離的DNA，成為細菌自身的遺傳物質，這種轉移方式能夠在親緣關系較遠的微生物之間傳播；轉導是指噬菌體在自我復制的過程中將一個宿主的遺傳物質轉移到另一個宿主當中(普通轉導)，或將噬菌體吸附位點附近的DNA轉移到宿主當中(特異轉導)[4]。

圖1 抗藥基因的水平轉移機制[3]

1.1 整合子(integrons)

整合子通過基因盒(gene cassettes)的位點特異重組系統(tǒng)捕獲和轉移抗藥基因，同時提供啟動子以實現(xiàn)基因盒的表達，在抗藥基因水平轉移中起到非常重要的作用[10]。整合子的主要結構包括3個關鍵部分：整合酶基因(intI 基因)、特異重組位點(attI )、啟動子(Pc)。整合子通常存在2種重組類型：(1)在attI 位點和attC 位點之間，在attI 位點上插入基因盒；(2)在2個attC 位點之間，基因盒被剪切[11]?；蚝屑瓤梢允蔷€狀形式的整合子，也可以是共價閉合的環(huán)狀游離基因?；蚝型ǔ２粠в袉幼?，因此需要啟動子輔助其實現(xiàn)抗藥基因的表達[12]。

根據(jù)整合酶基因序列可將整合子分為5類(I型～V型)，常見的整合子主要是I～III型[10]。至今，已在整合子上發(fā)現(xiàn)了130余種抗藥基因，如編碼β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、甲氧芐氨嘧啶類、氯霉素類、喹諾酮類、利福平類、大環(huán)內(nèi)酯類等抗生素的抗藥基因。攜帶抗藥基因的整合子自身并不能轉移，但可以以其他轉移因子(如質粒和轉座子)為載體實現(xiàn)抗藥基因在細菌之間的傳播。其中I型整合子在臨床和環(huán)境細菌，尤其是革蘭氏陰性菌中分布最為廣泛。I型整合子通常和一些較大的轉座子相連，如Tn402等，促進了其在環(huán)境中的傳播，甚至環(huán)境細菌中I型整合子攜帶的基因盒多樣性高于臨床細菌[10]。II型整合子的檢出頻率僅次于I型整合子，但由于大多數(shù)II型整合子中含有一個終止子，使得II型整合子的基因盒組成較為穩(wěn)定，主要包括甲氧芐氨嘧啶類、氨基糖苷類、鏈絲菌素類抗藥基因。II型整合子通常與轉座子Tn7相連，因此加強了自身的傳播。目前，其他類型的整合子(III型～V型)在臨床細菌中檢出頻率較低，而在環(huán)境細菌中關于這些整合子的研究仍然較少。

值得一提的是，由于I型整合子具有如下特征：(1)與抗藥基因、抗重金屬基因、抗消毒劑基因相連；(2)在許多致病菌和非致病菌中均有檢出；(3)其宿主具有較短的世代時間，其豐度變化較快，且能通過水平轉移在細菌之間傳播；(4)在受人類活動影響的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)特異的I型整合子序列，因此，Gillings等[13]提出I型整合子可以作為人類活動污染的指示基因。

1.2 插入序列共同區(qū)域和復雜整合子(insertion sequence common region and complex integrons)

隨著自然環(huán)境中殘留抗生素增加，整合子發(fā)生了進化，因此有些整合子在基因盒區(qū)域以外增加了一些非基因盒抗性基因。這些非基因盒抗性基因通常與共同區(qū)域(CR , common region)相連，且位于I型整合子3’端保守區(qū)下游，由于共同區(qū)域含有正向插入序列(insertion sequence, IS)，因此也被稱為“插入序列共同區(qū)域”(insertion sequence common region, ISCR s)[14]。ISCR s作為一種新型轉移因子，由于其攜帶β-內(nèi)酰胺、碳青霉烯、氯霉素、甲氧芐啶和喹諾酮等多種抗生素抗藥基因而備受關注。根據(jù)保守區(qū)域結構對已發(fā)現(xiàn)的ISCR s進行分類，可分為20余類，其中1～3類ISCR s(ISCR 1～ISCR 3)上抗藥基因出現(xiàn)的頻率最高。除了自身攜帶抗藥基因外，ISCR s有一個重要特征，即能與普通整合子形成復雜整合子(complex integrons)，實現(xiàn)抗藥基因的傳播[14]。

1.3 轉座子(transponson)

轉座子(transposon)又稱跳躍基因(jumping gene)，是最早發(fā)現(xiàn)的可以水平移動的遺傳單元，廣泛存在于原核生物和真核生物中。Courvalin等[15]觀察到一株沒有質粒的臨床肺鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )具有多藥抗性，后來發(fā)現(xiàn)該多藥抗性是由其染色體上的可連接轉座子(Tn1545, 25.3 kb)引起的，該轉座子可轉移到多種革蘭氏陽性菌種，也可轉移到重組缺陷的大腸埃希氏菌(Escherichia coli HB101)及芽孢桿菌(Bacillus subtilis )的染色體上。轉座子轉移的第一步是剪切特定的遺傳分子(如抗藥基因)，形成不可復制的環(huán)形中間物；第二步是轉座子通過該環(huán)形中間物的特異位點插入實現(xiàn)遺傳因子(如抗藥基因)的水平轉移。轉座子宿主廣泛存在，能在革蘭氏陰性菌和陽性菌之間傳播。一個細菌細胞內(nèi)可同時存在多個轉座子，轉座子既可以存在于質粒上，也可以存在于染色體上，轉座子能攜帶多種抗藥基因，如四環(huán)素、紅霉素、氯霉素、卡那霉素抗藥基因。轉座子傳播抗藥基因主要有以下4種機制：(1)最常見的是轉座子內(nèi)部編碼的抗藥基因直接轉移；(2)通過編碼抗藥基因的質?；蚱渌D座子的轉移而傳播抗藥基因，如Tn916轉座子的剪切和轉移有利于同一細胞中其他可接合轉座子的轉移，而位于不可接合質粒上的可接合轉座子也使得該質粒具有轉移能力；(3)整合到更大的可連接轉座子中，如Tn5251可整合到更大的含有更多抗藥基因的Tn5252中；(4)允許供體和受體之間進行染色體上同源基因的重組[16]。

1.4 質粒(plasmids)

質粒(plasmids)是染色體外能夠進行自主復制的DNA分子。來自細菌細胞的質粒大多是雙鏈、共價閉合的環(huán)狀分子，以超螺旋形式存在，是細菌的輔助遺傳單位。質粒對宿主生存沒有決定性作用，但其存在賦予宿主細菌特殊功能。根據(jù)質粒攜帶的基因和功能不同，可分為抗性質粒、致育因子、降解質粒、侵入性質粒等?？剐再|?？赡軘y帶抗生素、重金屬等抗性基因，是抗藥基因轉移的最重要載體，前文所述的轉座子、插入序列共同區(qū)域、整合子等轉移元件都可以在質粒上進行組合，然后通過接合的方式實現(xiàn)轉移，因此，質粒介導的傳播是抗藥基因水平轉移的最主要機制[17-18]。質粒的接合轉移主要包括以下幾種類型：(1)自我傳送功能(self-transmissible)接合質粒的轉移，如F-質粒和大腸桿菌的RP4質粒。(2)可移動性(mobilizable)質粒的轉移。一個不具有自我傳送功能但具有一個起始接合轉移位點(oriT )的質粒能通過接合質粒進行轉移。如IncQ質粒RSF1010可以通過接合IncP1質粒(如RP4)進行轉移。(3)共合體(cointegration)的轉移。一個沒有自我傳送功能及移動功能的環(huán)狀質粒可以與另一個有自我傳送功能的環(huán)狀質粒合為一體，從而被轉移[19]。

1.5 噬菌體(bacteriophages)

噬菌體(bacteriophages)是生物圈中豐度最高的生物體，估計總數(shù)量范圍為1030～1032。噬菌體由DNA或RNA基因組及蛋白質外衣組成，可將自身的基因組注入宿主細胞，之后，這些噬菌體基因組在整合酶的作用下整合到宿主基因組中，或在宿主細胞內(nèi)復制，該過程稱為轉導。在轉導過程中，噬菌體作為載體實現(xiàn)不同宿主細菌之間的基因交換，從而可能傳播抗藥基因[20]。近年來年，關于環(huán)境中噬菌體介導的抗藥基因水平轉移受到越來越多的關注。

2 抗藥基因水平轉移的研究方法

2.1 細菌培養(yǎng)和傳統(tǒng)分子生物學技術

在新一代測序技術出現(xiàn)以前，人們主要通過細菌培養(yǎng)、PCR、定量PCR、克隆、基因轉移等實驗手段來研究抗藥基因的水平轉移。一方面，使用培養(yǎng)方法從環(huán)境中篩選抗藥菌，通過藥敏試驗確定該細菌的抗性譜，并通過DNA提取、PCR檢測測定細菌中的轉移因子及攜帶的抗藥基因，最后以這些抗藥菌作為供體細菌，以抗生素敏感的模式細菌(如大腸桿菌、假單胞菌等)作為受體細菌，在一定條件下共同培養(yǎng)，考察抗藥基因從供體菌向受體菌轉移的概率[21]。另一方面，也可將環(huán)境樣品的總基因組作為研究對象，使用PCR、定量PCR等手段定性和定量分析抗藥基因及轉移因子的存在情況和豐度水平，并通過系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析(克隆)、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析(如相關性分析)來探討抗藥基因的來源及轉移因子在抗藥基因傳播中的可能作用[5, 22]。

2.2 新一代測序技術

新一代測序技術克服了環(huán)境中大多數(shù)細菌不可培養(yǎng)的局限性，目前已普遍應用于抗藥基因及轉移因子的研究[23]。數(shù)以千計的宏基因組測序結果已上傳到一些公共平臺(如MG-RAST、IMG/M)中，這些測序結果可用于探索各種環(huán)境中的抗藥基因組(resistome)和轉移基因組(mobilome)[24-25]。Balcazar等[20]通過MG-RAST平臺比較了海洋、土壤、淡水、人類糞便、污水處理系統(tǒng)等不同環(huán)境樣品的測序結果(共27個宏基因組)，發(fā)現(xiàn)上述環(huán)境中均含有很高水平的轉移因子，包括質粒、整合子、噬菌體，人類糞便、污水處理系統(tǒng)中的抗藥基因和轉移因子均高于其他自然環(huán)境。由于宏基因組測序不依賴于細菌培養(yǎng)，且能夠同時得到微生物群落組成和功能的信息，并且隨著測序方法的不斷更新，測序成本逐漸降低，公共數(shù)據(jù)庫和生物信息學分析手段日漸成熟和普及，該方法逐漸成為環(huán)境中抗藥基因研究的有力工具[26-27]。

3 環(huán)境中抗藥基因水平轉移的研究進展

3.1 環(huán)境中質粒介導的抗藥基因水平轉移

質粒是抗藥基因轉移的重要媒介，尤其是廣譜宿主質粒，能促進抗藥基因在不同種屬、不同門、甚至不同界之間傳播，因此，它在各種環(huán)境中的出現(xiàn)、分布、基因型、抗藥性表型受到了廣泛關注。Binh等[28]對豬糞中的質粒進行了系統(tǒng)研究，使用E. coli 共捕獲了15個豬糞樣品中的228個轉化接合子(通過接合方式獲得了其他細菌基因的受體細菌)，并通過基因組DNA的PCR和雜交等技術，在豬糞中發(fā)現(xiàn)81個質粒，包含了IncN、IncW、IncP-1、pHHV216等類型，并在這些質粒上檢測到阿莫西林、磺胺類抗藥基因。Bengtsson-Palme等[21]使用測序方法在印度某抗生素污染河流中檢測到26種已知質粒和21種新型質粒，表明抗生素污染導致環(huán)境中的抗藥基因具有很高的水平轉移潛力。Szczepanowski等[29]從城市污水廠的活性污泥和出水中分別篩選了140株和123株細菌，通過高通量測序發(fā)現(xiàn)細菌質粒上幾乎含有所有抗生素的抗藥基因。Zhang等[30]從城市污水活性污泥中直接提取總質粒DNA，發(fā)現(xiàn)其中含有大量抗藥基因、整合子和轉座子，表明質粒是污水處理系統(tǒng)中抗藥基因的重要傳播媒介。Parsley等[31]使用測序和功能宏基因組方法，在城市污水廠活性污泥的質粒基因組中發(fā)現(xiàn)了細菌抗藥基因，表明污水處理系統(tǒng)中抗藥基因可通過質粒(接合)進行轉移。在海洋的養(yǎng)殖區(qū)域、以及遠海(離岸邊522 km)、深海(深度達8 200 m)區(qū)域均發(fā)現(xiàn)抗藥性細菌，并在其中檢測到質粒攜帶的抗藥基因，且海洋細菌中的抗性質粒存在情況與其抗生素污染程度存在正相關[32]。Jechalke等[33-34]使用PCR、定量PCR等分子生物學手段，在經(jīng)過100年污水灌溉的土壤中發(fā)現(xiàn)了28個IncP-1ε質粒，且這些質粒全部攜帶I型整合子，表明污水灌溉導致土壤中的質粒、整合子、抗藥基因均顯著升高。

3.2 環(huán)境中整合子及異常插入序列介導的抗藥基因水平轉移

I型整合子作為最常見的整合子，在城市污水、醫(yī)療廢水、養(yǎng)殖廢棄物、土壤、地表水中均有報導(見表1)。I型整合子在革蘭氏陰性菌中分布尤其廣泛，在革蘭氏陰性人類病原菌、畜牧業(yè)病原菌和共生菌中的檢出率甚至高達40%～70%[11]。Agerso等[35]在豬糞和豬場土壤中分別篩選出了44和216株細菌，發(fā)現(xiàn)其中分別有25%和7%的細菌含有I型整合子，攜帶多種氨基糖苷類、甲氧芐啶類抗藥基因。Li等[36]結合篩菌和分子生物學方法，發(fā)現(xiàn)土霉素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)出水異養(yǎng)菌中I型整合子的檢出率高達94.2%，但未在其基因盒區(qū)域發(fā)現(xiàn)相應的四環(huán)素類抗藥基因。使用定量PCR方法調(diào)查發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素和螺旋霉素生產(chǎn)廢水中I型整合子的相對豐度高達10-1～100數(shù)量級，且與多種四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類抗藥基因呈顯著正相關[37-38]。Wang等[39]發(fā)現(xiàn)在豬糞灌溉的土壤中，I型整合子豐度為10-3數(shù)量級，并發(fā)現(xiàn)I型整合子和四環(huán)素類抗藥基因tet (G)、磺胺類抗藥基因sul (II)之間存在顯著正相關關系。Mokracka等[40]從波蘭某城市污水廠中篩選了1 832株腸細菌，發(fā)現(xiàn)其中207株(11.3%)含有I型整合子，14株(1.0%)含有II型整合子，并在其中發(fā)現(xiàn)了多種抗藥基因盒。I型整合子在自然水體中也很常見，Drudge等[41]綜合使用PCR和基因芯片等方法研究發(fā)現(xiàn)，某淡水水域中I型整合子中具有很高的多樣性，9種抗生素的抗藥基因均被檢出。

II型整合子的179位點含有編碼終止子的堿基序列，導致其合成的多肽不完整、無活性，因此，環(huán)境中II型整合子的檢出率和多樣性通常顯著低于I型整合子[10, 42]。Mokracka等[40]從城市污水廠篩選的腸細菌中發(fā)現(xiàn)14株(1.0%)細菌含有II型整合子，并在這些整合子上發(fā)現(xiàn)了氨基糖苷類、甲氧芐啶類、鏈絲菌素類等抗藥基因。Marathe等[43]在印度某抗生素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)II型整合子的檢出率高達80%，但未在其中發(fā)現(xiàn)抗藥基因盒。盡管目前II型整合子的檢出率較低，且攜帶的抗藥基因盒較少，但關于II型整合子在抗藥基因水平轉移中的作用仍需要更多的研究。

目前關于異常插入序列及復雜整合子也有一些報導。Wang等[44]從醫(yī)院環(huán)境篩選革蘭氏陰性菌，通過PCR檢測發(fā)現(xiàn)33.3%的細菌含有ISCR 1，并在其上發(fā)現(xiàn)了12種喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類抗藥基因。Kristiansson等[45]使用高通量測序的方法在抗生素生產(chǎn)廢水受納河流的排放口和下游檢出了ISCR 2。Xia等[46-47]發(fā)現(xiàn)從醫(yī)院廢水篩選的細菌中發(fā)現(xiàn)ISCR 1，該ISCR 1元件和I型整合子形成的復雜整合子攜帶多種喹諾酮類抗藥基因。

3.3 環(huán)境中噬菌體介導的抗藥基因水平轉移

通過噬菌體轉導的抗藥基因水平轉移可能也是一個重要途徑，環(huán)境中噬菌體介導的抗藥基因水平轉移受到越來越多的關注。噬菌體對環(huán)境中的細菌具有很高的適應性[49]，裂解性噬菌體存在于30%的可培養(yǎng)細菌中；基于非培養(yǎng)方法的估計表明，土壤細菌中4%～68%攜帶噬菌體。雖然目前發(fā)現(xiàn)轉導對致病基因島、病毒特征轉移的作用超過對抗藥基因轉移的作用，但Allen等[50]對使用抗生素的豬糞噬菌體基因組進行研究，發(fā)現(xiàn)抗生素的存在能對豬糞中的噬菌體產(chǎn)生選擇作用。Colomer-Lluch等[51]使用實時定量PCR方法，在城市污水和屠宰廢水的噬菌體基因組中均檢出β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、磺胺類、甲氧西林抗藥基因，在城市污水和河水的病毒基因組中發(fā)現(xiàn)了較高水平的β-內(nèi)酰胺類抗藥基因bla (TEM)和bla (CTX-M)及磺胺類抗藥基因sul1 (102～104copies·mL-1，與之相比，細菌DNA中的抗藥基因豐度為105～107copies·mL-1)，并通過轉移實驗驗證了這2種基因能使抗生素敏感的埃希氏大腸桿菌(E. coli )中產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺類抗藥性，證實了環(huán)境中抗藥基因通過噬菌體傳播的可能性[52]。此外，該作者在城市污水和動物養(yǎng)殖廢水的噬菌體DNA中檢出喹諾酮類抗藥基因qnr A和qnr S，豐度水平達到101～103copies·mL-1，并發(fā)現(xiàn)一些噬菌體誘導因子(如EDTA、檸檬酸鈉)導致噬菌體基因組中喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類抗藥基因豐度升高[53]。Marti等[54]使用qPCR方法定量研究發(fā)現(xiàn)，醫(yī)院廢水和城市污水處理系統(tǒng)出水的病毒基因組中含有較高水平的β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類抗藥基因，其中qnr S和blaSHV的豐度達到104copies·mL-1。

表1 環(huán)境中I型整合子和II型整合子攜帶的抗藥基因盒Table 1 Antibiotic resistance gene cassettes in Class 1 and Class 2 integron from environment

4 抗藥基因水平轉移的影響因素

首先，抗藥基因水平轉移受供體細菌和受體細菌濃度的影響。由于接合轉移需要細胞和細胞之間接觸形成鞭毛或膜孔通道，因此細菌濃度高可能有利于接合轉移的發(fā)生。Guo等[55]從城市污水廠篩選含有抗藥性質粒的大腸埃希氏菌(E. coli )作為供體細菌，使用不具有抗藥性的E. coli NK5449作為受體細菌，發(fā)現(xiàn)細菌濃度低于104CFU·mL-1時，接合轉移受到明顯抑制(幾乎不發(fā)生接合轉移)，而高于105CFU·mL-1時，不受細菌濃度影響，表明可能存在接合轉移的細菌濃度閾值。

其次，環(huán)境中的營養(yǎng)元素，如碳源、氮、磷等也對抗藥基因水平轉移產(chǎn)生顯著影響。Guo等[55]發(fā)現(xiàn)添加葡萄糖、α-乳糖能將城市污水中抗藥基因的水平轉移頻率提高1～4個數(shù)量級，而添加氮和磷也能顯著提高接合轉化子的數(shù)量。

此外，環(huán)境中的抗生素、重金屬選擇壓力可能促進抗藥基因的水平轉移。Zhu等[56]使用高通量定量PCR芯片(high-capacity quantitative PCR arrays)比較了飼喂抗生素和不飼喂抗生素的豬糞處理處置過程中的抗藥基因和轉移因子，發(fā)現(xiàn)土霉素和銅均促進了抗藥基因和轉移因子水平的升高，且抗生素和重金屬同時存在會形成更強的促進作用。醫(yī)療廢水、制藥廢水等環(huán)境中抗生素濃度高，對生物處理的功能主體-細菌形成較強的選擇作用，為抗藥基因的水平轉移創(chuàng)造了有利條件。城市污水中雖然抗生素濃度較養(yǎng)殖廢水、醫(yī)療廢水、制藥廢水低，但其中抗生素種類繁多，其生物處理過程也是抗藥基因水平轉移發(fā)生的重要環(huán)境。

為了充分利用水資源，常采用三級處理如消毒、膜處理等方法對生物處理出水進行進一步凈化，以獲得再生水，飲用水通常也會使用氯、臭氧、紫外等消毒方法。消毒過程對抗藥基因水平轉移的影響受到越來越多的關注。Shi等[57]使用宏基因組測序方法研究了實際飲用水處理過程中的抗藥基因，發(fā)現(xiàn)氯消毒不僅富集了抗藥基因，同時也富集了質粒、插入序列、整合子等轉移因子。Guo等[55]通過批量試驗比較了紫外消毒和氯消毒對城市污水中抗藥基因水平轉移的影響，發(fā)現(xiàn)在較低的消毒劑使用劑量下，紫外消毒對接合轉移沒有顯著影響，氯消毒使得接合轉移頻率升高2～5倍，而當消毒劑量升高到一定范圍，紫外和氯消毒均能有效抑制抗藥基因的水平轉移。氯消毒在較低劑量下可能促進抗藥基因水平轉移，一方面是由于氯消毒劑提高細胞膜通透性，另一方面則是由于抗氯基因可能和抗藥基因共存于質粒等轉移元件上，因此氯消毒劑會在選擇抗氯基因的同時對抗藥基因產(chǎn)生共選擇作用。

5 展望

抗藥菌和抗藥基因的在環(huán)境中的分布和傳播是國際上環(huán)境學科、微生物學科、公共衛(wèi)生領域關注的重點問題，盡管過去幾十年國內(nèi)外很多研究人員致力于探索抗藥基因的傳播規(guī)律，但至今為止抗藥基因在環(huán)境中的傳播風險和控制技術仍存在很多困難。許多研究表明，生物處理過程中的高生物量可能促進抗藥基因的擴散，而水處理中常用的消毒方法對抗藥基因的控制效果尚不明確，在某些條件下甚至可能起到促進作用[55]，給抗藥基因的控制帶來阻礙。關于抗藥基因的行為及影響機制還需要深入研究，隨著新一代測序技術日漸成熟，綜合使用傳統(tǒng)培養(yǎng)法、分子生物學方法、宏基因組測序等方法對環(huán)境中抗藥基因的傳播途徑進行深入研究，將為抗生素的合理使用及抗藥基因的有效控制提供參考。

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Horizontal Transfer of Antibiotic Resistance Genes in Environment: A Review

Liu Miaomiao1, Yang Min2,*, Zhang Yu2, Yao Hong1

1. Department of Municipal and Environmental Engineering, Beijing Jiaotong University, Beijing 100044, China 2. State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

Received 1 June 2015 accepted 24 August 2015

Antibiotic resistance genes are a major emerging environmental pollutant of concern as they reduce the efficacy of antibiotic medical treatment and consequently threaten public health. Horizontal gene transfer of such genes between bacteria greatly accelerates the spread of antibiotic resistance, intensifying the public health risk. Thus, the mobility of antibiotic resistance genes has drawn increasing attention worldwide. This review introduces the molecular mechanisms of the horizontal transfer of antibiotic resistance genes. It is summarized that the variation of these mechanisms amongst different environments. Based on this current progress, future research directions are proposed. Overall, this review aims to provide insight for the future survey and control of antibiotic resistance genes in the environment.

antibiotic resistance genes; horizontal transfer; plasmids; integrons; bacteriophage

國家自然科學基金青年基金(51408032)；環(huán)境模擬與污染控制國家重點聯(lián)合實驗室(中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心)專項經(jīng)費(14K01ESPCR)

劉苗苗(1986-)，女，博士，講師，研究方向為環(huán)境微生物，E-mail: lmmhit@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: yangmin@mails.rcees.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20150601001

2015-06-01錄用日期：2015-08-24

1673-5897(2015)5-011-09

X171.5

A

楊敏(1964-)，男，研究員，博士生導師。主要研究方向為工業(yè)廢水、城市污水、飲用水處理技術及其中的微生物作用機制。

劉苗苗，楊敏，張昱, 等. 環(huán)境中抗藥基因水平轉移研究進展[J]. 生態(tài)毒理學報，2015, 10(5): 11-19

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